低分子肝素治疗大鼠阿霉素肾病的量效观察
作者：林志翔 袁志忠 梅长林 林志跃 高国华 张晓英 许静
单位：袁志忠(第二军医大学长征医院肾内科，上海 200003)；梅长林(第二军医大学长征医院肾内科，上海 200003)；林志跃(第二军医大学长征医院肾内科,上海 200003)；高国华 (第二军医大学长征医院肾内科，上海 200003)；林志翔(解放军第147医院，厦门 361003)
关键词：肾病综合征；肝素，低分子量
第二军医大学学报000336 【中图分类号】 R 692.05 【文献标识码】 B 文章编号：0258-879X(2000)03-0296-02▲
肾病综合征常合并高凝状态，易致血栓形成，成人发生率为10%～40%[1]，儿童发生率为1.8～5.0%[2]，严重影响其治疗效果及预后，是肾病综合征患者常见的致残、致死的原因之一。低分子肝素具有抗凝、抗栓、促纤溶、抗炎、抑制细胞增殖、改善脂代谢等作用，近来用于治疗肾小球疾病，但其抗凝治疗的剂量、疗程等问题仍未解决。为探讨低分子肝素治疗肾病综合征的量效关系，我们以不同剂量的低分子肝素治疗大鼠阿霉素肾病，现报告如下。
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1 材料和方法
1.1 动物和药品 健康SD雄性大鼠80只，体质量220～250 g，由上海计划生育研究所动物中心提供。阿霉素针剂为深圳药业有限公司产品，低分子肝素由法玛西亚普强公司提供，批号17578A51，商品名为法安明(Fragmin)。
1.2 动物模型建立 大鼠尾静脉一次性注入阿霉素6.5 mg/kg，以标准饲料饲养，自由摄食及饮水，存活的大鼠于注射药后第7，14天放入代谢笼中，留24 h尿蛋白定量，如尿蛋白>100 mg/24 h，为模型复制成功，随机分为4组，每组17只。
1.3 治疗给药方法 对照组予0.9% NaCl注射液1 ml，腹腔注射，每日1次。治疗Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ组分别予低分子肝素100，200，400 U/kg，腹腔注射，每日1次，疗程为1个月。
1.4 观察指标 所有存活大鼠于实验结束时，留24 h尿蛋白定量(3%磺柳酸法)。抽血测血浆总蛋白(TP，双缩尿法)、白蛋白(ALB，溴甲酚绿法)，三酰甘油(TG，甘油磷酸氧化酸法)，总胆固醇(TC，酶法)，高密度脂蛋白(HDL-ch)，低密度脂蛋白(LDL-ch)，脂蛋白α(LPα)，凝血因子Ⅹ活性(FⅩα，凝固法)，凝血因子Ⅱ活性(FⅡα，凝固法)，并处死大鼠，取肾组织电镜检查。
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1.5 统计学处理 计量资料以
±s表示，采用Number cruncher statistical system统计软件处理。
2 结 果
2.1 尿、血生化、凝血指标 与对照组比较，治疗Ⅱ，Ⅲ组的尿蛋白明显减少(P<0.01)，血浆蛋白明显升高(P<0.05)；治疗组Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ组的TC，LDL-ch和FⅡα活性明显降低(P<0.05，0.01)。与治疗Ⅰ组比较，治疗Ⅲ组的FⅩa和FⅡa活性明显下降(P<0.05，表1)。
表1 样品含量测定结果(n=3,±s) 组别
n
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尿蛋白
(mg/24 h)
TP
(ρB/g.L-1)
ALB
(ρB/g.L-1)
TG
(cB/
mmol.L-1)
TC
, 百拇医药
(cB/
mmol.L-1)
HDL-ch
(cB/
mmol.L-1)
LDL-ch
(cB/
mmol.L-1)
LPα
(ρB/g.L-1)
, 百拇医药
FⅩα
(%)
FⅡα
(%)
对照组
6
320±92
51.0±3.6
19.2±2.2
4.2±3.1
5.5±2.9
1.9±1.1
1.5±0.6
, 百拇医药
35.6±12.1
111.8±6.7
110±5
治疗Ⅰ组
10
305±102
53.0±3.4
21.2±1.5
2.2±1.2
3.2±0.7*
2.2±0.5
0.8±0.1*
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28.8±9.5
73.7±4.0*
84±2*
治疗Ⅱ组
11
162±70**
58.5±1.6*
22.7±1.6*
1.9±0.7*
2.6±0.7*
, 百拇医药
1.5±0.5
0.6±0.1*
26.2±0.5
66.8±0.2*
75±8*
治疗Ⅲ组
11
184±87**
57.4±1.9*
