大肠肿瘤中p53和bcl-2蛋白的表达
作者：曹立宇 张洪福 龚西马 俞孟刚
单位：(安徽医科大学病理学教研室，合肥 230032)
关键词：结肠肿瘤；直肠肿瘤；蛋白质p53；bcl-2蛋白；凋亡；免疫组织化学
临床与实验病理学杂志000311 摘要 目的：研究p53和bcl-2在大肠肿瘤发生中的作用。方法：应用免疫组化S-P法分别检测大肠正常粘膜、腺瘤及腺癌中p53和 bcl-2表达。结果：大肠腺癌p53表达率高于腺瘤组(P<0.05)，p53表达与大肠癌的临床病理因素无关(P>0.05)，bcl-2在正常粘膜基底部上皮细胞表达，在腺瘤(77.5%)和腺癌中(55%)bcl-2表达差异显著(P<0.01)，高分化腺癌bcl-2表达率(73.7%)高于差分化腺癌(41.2%)，在腺瘤和腺癌中bcl-2和p53呈负相关。结论：p53基因改变在大肠腺瘤癌变中起重要作用，大肠癌的发生与bcl-2基因在大肠腺瘤和腺癌中细胞凋亡抑制有关。
, 百拇医药
中图分类号 R735.34 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(2000)03-0214-03
p53 and bcl-2 oncoprotein expression in colorectal tumor
Cao Liyu Zhang Hongfu Gong Xiyu Meng Gang
(Dept of Pathol，Anhui Medical University，Hefei 230032)
ABSTRACT Purpose To study the role of p53、bcl-2 in colorectal tumorigenesis.Methods Using immunohistochemistry S-P method，the expression of p53 and bcl-2 were examined in normal colonic mucosas，hyperplastic polyps，adenomas and adenocarcinomas.Results The expression rate of colorectal adenocarcinomas was significant higher than that of adenomas (P<0.05).No significant correlation was observed between p53 expression and clinicopathological manifestations (P>0.05). bcl-2 was expressed in the basal epithelial cells of the lower colonic cypts in mucosa and hyperplastic polyps.Significant difference of bcl-2 expression was found between adenomas and adenocarcinomas(P<0.05).bcl-2 expression of well differentiated carcinomas was significant higher than that of poorly differentiated carcinomas (P<0.01).An inverse correlation was found between bcl-2 and p53 expression in adenomas and in adenocarcinomas (P<0.01).Conclusion Alteration of p53 gene is involved mainly in the transformation from benign adenoma to adenocarcinoma, colorectal carcinogenesis is related to the inhibition of apoptosis.
, 百拇医药
KEY WORDS colonic neoplasms; rectal neoplasms；protein p53; protein,bcl-2;apoptosis; immunohistochemistry
p53是大肠癌发生中最常变化的基因〔1〕，在正常细胞中对细胞的增殖和分化起负调控作用。近年研究表明，肿瘤的发生不仅与细胞的增殖有关，而且与细胞凋亡密切相关。bcl-2是凋亡抑制基因，对肿瘤细胞的增殖起重要作用。我们应用免疫组化方法对大肠腺瘤及腺癌组织中p53、bcl-2异常表达进行了研究，探讨其表达状况与大肠肿瘤的发生及其相互关系。
1 材料与方法
1.1 材料 收集安徽医科大学第一附属医院病理科1993～1998年手术及肠镜活检的部分标本，其中腺瘤(包括癌变)57例、腺癌80例，15例正常粘膜取自肿瘤边缘5 cm以上的切缘，均本均用10%福尔马林液固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，分别做HE及免疫组化染色。HE切片按1981《全国大肠癌病理协作研究统一规范》分为：管状腺瘤12例，管状绒毛状腺瘤14例，绒毛状腺瘤14例，腺瘤癌变17例，高分化腺癌38例，中分化腺癌18例，低分化腺癌24例。所有患者术前均未作放疗、化疗及免疫治疗。
