沙土鼠脑缺血和再灌流期间羟自由基的变化及氯胺酮对其影响
作者：沈霞 许鹏程
单位：221002徐州医学院附属医院神经内科
关键词：沙土鼠；脑缺血；羟自由基；氯胺酮
临床神经病学杂志000202 【摘要】 目的 研究脑缺血和再灌流期间的羟自由基变化及氯胺酮对其影响。方法 制作沙土鼠前脑缺血再灌流模型，脑缺血10分钟,再灌流60分钟。分为假手术组、缺血组、缺血再灌流组和氯胺酮组。应用高效液相色谱测定纹状体和海马羟自由基(OH·)、三磷酸腺苷(ATP)和多巴胺(DA)含量。结果 海马二羟基苯甲酸(2,3-DHBA)含量缺血组和缺血再灌流组均明显高于假手术组(P<0.01)；缺血再灌流组2,3-DHBA的含量明显高于缺血组(P<0.05)；脑缺血和再灌流期间ATP和DA含量均显著降低(P<0.05)。氯胺酮可明显增加脑缺血和再灌流期间ATP和DA含量，减少再灌流期间的2,3-DHBA含量。结论 氯胺酮可能通过抑制脑缺血和再灌流期间DA的释放和促进ATP含量的恢复，而减少OH·的产生，这可能是其对脑缺血再灌流损伤起保护作用的机理之一。
, 百拇医药
The change of hydroxyl free radicals during cerebral ischemia and reperfusion in gerbils and the effect of ketamine on it
Shen Xia, Xu Pengcheng
Department of Neurology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002
【Abstract】 Objective To study the change of hydroxyl free radicals during cerebral ischemia and reperfusion and the effect of ketamine on it.Methods Animal model was made by cerebral ischemia for 10 min and reperfusion for 60 min in gerbils. Animals were divided into four groups: sham-operative group(SO), ischemic group(I), ischemia reperfusion group(IR) and ketamine treatment group. The striatum,hippocampus hydroxyl free radical(OH·),ATP content and DA were determined by high performance liquid chromatography(HPLC).Results Hippocampus 2,3-DHBA content in I group and IR group was higher than that in SO group(P<0.01);2,3-DHBA content in IR group was remarkable higher than I group(P<0.05). The contents of ATP and DA were significantly reduced during ischemia and reperfusion(P<0.05). Ketamine (KT) obviously increased the contents of ATP and DA, and reduced the content of 2,3-DHBA during reperfusion.Conclusion KT could reduce OH· generation by inhibiting the release of DA and promoted the recovery of ATP during cerebral ischemia and reperfusion, it might be an important mechanism which had protective effect to cerebral ischemia reperfusion damage.
, 百拇医药
【Key words】 Gerbil Cerebral ischemia Hydroxyl free radical Ketamine
