幽门螺杆菌粘附素基因hpaA的克隆及表达
作者：陈烨 张兆山 王继德 周殿元
单位：陈烨(第一军医大学全军消化病研究所，广东 广州 510515)；张兆山(军事医学科学院生物工程研究所，北京，100071)；王继德(第一军医大学全军消化病研究所，广东 广州 510515)；周殿元(第一军医大学全军消化病研究所，广东 广州 510515)
关键词：幽门螺杆菌；粘附素；基因克隆
第一军医大学学报000306 摘要：目的 通过基因工程技术获得具有良好免疫原性的重组N-酰神经氨酰乳糖结合原纤维样血凝素(HpaA)。 方法 利用PCR技术从幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)总DNA中钓取hpaA结构基因，克隆及序列分析后在大肠杆菌中进行高效表达，表达产物经纯化后用酶联免疫吸附法(ELISA)检测其抗原性。结果 序列分析证实hpaA结构基因长度为783 bp，编码261个氨基酸，SDS-PAGE显示表达产物相对分子质量约为29 000，可溶性表达占全菌的20%以上，经硫酸铵分级沉淀和阴离子交换层析后获得纯度为90%的重组蛋白。ELISA法显示该蛋白可被Hp全菌抗血清识别。结论 基因重组粘附素HpaA具有良好的抗原性，可望作为一种有效的蛋白疫苗用于Hp感染的防治。
, http://www.100md.com
中图分类号：R378.2；R394-33 文献标识码：A 文章编号：1000-2588 (2000)-03-0210-04
Cloning and expression of adhesion gene hpaA of Helicobacter pylori
CHEN Ye1, ZHANG Zhao-shan2, WANG Ji-de1, ZHOU Dian-yuan1
(1 Institute for Digestive Disease of PLA, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China; 2Institute of Biotechnology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China)Abstract: Objective To obtain the antigen of recombinant N-acetylneuraminyllactose-binding fibrillar hemagglutinin (HpaA) by genetic engineering. Methods The gene encoding an adhesion subunit protein, HpaA, was cloned, sequenced and expressed. After purification, the antigenicity of recombinant HpaA was analyzed by ELISA. Results DNA sequence analysis identified 1 open reading frame, encoding the polypeptides of 261 amino acids with molecular weight of 29 kD as predicted. The HpaA gene was then cloned into pTrc99A and efficiently expressed in E. coli JM109. The level of soluble expression product was about 20% of total cell protein. After ammonium sulfate fractionation and anion-exchange chromatography, the purity of rHpaA was above 90%. Conclusions ELISA results showed recombinant HpaA could be recognized by anti-serum against HP, suggesting that this protein has perfect antigenicity and may be used as a protective antigen in preventing Helicobacter pylori (Hp) infection.
, 百拇医药
Key words: Helicobacter pylori; adhesion; gene clone
幽门螺杆菌(Hp)已被确认是慢性胃病的主要病原因子，与胃癌亦密切相关，但其致病机制尚不明了。Hp能在胃内定植是其致病的前提，而粘附则是定植的关键。Hp仅定植于胃上皮及食管和十二指肠的胃上皮化生区，说明这种粘附作用是由特异的粘附素受体介导的。N-酰神经氨酰乳糖结合原纤维样血凝素(HpaA)是Hp的主要粘附素之一，它能与多种胃上皮细胞表面受体包括神经节苷脂(GM3)、硫酸脑苷脂(SLC)及层粘蛋白上的涎酸乳糖成分结合 [1,2]，使Hp紧密粘附于胃上皮细胞。阻断Hp与胃细胞的粘附可有效防治Hp感染。
