基因组文库及基因小库构建在基因克隆中的应用
作者：张平武 邹蓓艳 王慧丽 孙树汉
单位：张平武(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室,上海 200433)；王慧丽(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室,上海 200433)；孙树汉(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室,上海 200433)；邹蓓艳(复旦大学业遗传所)
关键词：基因小库；基因克隆
第二军医大学学报000334 【中图分类号】 Q 785 【文献标识码】 B 【文章编号】 0258-879X(2000)03-0299-02▲
在基因克隆的方法选择中，构建基因组文库并筛选是克隆完整基因的经典方法, 但构建基因组文库技术复杂，步骤繁琐。若构建的文库不够大，常筛选不到所需的目的基因。因此我们尝试用另一种方法，即在试探性的Southern blot基础上构建基因小库，从中筛选目的基因,可以大大减少筛库的工作量并提高筛到目的基因的成功率。现以克隆酵母Candida kefyr 的菊粉酶全基因为例将这两种方法加以比较。
, http://www.100md.com
1 方法与结果
1.1 菌株、质粒 酵母Candida kefyr菌和质粒 pUC118 及pSK1为本室保存的菌株和质粒。大肠杆菌完全培养液LB：1% polypepton, 1% NaCl, 0.5% yeast extract(pH 7.0)。酵母菌完全培养液YEPD: 1% yeast extract, 2% polypeptone, 2% glucose。
1.2 提取Candida kefyr基因组DNA 参考文献[1]并做部分修改。
1.3 基因组文库构建
1.3.1 建立总DNA不完全酶切的条件 取酵母基因组总DNA 10 μg，加入10×缓冲液15 μl、无菌水至总体积为150 μl。分装于9个微离心管，使第9管含30 μl，第2～8管各含15 μl。取Sau 3A Ⅰ酶4 U加入第9管,混匀后吸出15 μl，加入第8管, 依次直至第2管，第1管中不加酶作为对照。全部9管置37℃水浴1 h后电泳分析，以主要降解片段集中在10 kb左右的酶浓度为最适，见图1。
, 百拇医药
1.3.2 放大量部分酶切 按最适条件放大，酶切总DNA 200 μg，实际操作时酶浓度减少1个梯度以免酶切过度。
1.3.3 蔗糖密度梯度离心回收10 kb DNA片段 在梯度形成仪制成10%～40%的连续蔗糖梯度，收集在4个38 ml离心管内。每管顶层加入1.2 ml待分离放大酶切DNA样品。超高速(2.6×104 r/min)离心24 h。插入硅胶管以1 ml/min汲取梯度分离组分，每管收0.5 ml,按顺序编号。电泳检查分离效果(图2)，说明部分酶切的DNA样品已得到较好分离。
图1 总DNA的部分酶切
1～9：不同酶量消化结果；10:λDNA/HindⅢ相对分子质量标准
1.3.4 样品透析去蔗糖 参考文献[2]，收集的DNA样品按4～8 kb,8～13 kb,13～18 kb分别合并成3组，装入3个透析袋中对2 000 ml TE(pH 8.0) 透析24 h，期间更换数次TE。透析后DNA样品用正丁醇浓缩至体积为5 ml，等体积乙醚抽提2次，无水乙醇沉淀，溶于TE(pH 8.0)备用。
, 百拇医药
图2 蔗糖密度梯度分离的不同DNA片段
1～6及8～14: 梯度分离的不同DNA片段；
7: λDNA/Hind Ⅲ 相对分子质量标准
1.3.5 载体处理 pSK1 DNA用BamH Ⅰ酶切并去磷。
1.3.6 连接与转化 收集的外源片段DNA与载体按4∶1的摩尔比连接。连接产物转化DH5α菌，获得12 670个菌落，构成基因组文库，经检验重组菌落的比率为84%。
1.4 基因小库构建
1.4.1 酶切总DNA和 Southern blot 选用不同酶酶切总DNA，接近完全酶切。核素标记合成的寡核苷酸作探针，做不同酶酶切总DNA的Southern blot。我们发现BamH Ⅰ酶切效果较好，在9 kb处有单一杂交带，见图3。
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图3 总DNA的Southern blot分析
1:总DNA BamH Ⅰ酶切；2: λDNA/Hind Ⅲ相对
分子质量标准；3,4: Southern blot
1.4.2 合适片段回收 以BamH Ⅰ 大量酶切总DNA，按标尺收集对应于杂交带同样大小的DNA片段(约9 kb)。
1.4.3 载体处理 pUC118 DNA用BamH Ⅰ 酶切并去磷。
1.4.4 连接与转化 收集的外源片段DNA与载体按4∶1的摩尔比连接。连接产物转化DH5α菌，获得3 260个克隆，构成基因小库。
1.5 两种文库中含目的基因克隆的筛选 以核素标记合成的寡核苷酸作探针，采用菌落原位杂交的方法，从基因组文库中筛到含完整目的基因的克隆A37。经鉴定，该克隆含1.7 kb编码区、3.2 kb上游序列和1.7 kb的下游序列。从基因小库中筛到含完整目的基因的克隆4个(图4)。经鉴定，他们为相同克隆，均含1.7 kb编码区、4.3 kb上游序列和2.5 kb的下游序列。