近年来，研究认为羟自由基(OH·)的损害可能是造成脑梗死病理损害的化学环节之一。氯胺酮(KT)有一定的脑保护作用。但有关其清除自由基，抑制细胞膜过氧化、延缓生物膜破坏作用的研究尚少。为此，我们观察沙土鼠脑缺血再灌流期间OH·的变化以及KT清除OH·的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 沙土鼠32只,体重45～65 g，由徐州医学院动物饲养中心提供，随机分为假手术组，缺血组，缺血再灌流组以及氯胺酮组。每组动物数均为8只。
1.2 方法
, 百拇医药
1.2.1 动物模型制备 戊巴比妥钠45 mg/kg，腹腔注射，分离两侧颈总动脉，用无创动脉夹阻断脑血流10分钟，造成前脑缺血，为缺血组。松开动脉夹恢复脑血流60分钟即为缺血再灌流组。测定鼓膜温度反映脑温。实验期间维持动物脑温37.0±0.5℃。在动物处死前30分钟 腹腔注射水杨酸钠100 mg/kg以捕捉OH·。各组动物按实验组的时间要求断头处死，在0℃条件下迅速分离海马、纹状体。液氮冷冻，-75℃保存。海马用于测定OH·和ATP，纹状体用于测定多巴胺。
1.2.2 脑组织OH·的测定[1] 采用高效液相色谱与电化学检测器联用(HPLC-ECD)方法测定二羟基苯甲酸(2,3-DHBA和2,5-DHBA)的含量，反映脑内OH·的含量。海马组织称重后以1∶3(w/v)加入3% 高氯酸(HCLO4)，在冰浴下超声制匀浆，4℃，15 000 r/min离心15分钟。上清液25 μl进样测定OH·含量。色谱柱: ODS-C18；氧化电位:+0.75 mv。流动相：柠檬酸0.03 mol/L，醋酸钠0.03 mol/L，10%甲醇，pH 3.6，流速1 ml/min。
, 百拇医药
1.2.3 腺苷酸含量的测定[2] 海马称重，用冷0.4 mol/L HCLO4超声制成10%匀浆，1 5000 r/min，离心15分钟。上清液用3 mol/L K2CO3调至中性。3000 r/min 离心5分钟，取上清液10 μl进样HPLC系统，紫外检测器测量ATP、ADP和AMP含量。
1.2.4 DA含量的测定[3] 采用HPLC-ECD方法。脑组织称重，用冷0.1 mol/L HCLO4超声制成10%匀浆，15 000 r/min，离心15分钟。按文献[4]方法制备粗制突触体(P2部分)，上清液25 μl进样分析。色谱柱：ODS-C18；氧化电位：+0.75 mv。流动相：柠檬酸0.1 mol/ L，乙酸钠0.1 mol/L，流速：1 ml/min。
1.2.5 统计学处理 结果以均数±标准差(
±s)表示，各组间检测数据的比较采用t检验。
, http://www.100md.com
2 结 果
2.1 海马2,3-DHBA和2,5-DHBA含量 缺血组和缺血再灌流组比假手术组有明显增高(均P<0.01)。而缺血再灌流组2,3-DHBA的含量又高于缺血组(P<0.05)。氯胺酮组2,3-DHBA含量虽比缺血组有所降低，但无统计学意义(P>0.05)，比假手术组明显升高，比缺血再灌流组显著降低(P<0.05)，见表1。
表1 4组海马2,3 -DHBA和2,5-DHBA含量的变化(±s，mmol/L) 组 别
2,3-DHBA
2,5-DHBA
缺血组(n=8)
, http://www.100md.com 0.65±0.23**
1.20±0.14**
缺血再灌流组(n=8)
0.95±0.15**Δ
1.78±0.81**
氯胺酮组(n=8)
0.55±0.16*#
1.01±0.43
假手术组(n=8)
0.21±0.14
, 百拇医药
0.75±0.09
与假手术组相比*P<0.05，**P<0.01；与缺血组相比ΔP<0.05;与缺血再灌流组相比#P<0.05
2.2 海马ATP和腺苷池(ATP+ADP+AMP)含量 与假手术组相比，缺血组明显下降(P<0.05)。缺血再灌流组ATP及腺苷池含量有所减少，但无显著差异。再灌流60分钟时氯胺酮组ATP含量恢复为假手术组的89%，而缺血再灌流组仅为71%，明显低于氯胺酮组(P<0.05)。氯胺酮组腺苷池含量也高于缺血再灌流组(P<0.05)。 见表2。
表2 4组海马ATP和腺苷池含量的变化(±s，mmol/kg) 组 别
, 百拇医药
ATP
ADP
AMP
ATP+ADP+AMP
缺血组(n=8)
0.19±0.03*
0.43±0.18
1.08±0.17
1.70±0.40*
缺血再灌流组(n=8)
0.60±0.10
, http://www.100md.com 0.39±0.17
0.85±0.16
1.84±0.46
氯胺酮组(n=8)
0.79±0.15#
0.65±0.14
0.84±0.19
2.21±0.19#
假手术组(n=8)
0.94±0.29
0.74±0.30
, http://www.100md.com
