多药耐药相关蛋白基因表达与食管癌病理特征关系的临床研究
作者：王延明 王爱民 蒋仁述 李险波 臧玉林 张国平 宋宇宏
单位：王延明(北京军区252中心医院 胸心外科)；李险波(北京军区252中心医院 胸心外科)；臧玉林(北京军区252中心医院 胸心外科)；张国平(北京军区252中心医院 胸心外科)；宋宇宏(北京军区252中心医院 胸心外科)；王爱民(中心实验室；保定 071000)
关键词：食管癌；MRP表达；病理特征
第三军医大学学报000318
提 要 目的：探讨食管癌组织中多药耐药相关蛋白基因(MRP)表达与其病理特征的关系。方法：应用逆转录多聚酶链反应(RTPCR)方法，对51例食管癌、癌旁及33枚淋巴结组织中MRP基因的表达进行检测分析。结果：食管癌组织中MRP阳性率(35.3%)高于癌旁组织(3.9%)。MRP表达阳性与肿瘤大小、病理类型及淋巴转移与否无明显关系，但TNMⅢ、Ⅳ期和肿瘤侵犯深肌层以上的MRP阳性率增高；低分化食管癌的MRP阳性分布明显高于高分化肿瘤(P< 0.05)。来自13例患者的21枚转移淋巴结中，5例癌组织MRP表达阳性的6枚转移淋巴结组织MRP均阳性，12枚非转移淋巴结中未见MRP阳性表达；对部分病例随访发现，MRP阳性者肿瘤复发、转移的发生率(42.9%)高于MRP阴性者(19%)。结论：食管癌组织中存在着原发性MRP基因表达，转移淋巴结组织的MRP基因表达与原发灶具有一致性，MRP的阳性表达除了表现肿瘤的多药耐药外，还可能是食管癌恶性行为的观察指标，提示预后不良。
, http://www.100md.com
中图法分类号 R735.102 文献标识码 A
文章编号：1000-5404(2000)03-0262-03
Relationship between expression of MRP gene and pathological features in esophageal carcinoma
WANG Yan-ming, WANG Ai-min, Jiang Ren-shu, LI Xian-bo, ZANG Yu-lin, ZHANG Guo-ping, SONG Yu-hong
(Department of Thoracic Surgery, 252 Hospital of PLA, Baoding 071000,China)
Abstract Objective: To investigate the expression of multidrug resistance associated protein MRP gene and its relation to pathological features of esophageal carcinoma. Methods: The samples of tumor tissue, paracancerous tissue and 33 lymph node from 51 patients with esophageal carcinoma were analyzed for MRP gene expression by RT-PCR. Results: The MRPpositive rate of the tumor tissue was significantly different from that of the paracancerous tissue (P< 0.05). The expression of MRP gene was not associated with tumor size, pathomorphology and lymph node metastasis. The MRP positive rate was higher in patients with tumor of stages Ⅲ and Ⅳ and deepmusclaris or fibromembrane invaded by tumor than in those with tumor at stages I and II and shallowmusclaris invasion. The positive expression of MRP was markedly higher in undifferentiated tumor than in the welldifferentiated one (P< 0.05). The MRPpositive rate of metastatic lymph nodes in MRPpositive tumor tissues was 100%. There was no positive MRP expression in nonmetastatic lymph nodes. The followup showed that the relapse or metastatic rate in MRPpositive cases was higher than that in MRPnegative ones. Conclusion: Overexpression of MRP gene in untreated esophageal carcinoma is in accordance with its metastasis to lymph nodes. It can be regarded as a prognostic marker of esophageal carcinoma.
