人心肌肌钙蛋白T亚型的克隆及表达
作者：陆青 赖春宁 李志梁 王建安 李五举 沈倍奋
单位：赖春宁(军事医学科学院基础医学研究所分子免疫实验室，北京 100850)；李志梁(第一军医大学珠江医院心内科，广东 广州 510282)；王建安(军事医学科学院基础医学研究所分子免疫实验室，北京 100850)；李五举(军事医学科学院基础医学研究所分子免疫实验室，北京 100850)；沈倍奋(军事医学科学院基础医学研究所分子免疫实验室，北京 100850)
关键词：人心肌肌钙蛋白T；基因表达；心力衰竭
第一军医大学学报000304 摘要: 目的 构建人心肌肌钙蛋白T(cTnT)亚型的重组载体。 方法 应用RT-PCR技术，从人胚胎心肌组织中扩增cTnT1及cTnT2基因，连接到T Easy vector载体上，筛选重组子。结果 成功地扩增出cTnT1(764 bp)及cTnT2(124)基因片段，经测序证实，构建pExSecI-cTnT1表达载体并获得表达。结论 获得单一亚型的cTnT1及cTnT2基因片段，为研究心力衰竭时的胚胎型基因重构与发病关系提供了依据。
, 百拇医药
中图分类号：R542.2；R378.2 文献标识码：A 文章编号：1000-2588 (2000)-03-0204-03
Cloning and expression of human fetal cardiac troponin T isoform
LU Qing1, LAI Chun-ning2, LI Zhi-liang1, WANG Jian-an2, LI Wu-ju2, SHEN Bei-fen2
(1Department of Cardiology, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510280, China; 2Laboratory of Molecular Immunology, Institute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China)Abstract: Objective To construct recombinant vector for human fetal cardiac troponin T (cTnT) isoform. Methods The cTnT1 and cTnT2 genes were amplified from human fetal cardiac muscular tissue by RT-PCR, and then cloned into T Easy vector. Results The cTnT1 (764 bp) and cTnT2 (124 bp) genes were successfully amplified and their sequences tested, which were cloned into pExSecI vector and expressed by induction at IPTG for 4 h. Conclusions cTnT1 was highly expressed in BL21 transformant with expression level above 18%. These results prepared molecular basis for further research of human cardiac troponin T isoform expressed during heart failure.
, http://www.100md.com
Key words: human cardiac troponin T; isoform; gene expression; heart failure
心肌肌钙蛋白T(cTnT)是一种心肌特异性抗原。近年来研究[1]表明，心肌损伤后4 h血中cTnT浓度开始升高，24 h达到峰值，可持续5～7 d。心力衰竭时衰竭心肌存在心肌收缩蛋白或调节蛋白成分的胚胎型基因重构，cTnT胚胎型基因可以表现为多种形式(如cTnT1～cTnT8)，而cTnT2为其在正常成人成熟期心肌中的唯一表达形式。当心肌细胞肥厚时，cTnT的胚胎型基因发生瞬时表达，主要表现为 cTnT1、cTnT3、cTnT4的再表达 [1、3 、4]。因此，cTnT1的mRNA水平和蛋白水平升高与心力衰竭密切相关 [3]。本研究从人心肌组织中获取cTnT1及cTnT2基因片段，成功构建了pExSecI-cTnT1表达载体并在大肠杆菌中获得表达。