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1.2 试剂与方法 鼠抗人p53(Do-7)单克隆抗体，鼠抗人bcl-2(100)单克隆抗体及免疫组化S-P试剂盒均为美国Zymed公司产品，购自福建迈新生物技术公司，按试剂盒说明书进行染色，用PBS代替一抗作阴性对照，用已知大肠癌阳性切片作阳性对照。
1.3 结果判断 免疫组化染色阳性反应为黄-棕黄颗粒。p53定位于细胞核，bcl-2主要定位于胞浆，亦可见于胞膜及核膜。两人双肓法观察切片，采用半定量积分法判断结果。阳性细胞≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分，阳性强度淡黄色为1分，黄色为2分、棕黄色为3分、两者积分相乘，0分为阴性(-)，1～4分弱阳性(+)，5～8分为阳性(
)，9～12分为强阳性(
)。若两人结果相差3分则重新判定。
, 百拇医药
1.4 统计学方法 率的差异显著性用χ2检验，两者相关性用Spearman相关分析。
表1 大肠正常粘膜、腺瘤及癌组织中p53和bcl-2表达 组 别
n
p53
阳性率(%)
bcl-2
阳性率(%)
-
+
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-
+
正常粘膜
15
15
0
0
0
0.0
0
0
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0
15
100.0
腺瘤
40
31
7
2
0
22.5*
9
7
12
, http://www.100md.com
12
77.5
腺瘤癌变
17
5
5
4
3
70.6
6
3
5
3
64.7
, http://www.100md.com
大肠腺癌
高分化
38
14
6
9
9
63.2
13
6
11
8
65.7**
, http://www.100md.com
中分化
18
8
5
3
2
55.6
9
2
4
3
50.0
低分化
24
, 百拇医药
11
4
5
4
54.2
14
4
4
2
41.7
总计
80
33
15
, http://www.100md.com
17
15
58.8
36
11
21
12
55.0
与腺瘤癌变及腺癌相比*P<0.01，与低分化组相比**P<0.052 结果
2.1 p53和bcl-2蛋白在大肠腺瘤、腺瘤癌变及腺癌中的表达 p53蛋白在正常粘膜中不表达，腺瘤癌变及腺癌中p53蛋白阳性率分别为22.5%(9/40)，70.6%(12/17)和58.8%(47/80)。腺瘤中阳性细胞多呈灶状分布，染色较弱，部分腺瘤癌变和腺癌中阳性细胞多呈弥漫分布，染色较强，腺瘤癌变和腺癌中p53 阳性率明显高于腺瘤组(P<0.01)，大肠癌p53表达与临床病理因素无关。bcl-2在正常粘膜上皮基底部表达阳性，而表面上皮常阴性，腺瘤、腺瘤癌变、腺癌中bcl-2表达率分别为77.5%(31/40)，64.7%(11/17)和55%(44/80)。bcl-2表达在腺瘤组与腺癌组和高分化腺癌组(73.7%)与低分化腺癌组(41.2%)间差异有显著性(P<0.05)。bcl-2与大肠癌其它临床病理因素无关(表1)。
, 百拇医药
2.2 大肠腺瘤及腺癌中p53与bcl-2表达的关系 腺瘤中p53和bcl-2阳性率分别为22.5%、77.5%、两者同时阳性占10%(4/10)，腺癌中p53和bcl-2阳性率分别为58.8%和55%，两者同时阳性占22.5%(18/80)。Spearman相关分析在腺瘤和腺癌中p53和bcl-2表达呈负相关(表2)。
表2 大肠腺瘤及腺癌中p53和bcl-2表达之间的关系 p53
n
腺瘤bcl-2表达
n
腺癌bcl-2表达
-
+～
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-
+～
-
31
4
27
33
7
26
+～
9
5
4*
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47
29
18*
rs=-0.427，*P=0.016，rs=-0.401，**P=0.000533 讨论
正常p53蛋白是G1期检查点，具有生长捕获和诱导细胞凋亡的功能，细胞内含量少且半衰期短。突变型p53蛋白则失去上述功能〔2〕，细胞内含量增加，半衰期延长，因而可用免疫组化检测。目前认为检测p53蛋白表达能基本反映p53基因突变。本研究结果显示正常粘膜中p53表达阴性，22.5%的腺瘤p53表达阳性，阳性细胞少，染色较弱，且主要位于中～重度非典型增生腺体。在腺瘤癌变，这一大肠癌早期阶段表达率最高达70.6%,而在大肠癌中又下降到58.8%，我们认为p53蛋白表达主要发生在大肠癌的早期阶段，尤其在腺瘤癌变过程中起重要作用，是腺瘤-癌序列的晚期事件〔3〕，即大肠癌发生的较早事件。大肠癌中p53蛋白表达略低于腺瘤癌变(P>0.05)。不同分化的大肠癌中p53表达亦无显著差异，其原因尚不清楚，可能与其它基因共同参与肿瘤组织分化有关，与文献报道基本相符〔4，5〕,表明p53蛋白异常表达与大肠癌的发生密切相关，检测腺瘤p53表达状况有助于预测其癌变倾向。
, http://www.100md.com