, 百拇医药
Key words esophageal carcinoma; MRP gene expression; pathological feature
1992年，Cole等[1]研究发现非糖蛋白(P-gp)介导的肿瘤耐药细胞中多药耐药相关蛋白基因(Multidrug resistanceassociated protein,MRP)呈过度表达。之后，MRP基因表达作为肿瘤多药耐药性的又一重要影响因素引起了人们的关注。从1996年12月至1998年12月，我们采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术，检测了51例食管癌组织、癌旁及33枚肿大淋巴结组织的MRP基因表达，以探讨MRP表达与食管癌病理特征的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料
51例食管癌中，男35例，女16例，均为汉族，平均年龄58岁。全部经病理检查为食管鳞状上皮细胞癌。标本取自手术结束时肿瘤组织，癌旁组织(距离肿瘤3～5 cm)及20例患者的33枚肿大淋巴结组织各一块，迅速投入液氮保存。
, 百拇医药
1.2 主要试剂及仪器
AMV逆转录酶、MRP酶抑制剂等均购自Promega公司；毛细管PCR仪为美国ldaho公司产品；凝胶成像系统；Kodak digital science system dc-40。
1.3 RT-PCR方法
按照Chomczynski[2]方法提取组织RNA，cDNA的合成采取用20 μl逆转录反应体系，42°C反应1 h，95°C 5 min灭活AMV。RT-PCR参照Noonan[3]方法，PCR反应体系内含cDNA 2 μl，10×buffer 2 μl，4×dNTP 2 μl，MRP、β-actin引物各2 μl，Taq酶1 μl，用水补至20 μl。PCR反应在0.2 ml薄壁管中进行，毛细管PCR仪扩增反应参数为：94°C预变性2 min，94°C变性20 s，55°C退火20 s，72°C延伸30 s；30个循环；72°C后延伸7 min。
, 百拇医药
1.4 电泳及成像
PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统定量分析，MRP/β-actin比值表示MRP的相对表达水平，比值大于0.5为阳性。
1.5 统计学方法
组间阳性率比较行χ2检验。
2 结果
如图1显示了不同组织中MRP的RT-PCR扩增产物凝胶电泳结果，其扩增产物分别为234 bp和336 bp。另外，在食管癌组织中MRP阳性18例(35.3%)，癌旁组织MRP阳性2例(3.9%)，癌组织的MRP阳性率与癌旁组织比较具有显著性差异(P< 0.05)；从表1得知，肿瘤大小、病理类型及淋巴结转移与否的MRP阳性率相近；但在肿瘤侵犯粘膜下和深肌层或纤维层的阳性率(38.1%)高于肿瘤侵犯浅肌层以下者(22.2%)；TNMⅢ、Ⅳ期食管癌的MRP阳性率(42.1%)高于Ⅰ、Ⅱ期(15.4%)；在不同分化食管癌组织中，MRP阳性分布分别是：高分化鳞癌6例(24%)，中度分化鳞癌4例(33.3%)和低分化鳞癌8例(57.1%)。低分化食管癌的MRP阳性率与高分化者比较差异显著(P< 0.05)。
, 百拇医药
图1 不同组织MRP RT-PCR产物凝胶电泳照片
1、3：癌组织；2、4：相应癌旁组织；5：分子量标准
Fig 1 Electrophoretic photograph of MRP RT-PCR
prducts of different tissues
1、3：Cancer tissues；2、4：Responsive paracancerous tissues;
5：Molecular marker
表1 食管癌组织MRP表达与临床病理特征的关系
Tab1 Relationship between MEP-positive rate and
, 百拇医药
pathological features of esophageal carcinoma Factors
Tumor size
<3cm
8
3
37.5
≥3cm≤5cm
20
7
35
>5cm
23
, http://www.100md.com
8
34.8
Infiltratin depth
Mucous membrane or shallow-musclaris
9
2
22.2
Deep-muslaris or fibro-membrane
42
16
38.1
Lymph node metastasis
, http://www.100md.com
Yes
22
8
36.3
No
29
10
34.5
Pathology shape
Medullary
21