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1 材料和方法
1.1材料
1.1.1质粒与菌株 pBv220、pExSecI质粒，宿主菌E.coli DH5α、JM109、BL21等均由军事医学科学院三所四室提供。
1.1.2主要试剂 限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Klenow酶、Taq酶、AMV酶及X-Gal、IPTG、T Easy-vector试剂盒均购自Promega公司；质粒和PCR产物纯化试剂盒购自Clontech公司；Trizol及mRNA纯化试剂盒购自Gibco公司。
1.1.3寡核苷酸引物 根据文献[1、4]，应用Goldkey软件设计两对引物，引物合成由CyberSyn公司完成。
上游引物P1： 5’-CGGAATTCATGGAGCAGGAAGAGC AGGAG-3’ EcoR I；下游引物P2： 5’-CGGGATCCTTACTGCTTGAACTTCTCCTG-3 Bam HI；上游引物P3：5’-GC GAAGAGTACGAGGAGGAGG AGC-3’；下游引物P4： 5’-GC AGCCTCTGCTTCAGCATCC-3’。
, 百拇医药
1.1.4组织来源 非心脑畸型病变引产的胚胎，胎龄20～24 周。
1.2 方法
1.2.1 RNA提取及mRNA的纯化 取胎心肌组织1 g于液氮环境下捣碎，加入6 ml Trizol试剂，室温放置10 min，氯仿粗提、异丙醇沉淀、乙醇清洗后溶于100 μl灭菌水中，mRNA(0.04 g/L)纯化处理参照试剂盒说明书进行。
1.2.2 RT-PCR反应 依次加入10 mmol/L dNTPs 1 μl、9 U/μl AMV 1 μl、5×AMV 缓冲液4 μl、随机引物0.2 μg、Rnasin(RNA酶抑制剂)0.4 μl及mRNA 1 μl，反应总体积20 μl。室温放置10 min后置42℃、50 min。cTnT1的PCR以P1及P2为引物，分两步进行：(1)低严谨性：94℃、45 s，35℃、1 min，72℃、1 min，5个循环；(2)高严谨性：94℃、45 s，60℃、1 min，72℃、1 min，35个循环；72℃、8 min延伸。cTnT2的PCR反应以P3及P4为引物，按以下步骤进行：94℃、45 s，62℃、1 min，72℃、1 min，35个循环，72℃、8 min延伸，1.5%琼脂糖电泳观察结果。
, 百拇医药
1.2.3重组载体的构建 将特异PCR片段与T Easy vector 连接，方法参照T Easy vector 试剂盒说明书，提取质粒，EcoR I酶切，筛选重组子。
1.2.4 cTnT1基因表达载体的构建 用表达载体pExSecI-cTnT1及pBv220-cTnT1分别转化E.coliDH5α及BL21宿主菌，经温度诱导及IPTG诱导，SDS-PAGE电泳观察不同载体的表达量，并对表达条件进行优化 [8]。
1.2.5表达产物Western 印迹鉴定 将SDS-PAGE电泳条带转至硝酸纤维滤膜上，经5%(w/V)脱脂奶粉封闭、洗膜，加入鼠抗人cTnT单克隆抗体，37℃、2 h，洗膜，再加入HRP-兔抗鼠IgG温育1 h，最后TMB显色 [7、8]。
2 结果
, http://www.100md.com 2.1 cTnT1及cTnT2 cDNA的RT-PCR
cTnT1及cTnT2的上游引物设计于核苷酸链缺失区(参照cTnT4，图1)。以设计合成的寡核苷酸片段为引物，将从心肌组织提取的mRNA经RT-PCR得到约760 bp(cTnT1)及约120 bp(cTnT2)的扩增条带。
图1 5’端cTnT1和cTnT2核苷酸缺失区
Fig.1 5’alternatively spliced region defined by
the oligonucleotide pair to mRNAs cTnT1 and cTnT2