为此，本研究选择暴露于细菌表面并以与Hp定植致病密切相关的粘附素HpaA为目标，利用基因工程技术获得具有较好免疫原性的重组粘附素，为制备Hp粘附素源疫苗提供基础。
, 百拇医药 1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 菌株JM109、DH5α、HB101及质粒pTrc99A、pBV321及pUC19由军事医学科学院生物工程研究所提供。高粘附力幽门螺杆菌菌株M1为本所保存。
1.1.2 工具酶 限制性内切酶EcoR I、Bam HI及T4 DNA ligase、Vent DNA polymerase购自New England Biolabs公司，Taq DNA polymerase购自华美生物工程公司。
1.1.3 试剂 琼脂糖、dNTPs、DNA快速纯化试剂盒购自Promega公司，DNA回收试剂盒购自原平公司，DNA分子量标准λDNA/EcoR I+Hind III、HRP标记羊抗兔IgG购自华美生物工程公司，SDS、TEMED、丙烯酰铵、N,N'-亚甲基双丙烯酰铵、IPTG购自Sigma公司，蛋白分子量标准购自Gibco BRL公司，HiTrap-Q-5ml预装柱、Sephadex G-25 Superfine购自Pharmacia公司，抗Hp全菌多克隆抗血清购自瑞典DAKO公司，其它试剂为国产分析纯。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 质粒的提取及纯化 质粒的快速抽提及大量制备均采用碱变性法[3] 。
1.2.2 Hp染色体DNA的提取 从固体培养基上刮取生长良好的Hp菌落，置入TE(pH8.0)中，酚/氯仿混合法提取[4]。
1.2.3 目的基因的PCR扩增 根据文献报道[5、6、8]设计引物，在其5’端加上合适的限制性酶切位点，由军事医学科学院生物工程研究所合成。序列如下：
引物1：5'-CGGAATTC ATG AGA GCA AAT AAT C-3'
EcoR I
引物2：5'-CGGGATCC TTC TTA TGC GTT ATT TG-3'
, 百拇医药
Bam HI
热启动法进行PCR，94℃变性30 s，50℃退火40 s，72℃延伸90 s，30个循环后再延伸10 min。1.0%琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。
1.2.4 DNA片断的酶切、连接、转化和阳性克隆的鉴定[3]质粒pUC19和目的基因DNA 经EcoR I和Bam HI双酶切，回收酶切片断，T4连接酶作用下16℃连接12 h，转化宿主菌JM109，双酶切鉴定筛选出阳性克隆。
1.2.5 重组质粒的序列分析 采用QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN，Germany)纯化重组质粒pUC-hpa，ABI 373A DNA自动分析仪进行序列分析。
1.2.6 HpaA基因的亚克隆及其表达 EcoR I和Bam HI自pUC-hpa上切下hpaA基因片断，插入表达载体pTrc99A，构建重组质粒pTrc-hpa，转化宿主菌，分别在不同的菌浓度起始，以不同浓度IPTG诱导不同的时间，收集菌液1ml进行全菌蛋白的SDS-PAGE(15%分离胶)和考马斯亮兰染色，通过诱导前后全菌蛋白染色条带的对照，可检出相应分子质量的外源蛋白表达条带并确定最佳诱导条件。
, 百拇医药
1.2.7 表达产物的纯化 表达产物定位分析显示，pTrc-hpa在JM109内以可溶性和包涵体两种形式表达。为保证蛋白活性，对可溶性表达部分进行纯化。收集2 L诱导表达的JM109 (pTrc-hpa)菌液，PBS洗涤后以1/20体积重悬，反复冻融3次，冰浴下超声破碎至溶液较清亮，离心收集上清，35%硫酸铵沉淀，Sephadex G-25柱脱盐，直接上HiTrap-Q-5ml预装柱(Pharmacia公司)，梯度洗脱，自动部分收集器收集，SDS-PAGE确定所需组分峰，合并目的组分，透析脱盐，PEG20000浓缩蛋白。
1.2.8 纯化产物的ELISA检测[4] 以不同稀释度的纯化产物作为待测抗原包被酶联板，阴性对照为JM109(pTrc99A)超声破碎上清，阳性对照为Hp全菌超声破碎上清。一抗、二抗以不同浓度稀释进行预实验以确定最佳反应浓度。
2 结果
, 百拇医药 2.1 pUC-hpa重组质粒的构建
粘附素基因hpaA长约800 bp，其PCR结果见图1。重组质粒pUC-hpa经EcoR I、Bam HI双酶切鉴定结果见图2。
图1 HpaA PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果
Fig.1 1% agarose electrophoresis of PCR product