8
38.1
, 百拇医药
UIcerative
19
7
36.8
Constrictive
1
0
0
Fungting
10
3
30
TNM grade
, http://www.100md.com
Ⅰ+Ⅱ
13
3
23.1
Ⅲ+Ⅳ
38
15
39.5
Differentiation degree
Well-defferentiation
25
6
24
, 百拇医药
Moderate-differentiation
12
4
33.3
Poor-differentiation
14
8
57.1*
*：P<0.05 vs well-differentiation
在33枚肿大淋巴结组织中，病理证实为癌转移的21枚(取自13例患者)，其中5例癌组织MRP阳性的6枚转移淋巴结组织均阳性，而12枚非转移淋巴结组织(其中5枚来自癌组织MRP阳性者)未检测到MPR阳性表达。35例经术后1～2年追踪随防，14例食管癌组织MRP阳性者，1例复发、5例远处转移，发生率为42.9%。其中转移淋巴结组织MRP阳性4例，3例在术后1年内发生肿瘤复发或转移死亡。而同期随访的21例MRP阴性者，4例复发或转移，发生率为19%。
, 百拇医药
3 讨论
肿瘤细胞的多药耐药性(MDR)机制复杂，多药耐药基因(MDR1)作为重要的耐药原因已被公认。而MRP作为影响MDR表型的又一重要因素，特别是在血液肿瘤中的研究较多。但在食管癌组织中，MRP基因表达与其病理特征关系的研究甚少。本研究发现，食管癌组织中MRP表达增高，与癌旁组织比较具有显著性差异(P<0.05)，说明病情发展过程中，肿瘤细胞自身MRP基因扩增的结果，并可能是食管癌化疗效果不佳的原因之一。
有人认为MRP在晚期肿瘤中表达增高，并可反应肿瘤的浸润、转移及预后差的生物学特性[4]。本组资料显示，肿瘤大小和大体类型不同的食管癌组织中MRP阳性率相近，但在肿瘤侵犯深肌层以上的MRP阳性率(38.1%)高于侵犯粘膜下和浅肌层者(22.2%)，Ⅲ、Ⅳ期食管癌的MRP阳性率(39.5%)也高于Ⅰ、Ⅱ期(23.1%)，这一结果符合上述报道。另外，MRP阳性还较多分布于低分化肿瘤中，这说明MRP基因表达不仅表现了食管癌的多药耐药性，还可能反映了肿瘤细胞的恶性行为。
, 百拇医药
由本组资料的整体分析看，癌组织中MRP阳性与淋巴结转移与否并无明显关系，但转移淋巴结组织MRP基因表达与相应癌组织具有一致性。本组取自5例癌组织MRP阳性患者的6枚转移淋巴结均阳性，而且这5例转移淋巴结阳性患者，经随访4例，3例在术后1年内肿瘤复发或转移死亡。这提示转移淋巴结中MRP阳性是肿瘤侵犯淋巴组织的信号，可致肿瘤术后早期复发和转移。并且术后随访结果还显示，癌组织MRP表达阳性的肿瘤复发、转移率(42.9%)高于MRP阴性者(19%)，其转移淋巴结组织MRP阳性患者，肿瘤的复发或转移发生早。
作者简介：王延明(1961)，男，山东省人，主治医师，主要从事胸部肿瘤多药耐药方面的研究，发表论文45篇。
作者单位：蒋仁述(白求恩国际和平医院，石家庄 050081)
参考文献
[1] Cole S P C, Bhardwaj G, Gerlach J H, et al. Overexpression of a transporter gene in multidrugresistant human lung cancer cell line[J]. Science,1992,258(10):1 650-1 654.
, 百拇医药
[2] Chomczynski P, Sacchi N. Singe step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyantephenolchloroform extraction[J]. Analytical Biochemistry,1987,162(1):156-157.
[3] Noonan K E, Bech C, Holzmayer T A, et al. Quantitative analysis of MDR1 gene expression in human tumor by poly merase chain reaction[J], Proc Natl Acad Sci USA,1990, 87(18):7 160-7 163.
[4] Krishnamachary N, Center M S. The MRP gene associated with a non-p-glycoprotein multidrug resistance encodes-a-190KDa membrane bound glycoprotein[J]. Cancer Res,1993,53(7):3 658-3 662.