22.6±1.7*
1.9±0.8*
, http://www.100md.com
2.6±1.4*
1.6±0.6
0.7±0.2*
24.3±11.7
58.9±2.3* * △
64±5* * △
*P<0.05， **P<0.01 与对照组比较；△P<0.05 与治疗Ⅰ组比较
2.2 病理学检查 透射电镜示，对照组的肾小球上皮细胞肿胀，空泡形成，广泛足突融合；而治疗Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ组的肾小球上皮细胞轻度肿胀、空泡形成，足突部分融合。
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2.3 存活率 对照组死亡11只，存活率35%，而治疗Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ组死亡分别为7，6，6只，存活率分别为59%，65%，65%，治疗Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ组的存活率明显高于对照组(P<0.05)，治疗Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ组间的存活率无明显差异(P>0.05)。
2.4 副作用 治疗Ⅲ组有鼻、口腔出血现象，但无确切证据表明其导致大鼠死亡。
3 讨 论
实验研究和临床观察证实，在激素及其他免疫抑制剂治疗的同时加用抗凝剂，可使尿蛋白排泄量减少，肾功能改善，而肝素则是其中最常用的抗凝药。低分子肝素是通过酶法或层析法从普通肝素中获得的，为带阴电荷的糖蛋白，具有抗凝、抗炎、降脂、抑制细胞增殖及恢复GBM负电荷屏障的作用。它以抗FⅩα活性为主，抗FⅩα活性和抗FⅡα活性分别为2～5和1，生物利用度高达98%，半衰期为普通肝素的2～4倍。具有血小板减少发生率低，自发性出血倾向小，长期应用无脱发、骨质疏松等副作用，延长KPTT不明显，无需实验室监测等优点。国外已普遍用于防治血栓栓塞并发症[3]，也用于治疗肾病综合征[4，5]，但未见报道对肾病综合征的尿蛋白、血浆蛋白、血脂及对肾小球滤过膜的影响，以及量效关系。我们选择类似人类微小病变的阿霉素肾病大鼠模型，给予不同剂量的低分子肝素治疗，结果发现低分子肝素治疗能明显地改善蛋白尿、低蛋白血症、高脂血症和高凝状态，减轻肾小球滤过膜的损害。其疗效与剂量有关，在低剂量时(100 U/kg)低分子肝素主要起降低胆固醇、LDL-ch和抗FⅩα，FⅡα的作用；中剂量时(200 U/kg)，除上述作用外，还具有降低尿蛋白和升高血浆蛋白的作用；大剂量时(400 U/kg)，其抗FⅩα，FⅡα作用明显增强，但其他疗效同中等剂量相当，未见明显增强。低分子肝素为带阴电荷的糖蛋白，可增加滤过膜的负电荷，恢复GBM的负电荷屏障，小剂量时恢复GBM负电荷屏障作用不大，而大、中剂量恢复GBM负电荷屏障作用较大，所以，小剂量时尿蛋白无明显减少，中大剂量时尿蛋白明显减少。低分子肝素通过与AT-Ⅲ结合成复合物而具有抗凝作用，其复合物平均解离常数为4.5×105 mmol/L，所以，中、大剂量，尤其是大剂量时，其抗凝效果显著增强。肾病综合征出现高脂血症的发生机制还不太清楚，可能与低蛋白血症、胶体渗透压下降以及脂蛋白脂酶(LPL)和肝脏-三酰甘油酶(HTGL)活力下降等因素有关[6]，低分子肝素治疗肾病综合征时可能通过促进LPL的释放和保护其活性而起降低血脂作用。本实验观察到血脂的变化与文献报道[7]有些差异，未观察到血清三酰甘油、脂蛋白(α)的显著变化，可能与我们观察的疗程太短有关。
, 百拇医药
阿霉素属氨基核苷类物质，可能在体内代谢产生自由基和脂质过氧化物，使肾小球上皮细胞病理改变及基底膜和上皮细胞阴离子屏障减退，甚至消失，而低分子肝素为带阴电荷的糖蛋白，可能通过恢复GBM的阴电荷屏障，使肾小球上皮细胞肿胀减轻、足突融合减少，这可通过Alician blue染色观察肾小球基底膜负电荷着色多少来证实，有待以后进一步研究。本实验研究结果提示，低分子肝素能改善阿霉素肾病大鼠的尿蛋白、低蛋白血症、高脂血症以及肾小球滤过膜病变，治疗时以中等剂量疗效最佳，而大剂量可能对肾病综合征合并深静脉血栓的治疗有益。■
作者简介:林志翔(1962-),男(汉族)，副主任医师
张晓英(第二军医大学长海医院肾内科)
许静(第二军医大学长海医院肾内科)
【参 考 文 献】
, http://www.100md.com
[1] Sagripanti A, Barsotti G. Hypercoagulability, intraglomerular coagulation and thromboembolism in nephrotic syndrome[J]. Nephron, 1995, 70(3):271-281.