1.12±0.32
2.80±0.30
与假手术组相比*P<0.05；与缺血再灌流组相比#P<0.05
2.3 纹状体DA含量 脑缺血10分钟， 缺血组为1961±464 μg/g，再灌流60分钟, 缺血再灌流组DA含量为3460±1444 μg/g，均明显低于假手术组(6639±719 μg/g)(P<0.01)。氯胺酮组DA含量为5292±1347 μg/g，明显高于缺血组和缺血再灌流组(P<0.01)。
3 讨 论
脑细胞富含不饱和脂肪酸和Fe2+，但抗氧化能力较弱，因而易遭受氧自由基的损害。在氧自由基中，以羟自由基(OH·)的生物活性最为活跃。它易使细胞膜脂质、蛋白质和核酸氧化而导致细胞功能障碍和死亡[5]。目前多以水杨酸捕捉、HPLC-ECD法来测定OH·的含量。OH·可与水杨酸反应生成2,3-DHBA和2,5-DHBA。因2,5-DHBA除来自与水杨酸反应外，还可由肝脏微粒体的混合功能氧化酶系统产生，故目前认为2,3-DHBA的含量能较好地反应体内OH·的含量[1]。实验发现，脑缺血和再灌流期间2,3-DHBA含量均显著增加，且两个时相之间2,3-DHBA的含量也有差别；KT可明显减少海马再灌流期间的2,3-DHBA含量。提示KT有减少脑缺血再灌流期间产生OH·的作用，这可能是KT减轻脑缺血/再灌流损伤的机理之一。
, http://www.100md.com
实验还显示鼠脑缺血和再灌流期间脑组织突触体中DA含量减少，其原因可能是DA释放增多所致[6]。大量释放的DA通过氧化脱氨基作用可产生大量
和H2O2，H2O2与Fe2+反应生成OH·。因此实验提示脑缺血再灌流期间大量释放的DA是OH·产生的来源之一；KT则可以增加脑组织DA含量，减少DA的释放，进而减少OH·的产生。
脑缺血期间，ATP含量及腺苷酸池明显降低。脑缺血后ATP的消耗和分解也可以促进自由基的产生。ATP、ADP、AMP的分解可产生大量的黄嘌呤、次黄嘌呤，这些都是产生氧自由基的重要原料。脑缺血缺氧又促使黄嘌呤脱氢酶变成黄嘌呤氧化酶，使黄嘌呤、次黄嘌呤氧化产生和H2O2，进一步生成大量的OH·[7]。KT促进脑缺血再灌注期间ATP含量的恢复，减少黄嘌呤和次黄嘌呤的氧化，有助于减少自由基的产生。
, 百拇医药
江苏省卫生厅自然科学基金资助课题(H9333)
参 考 文 献
1.Kil HY, Zhang J, Piantadosi C. Brain temperature alters hydroxyl radical production during cerebral ischemia/reperfusion in rats. J Cer Blood Metab, 1996,16:100
2.刘斯奇，聂洪勇，卢义钦. 反相高效液相色谱测定人体红细胞内腺嘌呤和吡啶核苷酸. 生物化学与生物物理， 1996，6：49
3.Takagi N, Tsuru H, Yamamura M，et al. Changes in striatal dopamine metabolism after microsphere embolism in rats. Stroke, 1995,20:1101
, 百拇医药
4.韩济生. 神经科学纲要. 北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社， 1993.31
5.Floyed RA, Carney JM. Free radical damage to protein and DNA: mechanisms involved and relevant observations on brain undergoing oxidative stress. Ann Neurol,1992,32:S22
6.Frolich L, Dirr A, Riederer P, et al. Effects of long-term recovery from transient cerebral ischemia in rat brain: tissue levels of acetylcholine, monoaminess and the I/R metabolites.Neurochem Res, 1993,18:1239
7.Ichord RN, Kirsch JR, Helfaer MA, et al. Age-related differences in recovery of blood flow and metabolism after cerebral ischemia in swine. Stroke, 1991,22:626
