肿瘤学中的分子遗传学和细胞遗传学技术
作者：冯 玲(译) 闻良珍(校)
单位：同济医科大学附属同济医院
关键词：
德国医学000306D.Niederacher, M.Kiechle, N.Arnold
Molekular- und zytogenetisch Techniken in der Onkologie
随着致癌机制模型的建立，从正常上皮细胞演变为癌组织，随基因改变，最终导致表型的改变。目前已知的两种基因改变形式：原癌基因的激活和肿瘤抑制基因的失活，基因的激活是原癌基因的改变或者功能失控而引起的基因扩增、过表达和突变的结果。
采用分子遗传学分析技术，在家族性肿瘤疾病中通过已知缺失基因而预测疾病风险。染色体改变除了解肿瘤发生外，对指导治疗和检测病人方面也有十分重要的意义。
, 百拇医药
例如家族中常见的乳腺癌和卵巢癌，经基因分析存在两种基因：BRCA1和BRCA2。1994年获得了BRCA1基因，1995年克隆出BRCA2基因(位于13q12-13)，从而确定了该基因的序列，使诊断BRCA1(BRCA2)的确成为可能，对危险家族提出建议，是给予治疗前的一项必要的常规诊断技术。
分子遗传学技术
以下介绍的是在肿瘤研究中，一些基本的分析基因改变的分子遗传学方法及先进的分析基因突变的技术。
定量PCR 肿瘤激活的机理与真核细胞二倍体基因组的基因复制相同，原癌基因扩增成倍增加。用于确定原癌基因复制数目的定量PCR的原理，是通过刺激原癌基因(目的基因)的DNA序列片段及非扩增的(单拷贝)基因扩增来实现的。在引物中插入荧光标记物，对PCR的产物进行DNA序列片段自动分析，即可确定信号增强的PCR产物，从一定量的目的基因和标准基因的PCR产物中，可以计算出原癌基因复制的数目。
, 百拇医药
所谓过表达是指原癌基因的RNA合成增加，可通过反转录PCR证实，在反转录作用下，RNA复制成cDNA(互补DNA)，目的基因RNA与实验结构的基因，其RNA量皆可通过定量PCR确定。
LOH-分析法 研究发现，染色体一定区域的缺失，决定一定的肿瘤类型，其特定的产生和生长特性，可通过LOH(杂合性缺失)分析来证实。插入多形标志物如所谓的“小卫星序列”，是一个短的重复性基因序列(2～5个碱基对)，在两条同源性染色体内有不同的重复次数，将这些带有标志物的序列，通过一对引物进行扩增，使正常的两条同源性DNA获得二条不同的PCR产物链，与肿瘤组织相比较，可发现肿瘤DNA的PCR产物缺乏标志产物序列。LOH-分析所用的多形标志物，可用于多种肿瘤基因型等位基因缺失的检测及肿瘤抑制基因失活(TSG)。
突变分析法 较大的基因如BRCA1及BRCA2基因突变的分析，由于无已知的、较为明显的突变区域，而对分子生物实验技术要求很高。在所谓的分析方法中，完全性DNA测序被认为是灵敏度最高的技术，但其价格昂贵、费时。为减少这些因素的影响，以发现BCRA1突变研究中，采用了不同的筛选方法，如单链多态性分析(SSCP)、蛋白截断试验(PTT)、发现酶突变试验(EMD)、高压液相色谱仪(DHPLC)、特异性寡核苷酸杂交、变性-梯度-凝胶电泳(DGGE)、温度-梯度-凝胶电泳(TGGE)、构形-敏感性-凝胶电泳(CSGE)及对可疑突变部位的测序，在这些筛选试验中，突变检测率的敏感性不仅取决于方法选择，而且与检测者的经验有关。
, http://www.100md.com
SSCP SSCP分析是建立在通过测序区分DNA单链构型差异的基础上，此差异可影响非变性电泳系统中DNA单链的转变速度，用于分析的DNA片段，经PCR扩增后含有2个片段，加热变性，2条链即分离，部分互补链又重新配对，依据序列自行折叠，形成特异性二级结构，在研究中可观察到附加的条带发生突变产生异常结构。在诊断突变过程中，SSCP的敏感度为60%及80%～90%。