2.2 构建T Easy vector-cTnT2重组载体
, 百拇医药
将cTnT1及cTnT2特异PCR条带与T Easy vector连接，转化E.coliDH5α宿主菌，挑取菌斑，提取质粒，经EcoR I酶切，得到目的基因条带(图2)。
图2 质粒T Easy vector-cTnT1/cTnT2的鉴定
Fig.2 Restriction mapping of the T vector-cTnT1 and T vector-cTnT2
1:DNA Marker (DL-2000); 2:T Easy vector-cTnT1 (PCR, 760 bp); 3: T
Easy vector-cTnT2 (PCR, 120 bp); 4: T Easy vector-cTnT1 (SacI, 367 bp)
, 百拇医药
2.3 T Easy vector-cTnT1/cTnT2重组载体的鉴定
2.3.1 PCR方法鉴定 以T Easy vector-cTnT1/cTnT2为模板PCR扩增出约760 bp及120 bp的产物，T Easy vector空载体未扩增出相应条带。
2.3.2特异酶切鉴定 因cTnT1片段 397 bp处及T Easy vector 108 bp处均有Sac I单一酶切位点，故将T Easy vector-cTnT1质粒经Sac I酶切，得到367 bp特异条带，证实所筛选重组子为反向连接(图2)。
2.4 序列分析
ABI377型DNA序列分析仪完成测序工作，与文献[1]结果一致(图3)。
, 百拇医药
图3 cTnT1和cTnT2基因片段的核苷酸序列
Fig.3 Partial nucleotide sequences of cTnT1 and cTnT2
2.5 表达载体的诱导表达
pBv220-cTnT1经温度诱导表达，pExSecI-cTnT1经IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳均可见相对分子质量约为31000的表达带(pBv220-cTnT1)及50 000的表达带(pExSecI-cTnT1)，符合预计值。但pBv220-cTnT1的诱导表达率为10%左右，pExSecI-cTnT1的诱导表达率为18%左右(图4)。
图4 pBv220-cTnT1和pExSecI-cTnT1的表达
, 百拇医药
Fig.4 Expression of pBv220-cTnT1and pExSacI-cTnT1
1: Standard protein molecular weight; 2, 7: Noninduced with pExSecI-cTnT1;
3: IPTG induced with pExSecI-cTnT1 (50 kD); 4: Noninduced with pBv220-cTnT1;
5: Induced with pBv220-cTnT1(31 kD); 6: E.coli DH5α;
8: Purified pExSecI-cTnT1 protein (50 kD)
2.6 表达产物的Western印迹鉴定
, 百拇医药
经诱导表达的cTnT1 Western 印迹结果显示，在相对分子质量约为31 000和50 000处均呈现单一、清晰条带，而未经诱导表达的菌液则无相应条带。
3 讨论
近年来，国外有关cTnT作为心血管疾病的特异、敏感诊断指标的研究很多，国内则未见报道。Townsend[1]及 Anderson[4]等分别报道了心力衰竭时cTnT亚型的表达，Laurence[2、3]等则进行了衰竭心肌与正常心肌cTnT亚型的mRNA和蛋白表达水平的研究。本研究从心肌组织中直接获得了cTnT1及cTnT2基因，为研究心血管疾病与cTnT胚胎型基因重构的动态变化之间的关系提供了依据。