收稿日期：1999-06-07；修回日期：1999-12-21, 百拇医药
单位：王延明(北京军区252中心医院 胸心外科)；李险波(北京军区252中心医院 胸心外科)；臧玉林(北京军区252中心医院 胸心外科)；张国平(北京军区252中心医院 胸心外科)；宋宇宏(北京军区252中心医院 胸心外科)；王爱民(中心实验室；保定 071000)
关键词：食管癌；MRP表达；病理特征
第三军医大学学报000318
提 要 目的：探讨食管癌组织中多药耐药相关蛋白基因(MRP)表达与其病理特征的关系。方法：应用逆转录多聚酶链反应(RTPCR)方法，对51例食管癌、癌旁及33枚淋巴结组织中MRP基因的表达进行检测分析。结果：食管癌组织中MRP阳性率(35.3%)高于癌旁组织(3.9%)。MRP表达阳性与肿瘤大小、病理类型及淋巴转移与否无明显关系，但TNMⅢ、Ⅳ期和肿瘤侵犯深肌层以上的MRP阳性率增高；低分化食管癌的MRP阳性分布明显高于高分化肿瘤(P< 0.05)。来自13例患者的21枚转移淋巴结中，5例癌组织MRP表达阳性的6枚转移淋巴结组织MRP均阳性，12枚非转移淋巴结中未见MRP阳性表达；对部分病例随访发现，MRP阳性者肿瘤复发、转移的发生率(42.9%)高于MRP阴性者(19%)。结论：食管癌组织中存在着原发性MRP基因表达，转移淋巴结组织的MRP基因表达与原发灶具有一致性，MRP的阳性表达除了表现肿瘤的多药耐药外，还可能是食管癌恶性行为的观察指标，提示预后不良。
, http://www.100md.com
中图法分类号 R735.102 文献标识码 A
文章编号：1000-5404(2000)03-0262-03
Relationship between expression of MRP gene and pathological features in esophageal carcinoma
WANG Yan-ming, WANG Ai-min, Jiang Ren-shu, LI Xian-bo, ZANG Yu-lin, ZHANG Guo-ping, SONG Yu-hong
(Department of Thoracic Surgery, 252 Hospital of PLA, Baoding 071000,China)
Abstract Objective: To investigate the expression of multidrug resistance associated protein MRP gene and its relation to pathological features of esophageal carcinoma. Methods: The samples of tumor tissue, paracancerous tissue and 33 lymph node from 51 patients with esophageal carcinoma were analyzed for MRP gene expression by RT-PCR. Results: The MRPpositive rate of the tumor tissue was significantly different from that of the paracancerous tissue (P< 0.05). The expression of MRP gene was not associated with tumor size, pathomorphology and lymph node metastasis. The MRP positive rate was higher in patients with tumor of stages Ⅲ and Ⅳ and deepmusclaris or fibromembrane invaded by tumor than in those with tumor at stages I and II and shallowmusclaris invasion. The positive expression of MRP was markedly higher in undifferentiated tumor than in the welldifferentiated one (P< 0.05). The MRPpositive rate of metastatic lymph nodes in MRPpositive tumor tissues was 100%. There was no positive MRP expression in nonmetastatic lymph nodes. The followup showed that the relapse or metastatic rate in MRPpositive cases was higher than that in MRPnegative ones. Conclusion: Overexpression of MRP gene in untreated esophageal carcinoma is in accordance with its metastasis to lymph nodes. It can be regarded as a prognostic marker of esophageal carcinoma.