bcl-2是近年来认识的一种抑制凋亡的基因〔5〕，本研究发现正常粘膜中bcl-2局限于基底部增生区呈强阳性表达，而表面上皮表达阴性，在这里bcl-2表达主要是抑制干细胞凋亡，从而维持干细胞增殖活性。在腺瘤(77.5%)、腺瘤癌变(64.7%)及腺癌(55%)中，bcl-2表达率逐渐降低，与正常粘膜增生区相比其抑制细胞凋亡的能力相对减弱，但肿瘤细胞增殖活性明显增强。在腺癌组bcl-2表达率明显低于腺瘤组(P<0.05)，并且与大肠的高分化相关。提示bcl-2表达是继p53之后大肠癌发生中的早期事件。检测bcl-2表达状况有助于大肠癌的早期诊断和预后判断。
p53和bcl-2均与细胞凋亡密切相关，本研究结果显示，在腺瘤和腺癌中bcl-2和p53基因共同表达率分别为10%和22.5%，bcl-2和p53表达呈负相关，p53在腺癌中表达率高于腺瘤组；而bcl-2正好相反，与文献报道基本一致〔6，7〕，提示在大肠腺瘤一癌序列中p53基因突变可降低bcl-2表达潜能，有利于细胞的恶性转化。进一步研究表明，单纯p53缺乏的小鼠bcl-2表达增加，bcl-2表达可抑制p53基因诱导的凋亡反应〔8〕。因此联合检测大肠肿瘤中p53和bcl-2表达状况，有助于大肠癌的早期诊断和预后判断。
, 百拇医药
基金项目：安徽省卫生厅基金资助课题(A95-1998-23)
作者简介：曹立宇，男，29岁，硕士。研究方向：大肠肿瘤病理学
参考文献
1，Baker SJ, Preisinger AC,Jessup JM et al.p53 gene mutation occur combination with 17p allelic deletions as late event in colorectal tumorigenesis.Cancer Res,1990;50(23)7717～7722
2，Michalovitz D, Halevy O,Oren M.Conditional inhibition of transformation and of cell proliferation by a temperature sensitive mutant of p53. Cell，1990;62(4):671～680
, 百拇医药
3，Fearon ER, Vogelstein B.A genetic model for colorectal tumorigenesis.Cell，1990;61(5):759～767
4，Poller DN,Baxter KJ,Shepherd NA.p53 and Rb1 protein expression:are they prognostically useful in colorectal cancer? Br J Cancer,1997;75(1):87～93
5，Watson AJ, Merritt AJ,Jones LS et al.Evidence for reciprocity of bcl-2 and p53 expression in human colorectal adenomas and carcinomas.Br J Cancer,1996;73(8):889～895
, 百拇医药
6，Sinicrope FA, Ruan SB,Cleary KR et al.bcl-2 and p53 oncoprotein expression during colorectal tumorigenesis.Cancer Res,1995;55(2):237～241
7，Schneider HJ, Sampson SA,Cunningham D et al.bcl-2 expression and response to chemotherapy in colorectal adenocarcinomas.Br J Cancer,1997;75(3):427～431
8，Miyashita T，Krajewshi S，Krajewsha M et al.Tumor suppressor p53 is a regulator of bcl-2 and bax gene expression in vitro and in vivo.Oncogene，1994;9(6):1799～1805
收稿日期：1999-08-12
修回日期：1999-12-10, 百拇医药
单位：(安徽医科大学病理学教研室，合肥 230032)
关键词：结肠肿瘤；直肠肿瘤；蛋白质p53；bcl-2蛋白；凋亡；免疫组织化学
临床与实验病理学杂志000311 摘要 目的：研究p53和bcl-2在大肠肿瘤发生中的作用。方法：应用免疫组化S-P法分别检测大肠正常粘膜、腺瘤及腺癌中p53和 bcl-2表达。结果：大肠腺癌p53表达率高于腺瘤组(P<0.05)，p53表达与大肠癌的临床病理因素无关(P>0.05)，bcl-2在正常粘膜基底部上皮细胞表达，在腺瘤(77.5%)和腺癌中(55%)bcl-2表达差异显著(P<0.01)，高分化腺癌bcl-2表达率(73.7%)高于差分化腺癌(41.2%)，在腺瘤和腺癌中bcl-2和p53呈负相关。结论：p53基因改变在大肠腺瘤癌变中起重要作用，大肠癌的发生与bcl-2基因在大肠腺瘤和腺癌中细胞凋亡抑制有关。
, 百拇医药
中图分类号 R735.34 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(2000)03-0214-03