国外研究均从人心肌基因文库中获得靶基因，但在本研究中获得cTnT特异基因片段时较为困难，因cTnT基因在心肌基因组RNA中丰度极低，而cTnT亚型(cTnT1～cTnT8)之间存在90%以上的同源性[1、4]，唯有通过设计严谨、特异的引物及进行mRNA的富集方有可能达到目的。因cTnT2基因为cTnT在正常成人心肌细胞中的唯一表达方式，它与cTnT其它亚型的同源互补更高达95%，所以借助计算机软件分析，将上游引物设计在78～99 bp处，下游引物则设计在143～161 bp处，横跨cTnT2特异缺失区。尽管如此，因为cTnT2基因片段仅为124 bp，故在PCR时仍然有多条非特异条带出现，最后选定62℃、1 min为退火条件。cTnT2基因片段的获得为后续探针标记应用于心衰的基础研究打下了基础。cTnT1引物则在5＇端引入EcoR I酶切位点及ATG起始码，3＇端引入Bam HI酶切位点及TTA终止码，便于PCR产物的装载。用Goldkey软件分析，引物GC含量合适，引物自身不形成发夹结构或二聚体，且与模板完全匹配。
, 百拇医药
在cTnT1的诱导表达过程中，应用计算机软件对pBv220-cTnT1的外源基因表达量进行了预测，获得高效表达模式[6]。pBv220载体为Pr启动子，采用温度诱导，重组蛋白主要以包涵体形式存在，有文献[5]报道cTnT本身一方面易发生蛋白水解，另一方面在高浓度尿素存在时仍有聚集倾向，故构建的pBv220-cTnT1则存在可溶性表达低、包涵体复性困难等问题。本研究将pBv220-cTnT1的特异基因改建在pExSecI载体上，以pExSecI为T7起动子，采用IPTG诱导，经转化E.coli BL21获得了高效可溶性表达。
致谢 感谢军事医学科学院基础医学研究所分子免疫室黎 燕、倪长源、胡美茹、郭燕翔、郑 宇、裴武红、洪海燕等老师的指导和帮助。
全军重点医学科学院开放实验室基金资助(97028)
陆青(1971-)，女，湖南长沙人，1983年毕业于第一军医大学，专科，主管技师
, http://www.100md.com
陆青(第一军医大学珠江医院心内科，广东 广州 510282)
参考文献
[1] Townsend PJ, Barton PJ, Yacoub MH et al. Molecular cloning of human cardiac troponin T isoforms: expression in developing and failing heart[J]. J Mol Cell Cardiol, 1995, 27: 2223～36.
[2] Mesnard L, Logeart D, Taviaux S et al. Human cardiac troponin T: cloning and expression of new isoform in the nornal and failing heart[J]. Circ Res, 1995, 76:687～92.
, http://www.100md.com
[3] Mesnard Rouiller L, Mercadier JJ, Butler B G et al. Troponin T mRNA and protein isoform in the human left ventricle: pattern of expression in failing and control hearts[J]. J Mol Cell Cardiol, 1997, 29:3043～55.
[4] Anderson PA, Greig A, Mark TM et al. Molecular basis of human cardiac troponin T isforms expressed in the developing, adult, and failing heart[J]. Circ Res, 1995, 76:681～6.
[5] Risnik VV, Alexandr D. Comparison of the structure of two cardiac troponin T isoforms[J]. Biochem J, 1985, 225(2): 549～52.
[6] 李伍举, 吴加金. PBv220载体中外源基因表达水平定量分析[J]. 病毒学报, 1997, 13(2):126～33.
[7] 付朝平, 陆 青, 李志梁等. 人心肌肌钙蛋白T单克隆抗体的研制及鉴定[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 1996, 12(1):39～41.
[8] J.萨姆布鲁克, E.F.弗里奇, T.曼里阿蒂斯著. 金冬雁译. 分子克隆实验指南[M]. 第2版, 北京: 科学出版社, 1992. 880～97.