(收稿1999-11-01 修回1999-12-21), 百拇医药
单位：221002徐州医学院附属医院神经内科
关键词：沙土鼠；脑缺血；羟自由基；氯胺酮
临床神经病学杂志000202 【摘要】 目的 研究脑缺血和再灌流期间的羟自由基变化及氯胺酮对其影响。方法 制作沙土鼠前脑缺血再灌流模型，脑缺血10分钟,再灌流60分钟。分为假手术组、缺血组、缺血再灌流组和氯胺酮组。应用高效液相色谱测定纹状体和海马羟自由基(OH·)、三磷酸腺苷(ATP)和多巴胺(DA)含量。结果 海马二羟基苯甲酸(2,3-DHBA)含量缺血组和缺血再灌流组均明显高于假手术组(P<0.01)；缺血再灌流组2,3-DHBA的含量明显高于缺血组(P<0.05)；脑缺血和再灌流期间ATP和DA含量均显著降低(P<0.05)。氯胺酮可明显增加脑缺血和再灌流期间ATP和DA含量，减少再灌流期间的2,3-DHBA含量。结论 氯胺酮可能通过抑制脑缺血和再灌流期间DA的释放和促进ATP含量的恢复，而减少OH·的产生，这可能是其对脑缺血再灌流损伤起保护作用的机理之一。
, 百拇医药
The change of hydroxyl free radicals during cerebral ischemia and reperfusion in gerbils and the effect of ketamine on it
Shen Xia, Xu Pengcheng
Department of Neurology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002
【Abstract】 Objective To study the change of hydroxyl free radicals during cerebral ischemia and reperfusion and the effect of ketamine on it.Methods Animal model was made by cerebral ischemia for 10 min and reperfusion for 60 min in gerbils. Animals were divided into four groups: sham-operative group(SO), ischemic group(I), ischemia reperfusion group(IR) and ketamine treatment group. The striatum,hippocampus hydroxyl free radical(OH·),ATP content and DA were determined by high performance liquid chromatography(HPLC).Results Hippocampus 2,3-DHBA content in I group and IR group was higher than that in SO group(P<0.01);2,3-DHBA content in IR group was remarkable higher than I group(P<0.05). The contents of ATP and DA were significantly reduced during ischemia and reperfusion(P<0.05). Ketamine (KT) obviously increased the contents of ATP and DA, and reduced the content of 2,3-DHBA during reperfusion.Conclusion KT could reduce OH· generation by inhibiting the release of DA and promoted the recovery of ATP during cerebral ischemia and reperfusion, it might be an important mechanism which had protective effect to cerebral ischemia reperfusion damage.
, 百拇医药
【Key words】 Gerbil Cerebral ischemia Hydroxyl free radical Ketamine