p53 and bcl-2 oncoprotein expression in colorectal tumor
Cao Liyu Zhang Hongfu Gong Xiyu Meng Gang
(Dept of Pathol，Anhui Medical University，Hefei 230032)
ABSTRACT Purpose To study the role of p53、bcl-2 in colorectal tumorigenesis.Methods Using immunohistochemistry S-P method，the expression of p53 and bcl-2 were examined in normal colonic mucosas，hyperplastic polyps，adenomas and adenocarcinomas.Results The expression rate of colorectal adenocarcinomas was significant higher than that of adenomas (P<0.05).No significant correlation was observed between p53 expression and clinicopathological manifestations (P>0.05). bcl-2 was expressed in the basal epithelial cells of the lower colonic cypts in mucosa and hyperplastic polyps.Significant difference of bcl-2 expression was found between adenomas and adenocarcinomas(P<0.05).bcl-2 expression of well differentiated carcinomas was significant higher than that of poorly differentiated carcinomas (P<0.01).An inverse correlation was found between bcl-2 and p53 expression in adenomas and in adenocarcinomas (P<0.01).Conclusion Alteration of p53 gene is involved mainly in the transformation from benign adenoma to adenocarcinoma, colorectal carcinogenesis is related to the inhibition of apoptosis.
, 百拇医药
KEY WORDS colonic neoplasms; rectal neoplasms；protein p53; protein,bcl-2;apoptosis; immunohistochemistry
p53是大肠癌发生中最常变化的基因〔1〕，在正常细胞中对细胞的增殖和分化起负调控作用。近年研究表明，肿瘤的发生不仅与细胞的增殖有关，而且与细胞凋亡密切相关。bcl-2是凋亡抑制基因，对肿瘤细胞的增殖起重要作用。我们应用免疫组化方法对大肠腺瘤及腺癌组织中p53、bcl-2异常表达进行了研究，探讨其表达状况与大肠肿瘤的发生及其相互关系。
1 材料与方法
1.1 材料 收集安徽医科大学第一附属医院病理科1993～1998年手术及肠镜活检的部分标本，其中腺瘤(包括癌变)57例、腺癌80例，15例正常粘膜取自肿瘤边缘5 cm以上的切缘，均本均用10%福尔马林液固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，分别做HE及免疫组化染色。HE切片按1981《全国大肠癌病理协作研究统一规范》分为：管状腺瘤12例，管状绒毛状腺瘤14例，绒毛状腺瘤14例，腺瘤癌变17例，高分化腺癌38例，中分化腺癌18例，低分化腺癌24例。所有患者术前均未作放疗、化疗及免疫治疗。
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1.2 试剂与方法 鼠抗人p53(Do-7)单克隆抗体，鼠抗人bcl-2(100)单克隆抗体及免疫组化S-P试剂盒均为美国Zymed公司产品，购自福建迈新生物技术公司，按试剂盒说明书进行染色，用PBS代替一抗作阴性对照，用已知大肠癌阳性切片作阳性对照。
1.3 结果判断 免疫组化染色阳性反应为黄-棕黄颗粒。p53定位于细胞核，bcl-2主要定位于胞浆，亦可见于胞膜及核膜。两人双肓法观察切片，采用半定量积分法判断结果。阳性细胞≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分，阳性强度淡黄色为1分，黄色为2分、棕黄色为3分、两者积分相乘，0分为阴性(-)，1～4分弱阳性(+)，5～8分为阳性(
)，9～12分为强阳性()。若两人结果相差3分则重新判定。, 百拇医药
1.4 统计学方法 率的差异显著性用χ2检验，两者相关性用Spearman相关分析。