[2] Harri RC, Ismail N. Extrarenal complications of the nephrotic syndrome[J]. Am J Kidney Dis, 1994, 23(4): 477-497.
[3] 尤 蓓. 低分子量肝素与心血管疾病[J]. 国外医学.心血管疾病分册，1997，24(1)：19-22.
[4] Rostoker G, Durand Z, Petit P, et al. Prevention thrombotic complications of the nephrotic syndrome by the low-molecular-weight heparin Enoxaparin[J]. Nephron, 1995, 69(1):20-28.
, http://www.100md.com
[5] Alhenc-Gelas M, Rossert J, Jacquot C, et al. Pharmacokinetic study of the low-molecular-weight heparin in patients with nephrotic syndrome[J]. Nephron, 1995, 71(2): 149-152.
[6] 李 霖，崔若兰. 大鼠阿霉素肾病中三种脂酶的变化[J]. 中华肾脏病杂志，1997，13(3)：171.
[8] Schmitt Y, Schneider H. Low-molecular-weight heparin (LMWH): influence on blood lipid in patients on chronic haemodialysis[J]. Nephrol Dial Transplant, 1993, 8(5):438-442.
【收稿日期】 1999-08-11
【修回日期】 1999-11-21, 百拇医药
单位：袁志忠(第二军医大学长征医院肾内科，上海 200003)；梅长林(第二军医大学长征医院肾内科，上海 200003)；林志跃(第二军医大学长征医院肾内科,上海 200003)；高国华 (第二军医大学长征医院肾内科，上海 200003)；林志翔(解放军第147医院，厦门 361003)
关键词：肾病综合征；肝素，低分子量
第二军医大学学报000336 【中图分类号】 R 692.05 【文献标识码】 B 文章编号：0258-879X(2000)03-0296-02▲
肾病综合征常合并高凝状态，易致血栓形成，成人发生率为10%～40%[1]，儿童发生率为1.8～5.0%[2]，严重影响其治疗效果及预后，是肾病综合征患者常见的致残、致死的原因之一。低分子肝素具有抗凝、抗栓、促纤溶、抗炎、抑制细胞增殖、改善脂代谢等作用，近来用于治疗肾小球疾病，但其抗凝治疗的剂量、疗程等问题仍未解决。为探讨低分子肝素治疗肾病综合征的量效关系，我们以不同剂量的低分子肝素治疗大鼠阿霉素肾病，现报告如下。
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1 材料和方法
1.1 动物和药品 健康SD雄性大鼠80只，体质量220～250 g，由上海计划生育研究所动物中心提供。阿霉素针剂为深圳药业有限公司产品，低分子肝素由法玛西亚普强公司提供，批号17578A51，商品名为法安明(Fragmin)。
1.2 动物模型建立 大鼠尾静脉一次性注入阿霉素6.5 mg/kg，以标准饲料饲养，自由摄食及饮水，存活的大鼠于注射药后第7，14天放入代谢笼中，留24 h尿蛋白定量，如尿蛋白>100 mg/24 h，为模型复制成功，随机分为4组，每组17只。
1.3 治疗给药方法 对照组予0.9% NaCl注射液1 ml，腹腔注射，每日1次。治疗Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ组分别予低分子肝素100，200，400 U/kg，腹腔注射，每日1次，疗程为1个月。
1.4 观察指标 所有存活大鼠于实验结束时，留24 h尿蛋白定量(3%磺柳酸法)。抽血测血浆总蛋白(TP，双缩尿法)、白蛋白(ALB，溴甲酚绿法)，三酰甘油(TG，甘油磷酸氧化酸法)，总胆固醇(TC，酶法)，高密度脂蛋白(HDL-ch)，低密度脂蛋白(LDL-ch)，脂蛋白α(LPα)，凝血因子Ⅹ活性(FⅩα，凝固法)，凝血因子Ⅱ活性(FⅡα，凝固法)，并处死大鼠，取肾组织电镜检查。
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1.5 统计学处理 计量资料以