Lane 1: PCR product of HpaA gene;
Lane 2: DNA markers (λDNA/EcoR I+Hind III)
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图2 重组质粒pUC-hpaA的限制性酶切分析
Fig. 2 Restriction digestion of pUC-Hpa
Lane 1: DNA markers(λDNA/EcoR I+Hind III);
Lane 2: pUC-Hpa/EcoR I; Lane 3: pUC-hpa/EcoR I+Bam HI
Lane 4: C19/EcoR I; Lane 5: PCR product of hpaA gene
2.2 重组质粒pUC-hpa的序列分析
利用pUC19上的通用引物对重组质粒进行序列分析，得到了与文献报道[7]几乎一致的DNA序列，阅读框架完整无中断。
, 百拇医药
2.3 hpaA基因的亚克隆
用EcoR I和Bam HI自pUC-hpa上切下hpaA基因片断，与表达载体pTrc99A重组构建质粒pTrc-hpa，其酶切鉴定结果见图3。
图3 重组质粒pTrc-Hpa的限制性酶切分析
Fig. 3 Restriction digestion of pTrc-Hpa
Lane 1: DNA markers(λDNA/EcoR I+Hind III); Lane 2: pTrc-Hpa/EcoR I;
Lane 3: pTrc-Hpa/EcoR I +Bam HI; Lane 4: pTrc99A/EcoR I;
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Lane 5: PCR product of HpaA gene
2.4 hpaA基因表达的电泳检测
将鉴定正确的重组质粒pTrc-hpa转化大肠杆菌JM109，IPTG诱导表达，其全菌蛋白的SDS-PAGE图谱如图4，在相对分子质量29 000处可见明显的外源蛋白表达带，与预期大小一致，降低IPTG浓度至0.1mmol/L可以提高表达量，诱导温度和时间对表达的影响不大。经薄层扫描分析可溶性表达水平达20%以上(图4)。
图4 HpaA在JM109中表达的全菌蛋白电泳分析
Fig.4 SDS-PAGE of total proteins from recombinant clones in E.coli JM109
, 百拇医药
Lane 1: Standard prestained protein molecular weight;
Lane 2: JM109(pTrc-hpa), without induction; Lane 3～6: JM109 (pTrc-hpa),induced with 0.1, 0.5, 1.0 and 2.0 mmol/L IPTG respectively;
Lane 7: JM109 (pTrc99A), induced with 1.0 mmol/L IPTG
2.5 表达产物的纯化
经20%、30%、35%、40%、30%～50%、30%～60%、50%～70%等多个梯度的硫酸铵沉淀，最终确定35%为最佳浓度，此时目的蛋白的纯度(约50%)和产量均处于较高水平。硫酸铵沉淀产物脱盐后上Q柱，获得了纯度达90%以上的终产物(图5)。
, 百拇医药
图5 重组HpaA纯化后的SDS-PAGE图
Fig. 5 SDS-PAGE analysis of the purified rHpaA
Lane 1: Protein molecular weight standards;
Lane 2: Sonicate of JM109 (pTrc-hpa)；Lane 3～5: Partially
purified rHpaA with 35% sulfate amine, Lane 6～7: rHpaA
purified with anion exchange chromatography.
2.6 纯化产物的ELISA检测
, 百拇医药
根据预实验结果，一抗采用10倍稀释，二抗100倍稀释进行ELISA检测，表1为包被的重组蛋白在不同稀释度下的D(490)值，结果为重复3次的平均值。
表1 ELISA法检测重组HpaA的抗原性
Tab.1 Antigenicity of the recombinant HpaA detected by ELISA
1/10
1/102
1/103
1/104
Control
, 百拇医药
positive
negative
blank
D(490)
1.48
1.55
0.61
0.54
1.86
0.37
0.11
3 讨论