, 百拇医药
图4 原位杂交获得阳性克隆
克隆1～4: 来自基因小库的阳性克隆；克隆B: 阴性对照；
克隆A: 来自基因组文库的阳性克隆
2 讨 论
理论上构建基因组文库并筛选的方法用以克隆基因有通用性强、成功率高的优点，但实际构建基因组文库过程复杂，费时且技术难度较大。在DNA不全酶切、蔗糖梯度回收、离心后的分段收集的过程中都需十分小心，而且需要超高速离心机、蔗糖梯度形成仪等特殊仪器。
按公式N=ln(1-P)/ln(1-f)计算，要获得99%的概率检出基因组文库存在的10 kb片段，需重组克隆数6 905个。在大片段(超过8 kb)的连接和转化过程中不易获得足够的克隆数,从而影响克隆目的基因的成功率。
, 百拇医药
相反，基因小库构建技术难度小，过程相对简单，原位杂交筛选的工作量小，成功率高。关键性步骤在于Southern blot的结果，一旦找到某个酶能够产生单一Southern blot带，回收相应分子质量条带做连接转化就比较容易。由于针对性强，缩小了包围圈，筛到目的基因所需要的克隆数大大减少。
如果只需要克隆某一个特定基因，构建基因小库是快速有效的办法，但是克隆几个基因时需要重复做，而构建基因组文库一次则可克隆多个基因，因此，两者各有利弊，实际操作中可按需取舍。■
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670659)
作者简介:张平武(1965-),男(汉族),博士,讲师
【参 考 文 献】
[1] Harald R, Gotthard K. Cloning and characterization of a TEF gene for elongation factor 1α from the yeast Arxula adeninivorans[J]. Current Genetics, 1995,28:360-366.
[2] 霍克克, 唐南筠, 虞兰兰, 等. 脆壁克鲁维酵母LAC4基因的克隆与表达[J]. 中国科学B辑, 1995,25(5):149-153.
【收稿日期】 1999-09-06
【修回日期】 2000-02-20, http://www.100md.com
单位：张平武(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室,上海 200433)；王慧丽(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室,上海 200433)；孙树汉(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室,上海 200433)；邹蓓艳(复旦大学业遗传所)
关键词：基因小库；基因克隆
第二军医大学学报000334 【中图分类号】 Q 785 【文献标识码】 B 【文章编号】 0258-879X(2000)03-0299-02▲
在基因克隆的方法选择中，构建基因组文库并筛选是克隆完整基因的经典方法, 但构建基因组文库技术复杂，步骤繁琐。若构建的文库不够大，常筛选不到所需的目的基因。因此我们尝试用另一种方法，即在试探性的Southern blot基础上构建基因小库，从中筛选目的基因,可以大大减少筛库的工作量并提高筛到目的基因的成功率。现以克隆酵母Candida kefyr 的菊粉酶全基因为例将这两种方法加以比较。
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1 方法与结果
1.1 菌株、质粒 酵母Candida kefyr菌和质粒 pUC118 及pSK1为本室保存的菌株和质粒。大肠杆菌完全培养液LB：1% polypepton, 1% NaCl, 0.5% yeast extract(pH 7.0)。酵母菌完全培养液YEPD: 1% yeast extract, 2% polypeptone, 2% glucose。
1.2 提取Candida kefyr基因组DNA 参考文献[1]并做部分修改。
1.3 基因组文库构建
1.3.1 建立总DNA不完全酶切的条件 取酵母基因组总DNA 10 μg，加入10×缓冲液15 μl、无菌水至总体积为150 μl。分装于9个微离心管，使第9管含30 μl，第2～8管各含15 μl。取Sau 3A Ⅰ酶4 U加入第9管,混匀后吸出15 μl，加入第8管, 依次直至第2管，第1管中不加酶作为对照。全部9管置37℃水浴1 h后电泳分析，以主要降解片段集中在10 kb左右的酶浓度为最适，见图1。
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1.3.2 放大量部分酶切 按最适条件放大，酶切总DNA 200 μg，实际操作时酶浓度减少1个梯度以免酶切过度。