表1 大肠正常粘膜、腺瘤及癌组织中p53和bcl-2表达 组 别
n
p53
阳性率(%)
bcl-2
阳性率(%)
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+
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-
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正常粘膜
15
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0
0
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0.0
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0
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100.0
腺瘤
40
31
7
2
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22.5*
9
7
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12
77.5
腺瘤癌变
17
5
5
4
3
70.6
6
3
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3
64.7
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大肠腺癌
高分化
38
14
6
9
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63.2
13
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11
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65.7**
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中分化
18
8
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55.6
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低分化
24
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11
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总计
80
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17
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58.8
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与腺瘤癌变及腺癌相比*P<0.01，与低分化组相比**P<0.052 结果
2.1 p53和bcl-2蛋白在大肠腺瘤、腺瘤癌变及腺癌中的表达 p53蛋白在正常粘膜中不表达，腺瘤癌变及腺癌中p53蛋白阳性率分别为22.5%(9/40)，70.6%(12/17)和58.8%(47/80)。腺瘤中阳性细胞多呈灶状分布，染色较弱，部分腺瘤癌变和腺癌中阳性细胞多呈弥漫分布，染色较强，腺瘤癌变和腺癌中p53 阳性率明显高于腺瘤组(P<0.01)，大肠癌p53表达与临床病理因素无关。bcl-2在正常粘膜上皮基底部表达阳性，而表面上皮常阴性，腺瘤、腺瘤癌变、腺癌中bcl-2表达率分别为77.5%(31/40)，64.7%(11/17)和55%(44/80)。bcl-2表达在腺瘤组与腺癌组和高分化腺癌组(73.7%)与低分化腺癌组(41.2%)间差异有显著性(P<0.05)。bcl-2与大肠癌其它临床病理因素无关(表1)。
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2.2 大肠腺瘤及腺癌中p53与bcl-2表达的关系 腺瘤中p53和bcl-2阳性率分别为22.5%、77.5%、两者同时阳性占10%(4/10)，腺癌中p53和bcl-2阳性率分别为58.8%和55%，两者同时阳性占22.5%(18/80)。Spearman相关分析在腺瘤和腺癌中p53和bcl-2表达呈负相关(表2)。
表2 大肠腺瘤及腺癌中p53和bcl-2表达之间的关系 p53
n
腺瘤bcl-2表达
n
腺癌bcl-2表达
-
+～
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31
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18*
rs=-0.427，*P=0.016，rs=-0.401，**P=0.000533 讨论