1999-09-09, http://www.100md.com
单位：赖春宁(军事医学科学院基础医学研究所分子免疫实验室，北京 100850)；李志梁(第一军医大学珠江医院心内科，广东 广州 510282)；王建安(军事医学科学院基础医学研究所分子免疫实验室，北京 100850)；李五举(军事医学科学院基础医学研究所分子免疫实验室，北京 100850)；沈倍奋(军事医学科学院基础医学研究所分子免疫实验室，北京 100850)
关键词：人心肌肌钙蛋白T；基因表达；心力衰竭
第一军医大学学报000304 摘要: 目的 构建人心肌肌钙蛋白T(cTnT)亚型的重组载体。 方法 应用RT-PCR技术，从人胚胎心肌组织中扩增cTnT1及cTnT2基因，连接到T Easy vector载体上，筛选重组子。结果 成功地扩增出cTnT1(764 bp)及cTnT2(124)基因片段，经测序证实，构建pExSecI-cTnT1表达载体并获得表达。结论 获得单一亚型的cTnT1及cTnT2基因片段，为研究心力衰竭时的胚胎型基因重构与发病关系提供了依据。
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中图分类号：R542.2；R378.2 文献标识码：A 文章编号：1000-2588 (2000)-03-0204-03
Cloning and expression of human fetal cardiac troponin T isoform
LU Qing1, LAI Chun-ning2, LI Zhi-liang1, WANG Jian-an2, LI Wu-ju2, SHEN Bei-fen2
(1Department of Cardiology, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510280, China; 2Laboratory of Molecular Immunology, Institute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China)Abstract: Objective To construct recombinant vector for human fetal cardiac troponin T (cTnT) isoform. Methods The cTnT1 and cTnT2 genes were amplified from human fetal cardiac muscular tissue by RT-PCR, and then cloned into T Easy vector. Results The cTnT1 (764 bp) and cTnT2 (124 bp) genes were successfully amplified and their sequences tested, which were cloned into pExSecI vector and expressed by induction at IPTG for 4 h. Conclusions cTnT1 was highly expressed in BL21 transformant with expression level above 18%. These results prepared molecular basis for further research of human cardiac troponin T isoform expressed during heart failure.
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Key words: human cardiac troponin T; isoform; gene expression; heart failure
心肌肌钙蛋白T(cTnT)是一种心肌特异性抗原。近年来研究[1]表明，心肌损伤后4 h血中cTnT浓度开始升高，24 h达到峰值，可持续5～7 d。心力衰竭时衰竭心肌存在心肌收缩蛋白或调节蛋白成分的胚胎型基因重构，cTnT胚胎型基因可以表现为多种形式(如cTnT1～cTnT8)，而cTnT2为其在正常成人成熟期心肌中的唯一表达形式。当心肌细胞肥厚时，cTnT的胚胎型基因发生瞬时表达，主要表现为 cTnT1、cTnT3、cTnT4的再表达 [1、3 、4]。因此，cTnT1的mRNA水平和蛋白水平升高与心力衰竭密切相关 [3]。本研究从人心肌组织中获取cTnT1及cTnT2基因片段，成功构建了pExSecI-cTnT1表达载体并在大肠杆菌中获得表达。
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1 材料和方法
1.1材料
1.1.1质粒与菌株 pBv220、pExSecI质粒，宿主菌E.coli DH5α、JM109、BL21等均由军事医学科学院三所四室提供。
1.1.2主要试剂 限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Klenow酶、Taq酶、AMV酶及X-Gal、IPTG、T Easy-vector试剂盒均购自Promega公司；质粒和PCR产物纯化试剂盒购自Clontech公司；Trizol及mRNA纯化试剂盒购自Gibco公司。
1.1.3寡核苷酸引物 根据文献[1、4]，应用Goldkey软件设计两对引物，引物合成由CyberSyn公司完成。