PTT PTT试验是通过体外转录和翻译，在此基础上将分离获得的DNA在反应试管中合成蛋白质。人们利用分离出不同片段长度的蛋白质，证实导致蛋白质合成早期即出现停滞，使氨基酸序列变短，通过片段扩增，用于分析所有DNA序列编码，按照“无义突变”(氨基酸密码转变为终止密码)和“移码突变”(插入或缺失使阅读光栅推移，导致翻译提前终止)2类，在研究BRCA1及BRCA2基因突变中，PTT在早期筛选中有重要意义，在两个基因组中，有80%以上的等位基因发现了“无义突变”和“移码突变”。
EMD EMD和SSCP分析相似，将PCR产物变性获得单链，经退火后使配对单链重组成双链片段，未能互补配对的片段即为杂合子的突变基因，可导致异源双链中的错误配对。异源双链和同源双链构型上的区别，通过多种异源双链分析技术鉴别。EMD是一种敏感性高的筛选方法。
, 百拇医药
DHPLC DHPLC是一种新的证实异源双链方法，可用于BRCA1和BRCA2突变检查的筛选法。
除在突变分析中应用这些技术，在认识Y染色体、RET和CFTR基因的多形态方面已成功应用。DHPLC在认识突变方面提供了一种快速、敏感的方法，凡是与癌肿发生有关的基因皆可以应用该种方法进行分析。
DNA测序 在各种筛选方法的敏感性和/或特异性受限时，DNA测序无疑成为突变分析的“金标准”。根据建立的测序程序(M13测序循环)，可购买商品试剂盒进行测序，用DNA测序仪进行分析，内含的探针数据可与正常已知的序列自动进行比较，确定偏差，由于突变产生编码的移动，使相应的序列表达发生改变而易于识别。
肿瘤细胞遗传学技术 目前已公认，内源性、外源性因素作用，导致基因组障碍和异常调节，是肿瘤产生的原因。研究证明，在那些未参与构建标志染色体的染色体其它区域存在有原癌基因。因此，肿瘤发生、肿瘤病毒及染色体畸变有密切关系。细胞基因和分子基因技术结果表明，多数实体肿瘤发生与染色体片段的缺失和扩增有关。
, 百拇医药
比较性基因组杂交技术(CGH) CGH与分子遗传学技术不同，其实验基础是生物素标记的正常核型的标准DNA与另一种标记物(地高辛)标记的肿瘤DNA混合在一起，按常规分裂中期染色体杂交方式进行杂交。CGH主要应用于实体肿瘤的检测及产前、产后诊断多余的标记染色体分析。
染色体的显微解剖和显微克隆
1992年Meltzer等对简化显微解剖技术作出了巨大贡献，他们在万能引物帮助下进行显微解剖的DNA体外扩增，该法简便、迅速。适用于各领域，可确定参与这类染色体生成的染色体及转录中断点的特性，对于缺失、复制及染色体畸变及在“同源基因区域(HSR)”和“双重分钟(MD)”扩增区域进行分析。利用显微克隆可确定局部区域的基因型。
分裂间期的细胞遗传学
近10年来，针对间期未培养细胞的染色体、中心粒旁的α-卫星区域的荧光原位杂交(FISH)及局部特异性探针，在诊断、监控血液学中新生物的形成中具有重要价值。该技术采用合适的探针，就可在染色体复制过程中，发现一个染色体异常。
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结 论
现代肿瘤研究证实，肿瘤相关基因的突变引起及控制肿瘤的生成和发展，如今用于常规诊断的基因技术，还仅限于乳腺癌及卵巢癌基因BCRA1和BCRA2的早期发现。
基因DNA分析作为突变分析的“金标准”，费时、耗资，所建立的DHPLC可用于BRCA1及BRCA2早期筛选方法，该法快速、敏感、花费合理。
带有染色体特异探针的FISH技术，对诊断和评价血液学中新生物具有重要价值。
Gynäkologe,1998,31∶1019-1032
D.Niederacher, M.Kiechle, N.Arnold(Molekulargenetisches Labor der Frauenklinik,Moorenstr.5,D-40225 Düsseldorf, Germany), http://www.100md.com
单位：同济医科大学附属同济医院
关键词：