, 百拇医药 Evans等[7、8] 于1988年发现Hp上存在一种原纤维样血凝素(NLBH)能与人红细胞紧密结合，并通过血凝抑制试验证实N-酰神经氨酰乳糖(涎酸乳糖)是其受体的主要成分，随后又纯化了NLBH并克隆了相应基因hpaA，发现基因全长约1.4 kb，存在3个开放读框(ORFs)，其中ORF2长549 bp，是NLBH的主要结构基因(hpaA)，编码Mr =20 000的蛋白。但此后有学者对此提出异议，认为hpaA长783 bp，包含了Evans所述的ORF2和ORF3[5、6]，编码29 000的蛋白。根据上述情况，我们在设计引物时综合考虑两方面的因素，上游引物从ORF2的起始密码子ATG开始，下游引物取ORF3终止密码子TAA后的十余个碱基，5' 端分别引入最常用的EcoR I和Bam HI酶切位点及两个保护性碱基以便于操作。序列分析显示克隆的hpaA基因片断与Jones[6]的报道基本一致，阅读框架完整无中断，包含了Evans所述的ORF2和ORF3。
在hpaA的表达研究中，我们采用带有强trp/lac融合启动子的pTrc99A表达载体，该载体可以表达非融合蛋白(从Nco I位点插入)也可以表达融合蛋白(从其它位点以正确读码框架插入)。我们从紧接Nco I的EcoR I位点插入，获得了较高产量的hpaA融合蛋白产物，经35%硫酸铵沉淀，目的蛋白占总蛋白的50%以上，方便了下一步的阴离子交换层析。
, 百拇医药
为了对表达产物的抗原性进行检测，我们以Hp全菌超声破碎上清为阳性对照，含pTrc99A的JM109宿主菌超声破碎上清为阴性对照进行ELISA检测，结果显示表达产物能与抗Hp全菌抗血清反应，同时说明重组粘附素N端融合的3个外源氨基酸残基并不影响其抗原性。本实验构建了粘附素HpaA的融合克隆并获得较高表达，经硫酸铵分级沉淀和阴离子交换层析，表达产物的纯度可达90%，并且具有良好的抗原性，为进一步研究其保护作用及免疫机制提供了依据。
国家自然科学基金资助项目(39700007)
陈烨(1971-)，女，江苏扬州人，1993年毕业于扬州大学医学院，博士
参考文献
1.Valkonen KH, Wadstrom T, Moran AP. Identification of the N-acetylneuraminyllactose-specific laminin-binding protein of Helicobac-ter pylori[J]. Infect Immun, 1997, 65:916～23.
, 百拇医药
2.Simon PM, Goode PL, Mobasseri A et al. Inhibition of Helicobacter pylori binding to gastrointestinal epithelial cells by sialic acid-containing oligosaccharides[J]. Infect Immun, 1997, 65:750～57.
3.J.萨姆布鲁克, E.F.弗里奇, T.曼尼阿蒂斯著. 金冬雁, 黎孟枫等译. 分子克隆实验指南[M], 第2版. 北京:科学出版社, 1996.16～66.
4.F.奥斯伯, R.布伦特, R.E.金斯顿等编. 颜子颖，王海林译. 精编分子生物学实验指南[M]. 北京:科学出版社, 1998. 39～40,414～25.
5.O'Toole PW, Janzon L, Doig P et al. The putative neuraminyllactose-binding hemagglutinin HpaA of Helicobacter pylori CCUG 17874 is a lipoprotein[J].
, 百拇医药
6.J Bacteriol, 1995, 177:6049～57. Johns AC, Logan RP, Foynes S et al. A flagellar sheath protein of Helicobacter pylori is identical to HpaA, a putative N-acetylneu-raminyllactose-binding hemagglutinin, but is not an adhesin for AGS cells[J]. J Bacteriol, 1997, 179:5643～47.
7.Evans DG, Evans DJ Jr, John JM et al. N-acetylneuraminyllactose-binding fibrillar haemagglutinin of Campylobacter pylori: a putative colonization factor antigen[J]. Infect Immun, 1988, 56(11):2896～906.
8.Evans DG, Karjalainen TK, Evans DJ Jr et al. Cloning, nucleotide sequence, and expression of a gene encoding an adhesin subunit protein of helicobacter pylori[J]. J Bacteriol, 1993, 175(3):674～83.