近年来，研究认为羟自由基(OH·)的损害可能是造成脑梗死病理损害的化学环节之一。氯胺酮(KT)有一定的脑保护作用。但有关其清除自由基，抑制细胞膜过氧化、延缓生物膜破坏作用的研究尚少。为此，我们观察沙土鼠脑缺血再灌流期间OH·的变化以及KT清除OH·的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 沙土鼠32只,体重45～65 g，由徐州医学院动物饲养中心提供，随机分为假手术组，缺血组，缺血再灌流组以及氯胺酮组。每组动物数均为8只。
1.2 方法
, 百拇医药
1.2.1 动物模型制备 戊巴比妥钠45 mg/kg，腹腔注射，分离两侧颈总动脉，用无创动脉夹阻断脑血流10分钟，造成前脑缺血，为缺血组。松开动脉夹恢复脑血流60分钟即为缺血再灌流组。测定鼓膜温度反映脑温。实验期间维持动物脑温37.0±0.5℃。在动物处死前30分钟 腹腔注射水杨酸钠100 mg/kg以捕捉OH·。各组动物按实验组的时间要求断头处死，在0℃条件下迅速分离海马、纹状体。液氮冷冻，-75℃保存。海马用于测定OH·和ATP，纹状体用于测定多巴胺。
1.2.2 脑组织OH·的测定[1] 采用高效液相色谱与电化学检测器联用(HPLC-ECD)方法测定二羟基苯甲酸(2,3-DHBA和2,5-DHBA)的含量，反映脑内OH·的含量。海马组织称重后以1∶3(w/v)加入3% 高氯酸(HCLO4)，在冰浴下超声制匀浆，4℃，15 000 r/min离心15分钟。上清液25 μl进样测定OH·含量。色谱柱: ODS-C18；氧化电位:+0.75 mv。流动相：柠檬酸0.03 mol/L，醋酸钠0.03 mol/L，10%甲醇，pH 3.6，流速1 ml/min。
, 百拇医药
1.2.3 腺苷酸含量的测定[2] 海马称重，用冷0.4 mol/L HCLO4超声制成10%匀浆，1 5000 r/min，离心15分钟。上清液用3 mol/L K2CO3调至中性。3000 r/min 离心5分钟，取上清液10 μl进样HPLC系统，紫外检测器测量ATP、ADP和AMP含量。
1.2.4 DA含量的测定[3] 采用HPLC-ECD方法。脑组织称重，用冷0.1 mol/L HCLO4超声制成10%匀浆，15 000 r/min，离心15分钟。按文献[4]方法制备粗制突触体(P2部分)，上清液25 μl进样分析。色谱柱：ODS-C18；氧化电位：+0.75 mv。流动相：柠檬酸0.1 mol/ L，乙酸钠0.1 mol/L，流速：1 ml/min。
1.2.5 统计学处理 结果以均数±标准差(
±s)表示，各组间检测数据的比较采用t检验。, http://www.100md.com
2 结 果
2.1 海马2,3-DHBA和2,5-DHBA含量 缺血组和缺血再灌流组比假手术组有明显增高(均P<0.01)。而缺血再灌流组2,3-DHBA的含量又高于缺血组(P<0.05)。氯胺酮组2,3-DHBA含量虽比缺血组有所降低，但无统计学意义(P>0.05)，比假手术组明显升高，比缺血再灌流组显著降低(P<0.05)，见表1。
表1 4组海马2,3 -DHBA和2,5-DHBA含量的变化(
±s，mmol/L) 组 别2,3-DHBA
2,5-DHBA
缺血组(n=8)
, http://www.100md.com 0.65±0.23**
1.20±0.14**
缺血再灌流组(n=8)
0.95±0.15**Δ
1.78±0.81**
氯胺酮组(n=8)
0.55±0.16*#
1.01±0.43
假手术组(n=8)
0.21±0.14
, 百拇医药
0.75±0.09
与假手术组相比*P<0.05，**P<0.01；与缺血组相比ΔP<0.05;与缺血再灌流组相比#P<0.05
2.2 海马ATP和腺苷池(ATP+ADP+AMP)含量 与假手术组相比，缺血组明显下降(P<0.05)。缺血再灌流组ATP及腺苷池含量有所减少，但无显著差异。再灌流60分钟时氯胺酮组ATP含量恢复为假手术组的89%，而缺血再灌流组仅为71%，明显低于氯胺酮组(P<0.05)。氯胺酮组腺苷池含量也高于缺血再灌流组(P<0.05)。 见表2。
表2 4组海马ATP和腺苷池含量的变化(
±s，mmol/kg) 组 别, 百拇医药
ATP
ADP
AMP
ATP+ADP+AMP
缺血组(n=8)
0.19±0.03*
0.43±0.18
1.08±0.17
1.70±0.40*
缺血再灌流组(n=8)
0.60±0.10
, http://www.100md.com 0.39±0.17
0.85±0.16
1.84±0.46
氯胺酮组(n=8)
0.79±0.15#
0.65±0.14
0.84±0.19
2.21±0.19#
假手术组(n=8)
0.94±0.29
0.74±0.30
, http://www.100md.com
1.12±0.32