德国医学000306D.Niederacher, M.Kiechle, N.Arnold
Molekular- und zytogenetisch Techniken in der Onkologie
随着致癌机制模型的建立，从正常上皮细胞演变为癌组织，随基因改变，最终导致表型的改变。目前已知的两种基因改变形式：原癌基因的激活和肿瘤抑制基因的失活，基因的激活是原癌基因的改变或者功能失控而引起的基因扩增、过表达和突变的结果。
采用分子遗传学分析技术，在家族性肿瘤疾病中通过已知缺失基因而预测疾病风险。染色体改变除了解肿瘤发生外，对指导治疗和检测病人方面也有十分重要的意义。
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例如家族中常见的乳腺癌和卵巢癌，经基因分析存在两种基因：BRCA1和BRCA2。1994年获得了BRCA1基因，1995年克隆出BRCA2基因(位于13q12-13)，从而确定了该基因的序列，使诊断BRCA1(BRCA2)的确成为可能，对危险家族提出建议，是给予治疗前的一项必要的常规诊断技术。
分子遗传学技术
以下介绍的是在肿瘤研究中，一些基本的分析基因改变的分子遗传学方法及先进的分析基因突变的技术。
定量PCR 肿瘤激活的机理与真核细胞二倍体基因组的基因复制相同，原癌基因扩增成倍增加。用于确定原癌基因复制数目的定量PCR的原理，是通过刺激原癌基因(目的基因)的DNA序列片段及非扩增的(单拷贝)基因扩增来实现的。在引物中插入荧光标记物，对PCR的产物进行DNA序列片段自动分析，即可确定信号增强的PCR产物，从一定量的目的基因和标准基因的PCR产物中，可以计算出原癌基因复制的数目。
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所谓过表达是指原癌基因的RNA合成增加，可通过反转录PCR证实，在反转录作用下，RNA复制成cDNA(互补DNA)，目的基因RNA与实验结构的基因，其RNA量皆可通过定量PCR确定。
LOH-分析法 研究发现，染色体一定区域的缺失，决定一定的肿瘤类型，其特定的产生和生长特性，可通过LOH(杂合性缺失)分析来证实。插入多形标志物如所谓的“小卫星序列”，是一个短的重复性基因序列(2～5个碱基对)，在两条同源性染色体内有不同的重复次数，将这些带有标志物的序列，通过一对引物进行扩增，使正常的两条同源性DNA获得二条不同的PCR产物链，与肿瘤组织相比较，可发现肿瘤DNA的PCR产物缺乏标志产物序列。LOH-分析所用的多形标志物，可用于多种肿瘤基因型等位基因缺失的检测及肿瘤抑制基因失活(TSG)。
突变分析法 较大的基因如BRCA1及BRCA2基因突变的分析，由于无已知的、较为明显的突变区域，而对分子生物实验技术要求很高。在所谓的分析方法中，完全性DNA测序被认为是灵敏度最高的技术，但其价格昂贵、费时。为减少这些因素的影响，以发现BCRA1突变研究中，采用了不同的筛选方法，如单链多态性分析(SSCP)、蛋白截断试验(PTT)、发现酶突变试验(EMD)、高压液相色谱仪(DHPLC)、特异性寡核苷酸杂交、变性-梯度-凝胶电泳(DGGE)、温度-梯度-凝胶电泳(TGGE)、构形-敏感性-凝胶电泳(CSGE)及对可疑突变部位的测序，在这些筛选试验中，突变检测率的敏感性不仅取决于方法选择，而且与检测者的经验有关。
, http://www.100md.com
SSCP SSCP分析是建立在通过测序区分DNA单链构型差异的基础上，此差异可影响非变性电泳系统中DNA单链的转变速度，用于分析的DNA片段，经PCR扩增后含有2个片段，加热变性，2条链即分离，部分互补链又重新配对，依据序列自行折叠，形成特异性二级结构，在研究中可观察到附加的条带发生突变产生异常结构。在诊断突变过程中，SSCP的敏感度为60%及80%～90%。