±s表示，采用Number cruncher statistical system统计软件处理。2 结 果
2.1 尿、血生化、凝血指标 与对照组比较，治疗Ⅱ，Ⅲ组的尿蛋白明显减少(P<0.01)，血浆蛋白明显升高(P<0.05)；治疗组Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ组的TC，LDL-ch和FⅡα活性明显降低(P<0.05，0.01)。与治疗Ⅰ组比较，治疗Ⅲ组的FⅩa和FⅡa活性明显下降(P<0.05，表1)。
表1 样品含量测定结果(n=3,
±s) 组别n
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尿蛋白
(mg/24 h)
TP
(ρB/g.L-1)
ALB
(ρB/g.L-1)
TG
(cB/
mmol.L-1)
TC
, 百拇医药
(cB/
mmol.L-1)
HDL-ch
(cB/
mmol.L-1)
LDL-ch
(cB/
mmol.L-1)
LPα
(ρB/g.L-1)
, 百拇医药
FⅩα
(%)
FⅡα
(%)
对照组
6
320±92
51.0±3.6
19.2±2.2
4.2±3.1
5.5±2.9
1.9±1.1
1.5±0.6
, 百拇医药
35.6±12.1
111.8±6.7
110±5
治疗Ⅰ组
10
305±102
53.0±3.4
21.2±1.5
2.2±1.2
3.2±0.7*
2.2±0.5
0.8±0.1*
, http://www.100md.com
28.8±9.5
73.7±4.0*
84±2*
治疗Ⅱ组
11
162±70**
58.5±1.6*
22.7±1.6*
1.9±0.7*
2.6±0.7*
, 百拇医药
1.5±0.5
0.6±0.1*
26.2±0.5
66.8±0.2*
75±8*
治疗Ⅲ组
11
184±87**
57.4±1.9*
22.6±1.7*
1.9±0.8*
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2.6±1.4*
1.6±0.6
0.7±0.2*
24.3±11.7
58.9±2.3* * △
64±5* * △
*P<0.05， **P<0.01 与对照组比较；△P<0.05 与治疗Ⅰ组比较
2.2 病理学检查 透射电镜示，对照组的肾小球上皮细胞肿胀，空泡形成，广泛足突融合；而治疗Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ组的肾小球上皮细胞轻度肿胀、空泡形成，足突部分融合。
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2.3 存活率 对照组死亡11只，存活率35%，而治疗Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ组死亡分别为7，6，6只，存活率分别为59%，65%，65%，治疗Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ组的存活率明显高于对照组(P<0.05)，治疗Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ组间的存活率无明显差异(P>0.05)。
2.4 副作用 治疗Ⅲ组有鼻、口腔出血现象，但无确切证据表明其导致大鼠死亡。
3 讨 论
实验研究和临床观察证实，在激素及其他免疫抑制剂治疗的同时加用抗凝剂，可使尿蛋白排泄量减少，肾功能改善，而肝素则是其中最常用的抗凝药。低分子肝素是通过酶法或层析法从普通肝素中获得的，为带阴电荷的糖蛋白，具有抗凝、抗炎、降脂、抑制细胞增殖及恢复GBM负电荷屏障的作用。它以抗FⅩα活性为主，抗FⅩα活性和抗FⅡα活性分别为2～5和1，生物利用度高达98%，半衰期为普通肝素的2～4倍。具有血小板减少发生率低，自发性出血倾向小，长期应用无脱发、骨质疏松等副作用，延长KPTT不明显，无需实验室监测等优点。国外已普遍用于防治血栓栓塞并发症[3]，也用于治疗肾病综合征[4，5]，但未见报道对肾病综合征的尿蛋白、血浆蛋白、血脂及对肾小球滤过膜的影响，以及量效关系。我们选择类似人类微小病变的阿霉素肾病大鼠模型，给予不同剂量的低分子肝素治疗，结果发现低分子肝素治疗能明显地改善蛋白尿、低蛋白血症、高脂血症和高凝状态，减轻肾小球滤过膜的损害。