1999-10-13, 百拇医药
单位：陈烨(第一军医大学全军消化病研究所，广东 广州 510515)；张兆山(军事医学科学院生物工程研究所，北京，100071)；王继德(第一军医大学全军消化病研究所，广东 广州 510515)；周殿元(第一军医大学全军消化病研究所，广东 广州 510515)
关键词：幽门螺杆菌；粘附素；基因克隆
第一军医大学学报000306 摘要：目的 通过基因工程技术获得具有良好免疫原性的重组N-酰神经氨酰乳糖结合原纤维样血凝素(HpaA)。 方法 利用PCR技术从幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)总DNA中钓取hpaA结构基因，克隆及序列分析后在大肠杆菌中进行高效表达，表达产物经纯化后用酶联免疫吸附法(ELISA)检测其抗原性。结果 序列分析证实hpaA结构基因长度为783 bp，编码261个氨基酸，SDS-PAGE显示表达产物相对分子质量约为29 000，可溶性表达占全菌的20%以上，经硫酸铵分级沉淀和阴离子交换层析后获得纯度为90%的重组蛋白。ELISA法显示该蛋白可被Hp全菌抗血清识别。结论 基因重组粘附素HpaA具有良好的抗原性，可望作为一种有效的蛋白疫苗用于Hp感染的防治。
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中图分类号：R378.2；R394-33 文献标识码：A 文章编号：1000-2588 (2000)-03-0210-04
Cloning and expression of adhesion gene hpaA of Helicobacter pylori
CHEN Ye1, ZHANG Zhao-shan2, WANG Ji-de1, ZHOU Dian-yuan1
(1 Institute for Digestive Disease of PLA, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China; 2Institute of Biotechnology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China)Abstract: Objective To obtain the antigen of recombinant N-acetylneuraminyllactose-binding fibrillar hemagglutinin (HpaA) by genetic engineering. Methods The gene encoding an adhesion subunit protein, HpaA, was cloned, sequenced and expressed. After purification, the antigenicity of recombinant HpaA was analyzed by ELISA. Results DNA sequence analysis identified 1 open reading frame, encoding the polypeptides of 261 amino acids with molecular weight of 29 kD as predicted. The HpaA gene was then cloned into pTrc99A and efficiently expressed in E. coli JM109. The level of soluble expression product was about 20% of total cell protein. After ammonium sulfate fractionation and anion-exchange chromatography, the purity of rHpaA was above 90%. Conclusions ELISA results showed recombinant HpaA could be recognized by anti-serum against HP, suggesting that this protein has perfect antigenicity and may be used as a protective antigen in preventing Helicobacter pylori (Hp) infection.
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Key words: Helicobacter pylori; adhesion; gene clone
幽门螺杆菌(Hp)已被确认是慢性胃病的主要病原因子，与胃癌亦密切相关，但其致病机制尚不明了。Hp能在胃内定植是其致病的前提，而粘附则是定植的关键。Hp仅定植于胃上皮及食管和十二指肠的胃上皮化生区，说明这种粘附作用是由特异的粘附素受体介导的。N-酰神经氨酰乳糖结合原纤维样血凝素(HpaA)是Hp的主要粘附素之一，它能与多种胃上皮细胞表面受体包括神经节苷脂(GM3)、硫酸脑苷脂(SLC)及层粘蛋白上的涎酸乳糖成分结合 [1,2]，使Hp紧密粘附于胃上皮细胞。阻断Hp与胃细胞的粘附可有效防治Hp感染。
为此，本研究选择暴露于细菌表面并以与Hp定植致病密切相关的粘附素HpaA为目标，利用基因工程技术获得具有较好免疫原性的重组粘附素，为制备Hp粘附素源疫苗提供基础。
, 百拇医药 1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 菌株JM109、DH5α、HB101及质粒pTrc99A、pBV321及pUC19由军事医学科学院生物工程研究所提供。高粘附力幽门螺杆菌菌株M1为本所保存。