PTT PTT试验是通过体外转录和翻译，在此基础上将分离获得的DNA在反应试管中合成蛋白质。人们利用分离出不同片段长度的蛋白质，证实导致蛋白质合成早期即出现停滞，使氨基酸序列变短，通过片段扩增，用于分析所有DNA序列编码，按照“无义突变”(氨基酸密码转变为终止密码)和“移码突变”(插入或缺失使阅读光栅推移，导致翻译提前终止)2类，在研究BRCA1及BRCA2基因突变中，PTT在早期筛选中有重要意义，在两个基因组中，有80%以上的等位基因发现了“无义突变”和“移码突变”。
EMD EMD和SSCP分析相似，将PCR产物变性获得单链，经退火后使配对单链重组成双链片段，未能互补配对的片段即为杂合子的突变基因，可导致异源双链中的错误配对。异源双链和同源双链构型上的区别，通过多种异源双链分析技术鉴别。EMD是一种敏感性高的筛选方法。
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DHPLC DHPLC是一种新的证实异源双链方法，可用于BRCA1和BRCA2突变检查的筛选法。
除在突变分析中应用这些技术，在认识Y染色体、RET和CFTR基因的多形态方面已成功应用。DHPLC在认识突变方面提供了一种快速、敏感的方法，凡是与癌肿发生有关的基因皆可以应用该种方法进行分析。
DNA测序 在各种筛选方法的敏感性和/或特异性受限时，DNA测序无疑成为突变分析的“金标准”。根据建立的测序程序(M13测序循环)，可购买商品试剂盒进行测序，用DNA测序仪进行分析，内含的探针数据可与正常已知的序列自动进行比较，确定偏差，由于突变产生编码的移动，使相应的序列表达发生改变而易于识别。
肿瘤细胞遗传学技术 目前已公认，内源性、外源性因素作用，导致基因组障碍和异常调节，是肿瘤产生的原因。研究证明，在那些未参与构建标志染色体的染色体其它区域存在有原癌基因。因此，肿瘤发生、肿瘤病毒及染色体畸变有密切关系。细胞基因和分子基因技术结果表明，多数实体肿瘤发生与染色体片段的缺失和扩增有关。
, 百拇医药
比较性基因组杂交技术(CGH) CGH与分子遗传学技术不同，其实验基础是生物素标记的正常核型的标准DNA与另一种标记物(地高辛)标记的肿瘤DNA混合在一起，按常规分裂中期染色体杂交方式进行杂交。CGH主要应用于实体肿瘤的检测及产前、产后诊断多余的标记染色体分析。
染色体的显微解剖和显微克隆
1992年Meltzer等对简化显微解剖技术作出了巨大贡献，他们在万能引物帮助下进行显微解剖的DNA体外扩增，该法简便、迅速。适用于各领域，可确定参与这类染色体生成的染色体及转录中断点的特性，对于缺失、复制及染色体畸变及在“同源基因区域(HSR)”和“双重分钟(MD)”扩增区域进行分析。利用显微克隆可确定局部区域的基因型。
分裂间期的细胞遗传学
近10年来，针对间期未培养细胞的染色体、中心粒旁的α-卫星区域的荧光原位杂交(FISH)及局部特异性探针，在诊断、监控血液学中新生物的形成中具有重要价值。该技术采用合适的探针，就可在染色体复制过程中，发现一个染色体异常。
, http://www.100md.com
结 论
现代肿瘤研究证实，肿瘤相关基因的突变引起及控制肿瘤的生成和发展，如今用于常规诊断的基因技术，还仅限于乳腺癌及卵巢癌基因BCRA1和BCRA2的早期发现。
基因DNA分析作为突变分析的“金标准”，费时、耗资，所建立的DHPLC可用于BRCA1及BRCA2早期筛选方法，该法快速、敏感、花费合理。
带有染色体特异探针的FISH技术，对诊断和评价血液学中新生物具有重要价值。
Gynäkologe,1998,31∶1019-1032
D.Niederacher, M.Kiechle, N.Arnold(Molekulargenetisches Labor der Frauenklinik,Moorenstr.5,D-40225 Düsseldorf, Germany), http://www.100md.com