1.3.3 蔗糖密度梯度离心回收10 kb DNA片段 在梯度形成仪制成10%～40%的连续蔗糖梯度，收集在4个38 ml离心管内。每管顶层加入1.2 ml待分离放大酶切DNA样品。超高速(2.6×104 r/min)离心24 h。插入硅胶管以1 ml/min汲取梯度分离组分，每管收0.5 ml,按顺序编号。电泳检查分离效果(图2)，说明部分酶切的DNA样品已得到较好分离。
图1 总DNA的部分酶切
1～9：不同酶量消化结果；10:λDNA/HindⅢ相对分子质量标准
1.3.4 样品透析去蔗糖 参考文献[2]，收集的DNA样品按4～8 kb,8～13 kb,13～18 kb分别合并成3组，装入3个透析袋中对2 000 ml TE(pH 8.0) 透析24 h，期间更换数次TE。透析后DNA样品用正丁醇浓缩至体积为5 ml，等体积乙醚抽提2次，无水乙醇沉淀，溶于TE(pH 8.0)备用。
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图2 蔗糖密度梯度分离的不同DNA片段
1～6及8～14: 梯度分离的不同DNA片段；
7: λDNA/Hind Ⅲ 相对分子质量标准
1.3.5 载体处理 pSK1 DNA用BamH Ⅰ酶切并去磷。
1.3.6 连接与转化 收集的外源片段DNA与载体按4∶1的摩尔比连接。连接产物转化DH5α菌，获得12 670个菌落，构成基因组文库，经检验重组菌落的比率为84%。
1.4 基因小库构建
1.4.1 酶切总DNA和 Southern blot 选用不同酶酶切总DNA，接近完全酶切。核素标记合成的寡核苷酸作探针，做不同酶酶切总DNA的Southern blot。我们发现BamH Ⅰ酶切效果较好，在9 kb处有单一杂交带，见图3。
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图3 总DNA的Southern blot分析
1:总DNA BamH Ⅰ酶切；2: λDNA/Hind Ⅲ相对
分子质量标准；3,4: Southern blot
1.4.2 合适片段回收 以BamH Ⅰ 大量酶切总DNA，按标尺收集对应于杂交带同样大小的DNA片段(约9 kb)。
1.4.3 载体处理 pUC118 DNA用BamH Ⅰ 酶切并去磷。
1.4.4 连接与转化 收集的外源片段DNA与载体按4∶1的摩尔比连接。连接产物转化DH5α菌，获得3 260个克隆，构成基因小库。
1.5 两种文库中含目的基因克隆的筛选 以核素标记合成的寡核苷酸作探针，采用菌落原位杂交的方法，从基因组文库中筛到含完整目的基因的克隆A37。经鉴定，该克隆含1.7 kb编码区、3.2 kb上游序列和1.7 kb的下游序列。从基因小库中筛到含完整目的基因的克隆4个(图4)。经鉴定，他们为相同克隆，均含1.7 kb编码区、4.3 kb上游序列和2.5 kb的下游序列。
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图4 原位杂交获得阳性克隆
克隆1～4: 来自基因小库的阳性克隆；克隆B: 阴性对照；
克隆A: 来自基因组文库的阳性克隆
2 讨 论
理论上构建基因组文库并筛选的方法用以克隆基因有通用性强、成功率高的优点，但实际构建基因组文库过程复杂，费时且技术难度较大。在DNA不全酶切、蔗糖梯度回收、离心后的分段收集的过程中都需十分小心，而且需要超高速离心机、蔗糖梯度形成仪等特殊仪器。
按公式N=ln(1-P)/ln(1-f)计算，要获得99%的概率检出基因组文库存在的10 kb片段，需重组克隆数6 905个。在大片段(超过8 kb)的连接和转化过程中不易获得足够的克隆数,从而影响克隆目的基因的成功率。
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相反，基因小库构建技术难度小，过程相对简单，原位杂交筛选的工作量小，成功率高。关键性步骤在于Southern blot的结果，一旦找到某个酶能够产生单一Southern blot带，回收相应分子质量条带做连接转化就比较容易。由于针对性强，缩小了包围圈，筛到目的基因所需要的克隆数大大减少。
如果只需要克隆某一个特定基因，构建基因小库是快速有效的办法，但是克隆几个基因时需要重复做，而构建基因组文库一次则可克隆多个基因，因此，两者各有利弊，实际操作中可按需取舍。■
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670659)
作者简介:张平武(1965-),男(汉族),博士,讲师
【参 考 文 献】
[1] Harald R, Gotthard K. Cloning and characterization of a TEF gene for elongation factor 1α from the yeast Arxula adeninivorans[J]. Current Genetics, 1995,28:360-366.
[2] 霍克克, 唐南筠, 虞兰兰, 等. 脆壁克鲁维酵母LAC4基因的克隆与表达[J]. 中国科学B辑, 1995,25(5):149-153.
【收稿日期】 1999-09-06
【修回日期】 2000-02-20, http://www.100md.com