1.1.2 工具酶 限制性内切酶EcoR I、Bam HI及T4 DNA ligase、Vent DNA polymerase购自New England Biolabs公司，Taq DNA polymerase购自华美生物工程公司。
1.1.3 试剂 琼脂糖、dNTPs、DNA快速纯化试剂盒购自Promega公司，DNA回收试剂盒购自原平公司，DNA分子量标准λDNA/EcoR I+Hind III、HRP标记羊抗兔IgG购自华美生物工程公司，SDS、TEMED、丙烯酰铵、N,N'-亚甲基双丙烯酰铵、IPTG购自Sigma公司，蛋白分子量标准购自Gibco BRL公司，HiTrap-Q-5ml预装柱、Sephadex G-25 Superfine购自Pharmacia公司，抗Hp全菌多克隆抗血清购自瑞典DAKO公司，其它试剂为国产分析纯。
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1.2 方法
1.2.1 质粒的提取及纯化 质粒的快速抽提及大量制备均采用碱变性法[3] 。
1.2.2 Hp染色体DNA的提取 从固体培养基上刮取生长良好的Hp菌落，置入TE(pH8.0)中，酚/氯仿混合法提取[4]。
1.2.3 目的基因的PCR扩增 根据文献报道[5、6、8]设计引物，在其5’端加上合适的限制性酶切位点，由军事医学科学院生物工程研究所合成。序列如下：
引物1：5'-CGGAATTC ATG AGA GCA AAT AAT C-3'
EcoR I
引物2：5'-CGGGATCC TTC TTA TGC GTT ATT TG-3'
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Bam HI
热启动法进行PCR，94℃变性30 s，50℃退火40 s，72℃延伸90 s，30个循环后再延伸10 min。1.0%琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。
1.2.4 DNA片断的酶切、连接、转化和阳性克隆的鉴定[3]质粒pUC19和目的基因DNA 经EcoR I和Bam HI双酶切，回收酶切片断，T4连接酶作用下16℃连接12 h，转化宿主菌JM109，双酶切鉴定筛选出阳性克隆。
1.2.5 重组质粒的序列分析 采用QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN，Germany)纯化重组质粒pUC-hpa，ABI 373A DNA自动分析仪进行序列分析。
1.2.6 HpaA基因的亚克隆及其表达 EcoR I和Bam HI自pUC-hpa上切下hpaA基因片断，插入表达载体pTrc99A，构建重组质粒pTrc-hpa，转化宿主菌，分别在不同的菌浓度起始，以不同浓度IPTG诱导不同的时间，收集菌液1ml进行全菌蛋白的SDS-PAGE(15%分离胶)和考马斯亮兰染色，通过诱导前后全菌蛋白染色条带的对照，可检出相应分子质量的外源蛋白表达条带并确定最佳诱导条件。
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1.2.7 表达产物的纯化 表达产物定位分析显示，pTrc-hpa在JM109内以可溶性和包涵体两种形式表达。为保证蛋白活性，对可溶性表达部分进行纯化。收集2 L诱导表达的JM109 (pTrc-hpa)菌液，PBS洗涤后以1/20体积重悬，反复冻融3次，冰浴下超声破碎至溶液较清亮，离心收集上清，35%硫酸铵沉淀，Sephadex G-25柱脱盐，直接上HiTrap-Q-5ml预装柱(Pharmacia公司)，梯度洗脱，自动部分收集器收集，SDS-PAGE确定所需组分峰，合并目的组分，透析脱盐，PEG20000浓缩蛋白。
1.2.8 纯化产物的ELISA检测[4] 以不同稀释度的纯化产物作为待测抗原包被酶联板，阴性对照为JM109(pTrc99A)超声破碎上清，阳性对照为Hp全菌超声破碎上清。一抗、二抗以不同浓度稀释进行预实验以确定最佳反应浓度。
2 结果
, 百拇医药 2.1 pUC-hpa重组质粒的构建
粘附素基因hpaA长约800 bp，其PCR结果见图1。重组质粒pUC-hpa经EcoR I、Bam HI双酶切鉴定结果见图2。
图1 HpaA PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果
Fig.1 1% agarose electrophoresis of PCR product
Lane 1: PCR product of HpaA gene;
Lane 2: DNA markers (λDNA/EcoR I+Hind III)
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图2 重组质粒pUC-hpaA的限制性酶切分析
Fig. 2 Restriction digestion of pUC-Hpa
Lane 1: DNA markers(λDNA/EcoR I+Hind III);
Lane 2: pUC-Hpa/EcoR I; Lane 3: pUC-hpa/EcoR I+Bam HI
Lane 4: C19/EcoR I; Lane 5: PCR product of hpaA gene
2.2 重组质粒pUC-hpa的序列分析
利用pUC19上的通用引物对重组质粒进行序列分析，得到了与文献报道[7]几乎一致的DNA序列，阅读框架完整无中断。
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2.3 hpaA基因的亚克隆
用EcoR I和Bam HI自pUC-hpa上切下hpaA基因片断，与表达载体pTrc99A重组构建质粒pTrc-hpa，其酶切鉴定结果见图3。
图3 重组质粒pTrc-Hpa的限制性酶切分析
Fig. 3 Restriction digestion of pTrc-Hpa
Lane 1: DNA markers(λDNA/EcoR I+Hind III); Lane 2: pTrc-Hpa/EcoR I;