其疗效与剂量有关，在低剂量时(100 U/kg)低分子肝素主要起降低胆固醇、LDL-ch和抗FⅩα，FⅡα的作用；中剂量时(200 U/kg)，除上述作用外，还具有降低尿蛋白和升高血浆蛋白的作用；大剂量时(400 U/kg)，其抗FⅩα，FⅡα作用明显增强，但其他疗效同中等剂量相当，未见明显增强。低分子肝素为带阴电荷的糖蛋白，可增加滤过膜的负电荷，恢复GBM的负电荷屏障，小剂量时恢复GBM负电荷屏障作用不大，而大、中剂量恢复GBM负电荷屏障作用较大，所以，小剂量时尿蛋白无明显减少，中大剂量时尿蛋白明显减少。低分子肝素通过与AT-Ⅲ结合成复合物而具有抗凝作用，其复合物平均解离常数为4.5×105 mmol/L，所以，中、大剂量，尤其是大剂量时，其抗凝效果显著增强。肾病综合征出现高脂血症的发生机制还不太清楚，可能与低蛋白血症、胶体渗透压下降以及脂蛋白脂酶(LPL)和肝脏-三酰甘油酶(HTGL)活力下降等因素有关[6]，低分子肝素治疗肾病综合征时可能通过促进LPL的释放和保护其活性而起降低血脂作用。本实验观察到血脂的变化与文献报道[7]有些差异，未观察到血清三酰甘油、脂蛋白(α)的显著变化，可能与我们观察的疗程太短有关。
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阿霉素属氨基核苷类物质，可能在体内代谢产生自由基和脂质过氧化物，使肾小球上皮细胞病理改变及基底膜和上皮细胞阴离子屏障减退，甚至消失，而低分子肝素为带阴电荷的糖蛋白，可能通过恢复GBM的阴电荷屏障，使肾小球上皮细胞肿胀减轻、足突融合减少，这可通过Alician blue染色观察肾小球基底膜负电荷着色多少来证实，有待以后进一步研究。本实验研究结果提示，低分子肝素能改善阿霉素肾病大鼠的尿蛋白、低蛋白血症、高脂血症以及肾小球滤过膜病变，治疗时以中等剂量疗效最佳，而大剂量可能对肾病综合征合并深静脉血栓的治疗有益。■
作者简介:林志翔(1962-),男(汉族)，副主任医师
张晓英(第二军医大学长海医院肾内科)
许静(第二军医大学长海医院肾内科)
【参 考 文 献】
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[1] Sagripanti A, Barsotti G. Hypercoagulability, intraglomerular coagulation and thromboembolism in nephrotic syndrome[J]. Nephron, 1995, 70(3):271-281.
[2] Harri RC, Ismail N. Extrarenal complications of the nephrotic syndrome[J]. Am J Kidney Dis, 1994, 23(4): 477-497.
[3] 尤 蓓. 低分子量肝素与心血管疾病[J]. 国外医学.心血管疾病分册，1997，24(1)：19-22.
[4] Rostoker G, Durand Z, Petit P, et al. Prevention thrombotic complications of the nephrotic syndrome by the low-molecular-weight heparin Enoxaparin[J]. Nephron, 1995, 69(1):20-28.
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[5] Alhenc-Gelas M, Rossert J, Jacquot C, et al. Pharmacokinetic study of the low-molecular-weight heparin in patients with nephrotic syndrome[J]. Nephron, 1995, 71(2): 149-152.
[6] 李 霖，崔若兰. 大鼠阿霉素肾病中三种脂酶的变化[J]. 中华肾脏病杂志，1997，13(3)：171.
[8] Schmitt Y, Schneider H. Low-molecular-weight heparin (LMWH): influence on blood lipid in patients on chronic haemodialysis[J]. Nephrol Dial Transplant, 1993, 8(5):438-442.
【收稿日期】 1999-08-11
【修回日期】 1999-11-21, 百拇医药