, 百拇医药
Key words esophageal carcinoma; MRP gene expression; pathological feature
1992年，Cole等[1]研究发现非糖蛋白(P-gp)介导的肿瘤耐药细胞中多药耐药相关蛋白基因(Multidrug resistanceassociated protein,MRP)呈过度表达。之后，MRP基因表达作为肿瘤多药耐药性的又一重要影响因素引起了人们的关注。从1996年12月至1998年12月，我们采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术，检测了51例食管癌组织、癌旁及33枚肿大淋巴结组织的MRP基因表达，以探讨MRP表达与食管癌病理特征的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料
51例食管癌中，男35例，女16例，均为汉族，平均年龄58岁。全部经病理检查为食管鳞状上皮细胞癌。标本取自手术结束时肿瘤组织，癌旁组织(距离肿瘤3～5 cm)及20例患者的33枚肿大淋巴结组织各一块，迅速投入液氮保存。
, 百拇医药
1.2 主要试剂及仪器
AMV逆转录酶、MRP酶抑制剂等均购自Promega公司；毛细管PCR仪为美国ldaho公司产品；凝胶成像系统；Kodak digital science system dc-40。
1.3 RT-PCR方法
按照Chomczynski[2]方法提取组织RNA，cDNA的合成采取用20 μl逆转录反应体系，42°C反应1 h，95°C 5 min灭活AMV。RT-PCR参照Noonan[3]方法，PCR反应体系内含cDNA 2 μl，10×buffer 2 μl，4×dNTP 2 μl，MRP、β-actin引物各2 μl，Taq酶1 μl，用水补至20 μl。PCR反应在0.2 ml薄壁管中进行，毛细管PCR仪扩增反应参数为：94°C预变性2 min，94°C变性20 s，55°C退火20 s，72°C延伸30 s；30个循环；72°C后延伸7 min。
, 百拇医药
1.4 电泳及成像
PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统定量分析，MRP/β-actin比值表示MRP的相对表达水平，比值大于0.5为阳性。
1.5 统计学方法
组间阳性率比较行χ2检验。
2 结果
如图1显示了不同组织中MRP的RT-PCR扩增产物凝胶电泳结果，其扩增产物分别为234 bp和336 bp。另外，在食管癌组织中MRP阳性18例(35.3%)，癌旁组织MRP阳性2例(3.9%)，癌组织的MRP阳性率与癌旁组织比较具有显著性差异(P< 0.05)；从表1得知，肿瘤大小、病理类型及淋巴结转移与否的MRP阳性率相近；但在肿瘤侵犯粘膜下和深肌层或纤维层的阳性率(38.1%)高于肿瘤侵犯浅肌层以下者(22.2%)；TNMⅢ、Ⅳ期食管癌的MRP阳性率(42.1%)高于Ⅰ、Ⅱ期(15.4%)；在不同分化食管癌组织中，MRP阳性分布分别是：高分化鳞癌6例(24%)，中度分化鳞癌4例(33.3%)和低分化鳞癌8例(57.1%)。低分化食管癌的MRP阳性率与高分化者比较差异显著(P< 0.05)。
, 百拇医药
图1 不同组织MRP RT-PCR产物凝胶电泳照片
1、3：癌组织；2、4：相应癌旁组织；5：分子量标准
Fig 1 Electrophoretic photograph of MRP RT-PCR
prducts of different tissues
1、3：Cancer tissues；2、4：Responsive paracancerous tissues;
5：Molecular marker
表1 食管癌组织MRP表达与临床病理特征的关系
Tab1 Relationship between MEP-positive rate and
, 百拇医药
pathological features of esophageal carcinoma Factors
Tumor size
<3cm
8
3
37.5
≥3cm≤5cm
20
7
35
>5cm
23
, http://www.100md.com
8
34.8
Infiltratin depth
Mucous membrane or shallow-musclaris
9
2
22.2
Deep-muslaris or fibro-membrane
42
16
38.1
Lymph node metastasis
, http://www.100md.com
Yes
22
8
36.3
No
29
10
34.5
Pathology shape
Medullary
21
8
38.1
, 百拇医药