Lane 3: pTrc-Hpa/EcoR I +Bam HI; Lane 4: pTrc99A/EcoR I;
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Lane 5: PCR product of HpaA gene
2.4 hpaA基因表达的电泳检测
将鉴定正确的重组质粒pTrc-hpa转化大肠杆菌JM109，IPTG诱导表达，其全菌蛋白的SDS-PAGE图谱如图4，在相对分子质量29 000处可见明显的外源蛋白表达带，与预期大小一致，降低IPTG浓度至0.1mmol/L可以提高表达量，诱导温度和时间对表达的影响不大。经薄层扫描分析可溶性表达水平达20%以上(图4)。
图4 HpaA在JM109中表达的全菌蛋白电泳分析
Fig.4 SDS-PAGE of total proteins from recombinant clones in E.coli JM109
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Lane 1: Standard prestained protein molecular weight;
Lane 2: JM109(pTrc-hpa), without induction; Lane 3～6: JM109 (pTrc-hpa),induced with 0.1, 0.5, 1.0 and 2.0 mmol/L IPTG respectively;
Lane 7: JM109 (pTrc99A), induced with 1.0 mmol/L IPTG
2.5 表达产物的纯化
经20%、30%、35%、40%、30%～50%、30%～60%、50%～70%等多个梯度的硫酸铵沉淀，最终确定35%为最佳浓度，此时目的蛋白的纯度(约50%)和产量均处于较高水平。硫酸铵沉淀产物脱盐后上Q柱，获得了纯度达90%以上的终产物(图5)。
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图5 重组HpaA纯化后的SDS-PAGE图
Fig. 5 SDS-PAGE analysis of the purified rHpaA
Lane 1: Protein molecular weight standards;
Lane 2: Sonicate of JM109 (pTrc-hpa)；Lane 3～5: Partially
purified rHpaA with 35% sulfate amine, Lane 6～7: rHpaA
purified with anion exchange chromatography.
2.6 纯化产物的ELISA检测
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根据预实验结果，一抗采用10倍稀释，二抗100倍稀释进行ELISA检测，表1为包被的重组蛋白在不同稀释度下的D(490)值，结果为重复3次的平均值。
表1 ELISA法检测重组HpaA的抗原性
Tab.1 Antigenicity of the recombinant HpaA detected by ELISA
1/10
1/102
1/103
1/104
Control
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positive
negative
blank
D(490)
1.48
1.55
0.61
0.54
1.86
0.37
0.11
3 讨论
, 百拇医药 Evans等[7、8] 于1988年发现Hp上存在一种原纤维样血凝素(NLBH)能与人红细胞紧密结合，并通过血凝抑制试验证实N-酰神经氨酰乳糖(涎酸乳糖)是其受体的主要成分，随后又纯化了NLBH并克隆了相应基因hpaA，发现基因全长约1.4 kb，存在3个开放读框(ORFs)，其中ORF2长549 bp，是NLBH的主要结构基因(hpaA)，编码Mr =20 000的蛋白。但此后有学者对此提出异议，认为hpaA长783 bp，包含了Evans所述的ORF2和ORF3[5、6]，编码29 000的蛋白。根据上述情况，我们在设计引物时综合考虑两方面的因素，上游引物从ORF2的起始密码子ATG开始，下游引物取ORF3终止密码子TAA后的十余个碱基，5' 端分别引入最常用的EcoR I和Bam HI酶切位点及两个保护性碱基以便于操作。序列分析显示克隆的hpaA基因片断与Jones[6]的报道基本一致，阅读框架完整无中断，包含了Evans所述的ORF2和ORF3。
在hpaA的表达研究中，我们采用带有强trp/lac融合启动子的pTrc99A表达载体，该载体可以表达非融合蛋白(从Nco I位点插入)也可以表达融合蛋白(从其它位点以正确读码框架插入)。我们从紧接Nco I的EcoR I位点插入，获得了较高产量的hpaA融合蛋白产物，经35%硫酸铵沉淀，目的蛋白占总蛋白的50%以上，方便了下一步的阴离子交换层析。
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为了对表达产物的抗原性进行检测，我们以Hp全菌超声破碎上清为阳性对照，含pTrc99A的JM109宿主菌超声破碎上清为阴性对照进行ELISA检测，结果显示表达产物能与抗Hp全菌抗血清反应，同时说明重组粘附素N端融合的3个外源氨基酸残基并不影响其抗原性。本实验构建了粘附素HpaA的融合克隆并获得较高表达，经硫酸铵分级沉淀和阴离子交换层析，表达产物的纯度可达90%，并且具有良好的抗原性，为进一步研究其保护作用及免疫机制提供了依据。
国家自然科学基金资助项目(39700007)
陈烨(1971-)，女，江苏扬州人，1993年毕业于扬州大学医学院，博士
参考文献
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1999-10-13, 百拇医药