2.80±0.30
与假手术组相比*P<0.05；与缺血再灌流组相比#P<0.05
2.3 纹状体DA含量 脑缺血10分钟， 缺血组为1961±464 μg/g，再灌流60分钟, 缺血再灌流组DA含量为3460±1444 μg/g，均明显低于假手术组(6639±719 μg/g)(P<0.01)。氯胺酮组DA含量为5292±1347 μg/g，明显高于缺血组和缺血再灌流组(P<0.01)。
3 讨 论
脑细胞富含不饱和脂肪酸和Fe2+，但抗氧化能力较弱，因而易遭受氧自由基的损害。在氧自由基中，以羟自由基(OH·)的生物活性最为活跃。它易使细胞膜脂质、蛋白质和核酸氧化而导致细胞功能障碍和死亡[5]。目前多以水杨酸捕捉、HPLC-ECD法来测定OH·的含量。OH·可与水杨酸反应生成2,3-DHBA和2,5-DHBA。因2,5-DHBA除来自与水杨酸反应外，还可由肝脏微粒体的混合功能氧化酶系统产生，故目前认为2,3-DHBA的含量能较好地反应体内OH·的含量[1]。实验发现，脑缺血和再灌流期间2,3-DHBA含量均显著增加，且两个时相之间2,3-DHBA的含量也有差别；KT可明显减少海马再灌流期间的2,3-DHBA含量。提示KT有减少脑缺血再灌流期间产生OH·的作用，这可能是KT减轻脑缺血/再灌流损伤的机理之一。
, http://www.100md.com
实验还显示鼠脑缺血和再灌流期间脑组织突触体中DA含量减少，其原因可能是DA释放增多所致[6]。大量释放的DA通过氧化脱氨基作用可产生大量
和H2O2，H2O2与Fe2+反应生成OH·。因此实验提示脑缺血再灌流期间大量释放的DA是OH·产生的来源之一；KT则可以增加脑组织DA含量，减少DA的释放，进而减少OH·的产生。脑缺血期间，ATP含量及腺苷酸池明显降低。脑缺血后ATP的消耗和分解也可以促进自由基的产生。ATP、ADP、AMP的分解可产生大量的黄嘌呤、次黄嘌呤，这些都是产生氧自由基的重要原料。脑缺血缺氧又促使黄嘌呤脱氢酶变成黄嘌呤氧化酶，使黄嘌呤、次黄嘌呤氧化产生
和H2O2，进一步生成大量的OH·[7]。KT促进脑缺血再灌注期间ATP含量的恢复，减少黄嘌呤和次黄嘌呤的氧化，有助于减少自由基的产生。, 百拇医药
江苏省卫生厅自然科学基金资助课题(H9333)
参 考 文 献
1.Kil HY, Zhang J, Piantadosi C. Brain temperature alters hydroxyl radical production during cerebral ischemia/reperfusion in rats. J Cer Blood Metab, 1996,16:100
2.刘斯奇，聂洪勇，卢义钦. 反相高效液相色谱测定人体红细胞内腺嘌呤和吡啶核苷酸. 生物化学与生物物理， 1996，6：49
3.Takagi N, Tsuru H, Yamamura M，et al. Changes in striatal dopamine metabolism after microsphere embolism in rats. Stroke, 1995,20:1101
, 百拇医药
4.韩济生. 神经科学纲要. 北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社， 1993.31
5.Floyed RA, Carney JM. Free radical damage to protein and DNA: mechanisms involved and relevant observations on brain undergoing oxidative stress. Ann Neurol,1992,32:S22
6.Frolich L, Dirr A, Riederer P, et al. Effects of long-term recovery from transient cerebral ischemia in rat brain: tissue levels of acetylcholine, monoaminess and the I/R metabolites.Neurochem Res, 1993,18:1239
7.Ichord RN, Kirsch JR, Helfaer MA, et al. Age-related differences in recovery of blood flow and metabolism after cerebral ischemia in swine. Stroke, 1991,22:626
(收稿1999-11-01 修回1999-12-21), 百拇医药