正常p53蛋白是G1期检查点，具有生长捕获和诱导细胞凋亡的功能，细胞内含量少且半衰期短。突变型p53蛋白则失去上述功能〔2〕，细胞内含量增加，半衰期延长，因而可用免疫组化检测。目前认为检测p53蛋白表达能基本反映p53基因突变。本研究结果显示正常粘膜中p53表达阴性，22.5%的腺瘤p53表达阳性，阳性细胞少，染色较弱，且主要位于中～重度非典型增生腺体。在腺瘤癌变，这一大肠癌早期阶段表达率最高达70.6%,而在大肠癌中又下降到58.8%，我们认为p53蛋白表达主要发生在大肠癌的早期阶段，尤其在腺瘤癌变过程中起重要作用，是腺瘤-癌序列的晚期事件〔3〕，即大肠癌发生的较早事件。大肠癌中p53蛋白表达略低于腺瘤癌变(P>0.05)。不同分化的大肠癌中p53表达亦无显著差异，其原因尚不清楚，可能与其它基因共同参与肿瘤组织分化有关，与文献报道基本相符〔4，5〕,表明p53蛋白异常表达与大肠癌的发生密切相关，检测腺瘤p53表达状况有助于预测其癌变倾向。
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bcl-2是近年来认识的一种抑制凋亡的基因〔5〕，本研究发现正常粘膜中bcl-2局限于基底部增生区呈强阳性表达，而表面上皮表达阴性，在这里bcl-2表达主要是抑制干细胞凋亡，从而维持干细胞增殖活性。在腺瘤(77.5%)、腺瘤癌变(64.7%)及腺癌(55%)中，bcl-2表达率逐渐降低，与正常粘膜增生区相比其抑制细胞凋亡的能力相对减弱，但肿瘤细胞增殖活性明显增强。在腺癌组bcl-2表达率明显低于腺瘤组(P<0.05)，并且与大肠的高分化相关。提示bcl-2表达是继p53之后大肠癌发生中的早期事件。检测bcl-2表达状况有助于大肠癌的早期诊断和预后判断。
p53和bcl-2均与细胞凋亡密切相关，本研究结果显示，在腺瘤和腺癌中bcl-2和p53基因共同表达率分别为10%和22.5%，bcl-2和p53表达呈负相关，p53在腺癌中表达率高于腺瘤组；而bcl-2正好相反，与文献报道基本一致〔6，7〕，提示在大肠腺瘤一癌序列中p53基因突变可降低bcl-2表达潜能，有利于细胞的恶性转化。进一步研究表明，单纯p53缺乏的小鼠bcl-2表达增加，bcl-2表达可抑制p53基因诱导的凋亡反应〔8〕。因此联合检测大肠肿瘤中p53和bcl-2表达状况，有助于大肠癌的早期诊断和预后判断。
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基金项目：安徽省卫生厅基金资助课题(A95-1998-23)
作者简介：曹立宇，男，29岁，硕士。研究方向：大肠肿瘤病理学
参考文献
1，Baker SJ, Preisinger AC,Jessup JM et al.p53 gene mutation occur combination with 17p allelic deletions as late event in colorectal tumorigenesis.Cancer Res,1990;50(23)7717～7722
2，Michalovitz D, Halevy O,Oren M.Conditional inhibition of transformation and of cell proliferation by a temperature sensitive mutant of p53. Cell，1990;62(4):671～680
, 百拇医药
3，Fearon ER, Vogelstein B.A genetic model for colorectal tumorigenesis.Cell，1990;61(5):759～767
4，Poller DN,Baxter KJ,Shepherd NA.p53 and Rb1 protein expression:are they prognostically useful in colorectal cancer? Br J Cancer,1997;75(1):87～93
5，Watson AJ, Merritt AJ,Jones LS et al.Evidence for reciprocity of bcl-2 and p53 expression in human colorectal adenomas and carcinomas.Br J Cancer,1996;73(8):889～895
, 百拇医药
6，Sinicrope FA, Ruan SB,Cleary KR et al.bcl-2 and p53 oncoprotein expression during colorectal tumorigenesis.Cancer Res,1995;55(2):237～241
7，Schneider HJ, Sampson SA,Cunningham D et al.bcl-2 expression and response to chemotherapy in colorectal adenocarcinomas.Br J Cancer,1997;75(3):427～431
8，Miyashita T，Krajewshi S，Krajewsha M et al.Tumor suppressor p53 is a regulator of bcl-2 and bax gene expression in vitro and in vivo.Oncogene，1994;9(6):1799～1805
收稿日期：1999-08-12
修回日期：1999-12-10, 百拇医药