UIcerative
19
7
36.8
Constrictive
1
0
0
Fungting
10
3
30
TNM grade
, http://www.100md.com
Ⅰ+Ⅱ
13
3
23.1
Ⅲ+Ⅳ
38
15
39.5
Differentiation degree
Well-defferentiation
25
6
24
, 百拇医药
Moderate-differentiation
12
4
33.3
Poor-differentiation
14
8
57.1*
*：P<0.05 vs well-differentiation
在33枚肿大淋巴结组织中，病理证实为癌转移的21枚(取自13例患者)，其中5例癌组织MRP阳性的6枚转移淋巴结组织均阳性，而12枚非转移淋巴结组织(其中5枚来自癌组织MRP阳性者)未检测到MPR阳性表达。35例经术后1～2年追踪随防，14例食管癌组织MRP阳性者，1例复发、5例远处转移，发生率为42.9%。其中转移淋巴结组织MRP阳性4例，3例在术后1年内发生肿瘤复发或转移死亡。而同期随访的21例MRP阴性者，4例复发或转移，发生率为19%。
, 百拇医药
3 讨论
肿瘤细胞的多药耐药性(MDR)机制复杂，多药耐药基因(MDR1)作为重要的耐药原因已被公认。而MRP作为影响MDR表型的又一重要因素，特别是在血液肿瘤中的研究较多。但在食管癌组织中，MRP基因表达与其病理特征关系的研究甚少。本研究发现，食管癌组织中MRP表达增高，与癌旁组织比较具有显著性差异(P<0.05)，说明病情发展过程中，肿瘤细胞自身MRP基因扩增的结果，并可能是食管癌化疗效果不佳的原因之一。
有人认为MRP在晚期肿瘤中表达增高，并可反应肿瘤的浸润、转移及预后差的生物学特性[4]。本组资料显示，肿瘤大小和大体类型不同的食管癌组织中MRP阳性率相近，但在肿瘤侵犯深肌层以上的MRP阳性率(38.1%)高于侵犯粘膜下和浅肌层者(22.2%)，Ⅲ、Ⅳ期食管癌的MRP阳性率(39.5%)也高于Ⅰ、Ⅱ期(23.1%)，这一结果符合上述报道。另外，MRP阳性还较多分布于低分化肿瘤中，这说明MRP基因表达不仅表现了食管癌的多药耐药性，还可能反映了肿瘤细胞的恶性行为。
, 百拇医药
由本组资料的整体分析看，癌组织中MRP阳性与淋巴结转移与否并无明显关系，但转移淋巴结组织MRP基因表达与相应癌组织具有一致性。本组取自5例癌组织MRP阳性患者的6枚转移淋巴结均阳性，而且这5例转移淋巴结阳性患者，经随访4例，3例在术后1年内肿瘤复发或转移死亡。这提示转移淋巴结中MRP阳性是肿瘤侵犯淋巴组织的信号，可致肿瘤术后早期复发和转移。并且术后随访结果还显示，癌组织MRP表达阳性的肿瘤复发、转移率(42.9%)高于MRP阴性者(19%)，其转移淋巴结组织MRP阳性患者，肿瘤的复发或转移发生早。
作者简介：王延明(1961)，男，山东省人，主治医师，主要从事胸部肿瘤多药耐药方面的研究，发表论文45篇。
作者单位：蒋仁述(白求恩国际和平医院，石家庄 050081)
参考文献
[1] Cole S P C, Bhardwaj G, Gerlach J H, et al. Overexpression of a transporter gene in multidrugresistant human lung cancer cell line[J]. Science,1992,258(10):1 650-1 654.
, 百拇医药
[2] Chomczynski P, Sacchi N. Singe step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyantephenolchloroform extraction[J]. Analytical Biochemistry,1987,162(1):156-157.
[3] Noonan K E, Bech C, Holzmayer T A, et al. Quantitative analysis of MDR1 gene expression in human tumor by poly merase chain reaction[J], Proc Natl Acad Sci USA,1990, 87(18):7 160-7 163.
[4] Krishnamachary N, Center M S. The MRP gene associated with a non-p-glycoprotein multidrug resistance encodes-a-190KDa membrane bound glycoprotein[J]. Cancer Res,1993,53(7):3 658-3 662.
收稿日期：1999-06-07；修回日期：1999-12-21, 百拇医药