上游引物P1： 5’-CGGAATTCATGGAGCAGGAAGAGC AGGAG-3’ EcoR I；下游引物P2： 5’-CGGGATCCTTACTGCTTGAACTTCTCCTG-3 Bam HI；上游引物P3：5’-GC GAAGAGTACGAGGAGGAGG AGC-3’；下游引物P4： 5’-GC AGCCTCTGCTTCAGCATCC-3’。
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1.1.4组织来源 非心脑畸型病变引产的胚胎，胎龄20～24 周。
1.2 方法
1.2.1 RNA提取及mRNA的纯化 取胎心肌组织1 g于液氮环境下捣碎，加入6 ml Trizol试剂，室温放置10 min，氯仿粗提、异丙醇沉淀、乙醇清洗后溶于100 μl灭菌水中，mRNA(0.04 g/L)纯化处理参照试剂盒说明书进行。
1.2.2 RT-PCR反应 依次加入10 mmol/L dNTPs 1 μl、9 U/μl AMV 1 μl、5×AMV 缓冲液4 μl、随机引物0.2 μg、Rnasin(RNA酶抑制剂)0.4 μl及mRNA 1 μl，反应总体积20 μl。室温放置10 min后置42℃、50 min。cTnT1的PCR以P1及P2为引物，分两步进行：(1)低严谨性：94℃、45 s，35℃、1 min，72℃、1 min，5个循环；(2)高严谨性：94℃、45 s，60℃、1 min，72℃、1 min，35个循环；72℃、8 min延伸。cTnT2的PCR反应以P3及P4为引物，按以下步骤进行：94℃、45 s，62℃、1 min，72℃、1 min，35个循环，72℃、8 min延伸，1.5%琼脂糖电泳观察结果。
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1.2.3重组载体的构建 将特异PCR片段与T Easy vector 连接，方法参照T Easy vector 试剂盒说明书，提取质粒，EcoR I酶切，筛选重组子。
1.2.4 cTnT1基因表达载体的构建 用表达载体pExSecI-cTnT1及pBv220-cTnT1分别转化E.coliDH5α及BL21宿主菌，经温度诱导及IPTG诱导，SDS-PAGE电泳观察不同载体的表达量，并对表达条件进行优化 [8]。
1.2.5表达产物Western 印迹鉴定 将SDS-PAGE电泳条带转至硝酸纤维滤膜上，经5%(w/V)脱脂奶粉封闭、洗膜，加入鼠抗人cTnT单克隆抗体，37℃、2 h，洗膜，再加入HRP-兔抗鼠IgG温育1 h，最后TMB显色 [7、8]。
2 结果
, http://www.100md.com 2.1 cTnT1及cTnT2 cDNA的RT-PCR
cTnT1及cTnT2的上游引物设计于核苷酸链缺失区(参照cTnT4，图1)。以设计合成的寡核苷酸片段为引物，将从心肌组织提取的mRNA经RT-PCR得到约760 bp(cTnT1)及约120 bp(cTnT2)的扩增条带。
图1 5’端cTnT1和cTnT2核苷酸缺失区
Fig.1 5’alternatively spliced region defined by
the oligonucleotide pair to mRNAs cTnT1 and cTnT2
2.2 构建T Easy vector-cTnT2重组载体
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将cTnT1及cTnT2特异PCR条带与T Easy vector连接，转化E.coliDH5α宿主菌，挑取菌斑，提取质粒，经EcoR I酶切，得到目的基因条带(图2)。
图2 质粒T Easy vector-cTnT1/cTnT2的鉴定
Fig.2 Restriction mapping of the T vector-cTnT1 and T vector-cTnT2
1:DNA Marker (DL-2000); 2:T Easy vector-cTnT1 (PCR, 760 bp); 3: T
Easy vector-cTnT2 (PCR, 120 bp); 4: T Easy vector-cTnT1 (SacI, 367 bp)
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2.3 T Easy vector-cTnT1/cTnT2重组载体的鉴定
2.3.1 PCR方法鉴定 以T Easy vector-cTnT1/cTnT2为模板PCR扩增出约760 bp及120 bp的产物，T Easy vector空载体未扩增出相应条带。
2.3.2特异酶切鉴定 因cTnT1片段 397 bp处及T Easy vector 108 bp处均有Sac I单一酶切位点，故将T Easy vector-cTnT1质粒经Sac I酶切，得到367 bp特异条带，证实所筛选重组子为反向连接(图2)。
2.4 序列分析
ABI377型DNA序列分析仪完成测序工作，与文献[1]结果一致(图3)。
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图3 cTnT1和cTnT2基因片段的核苷酸序列
Fig.3 Partial nucleotide sequences of cTnT1 and cTnT2
2.5 表达载体的诱导表达
pBv220-cTnT1经温度诱导表达，pExSecI-cTnT1经IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳均可见相对分子质量约为31000的表达带(pBv220-cTnT1)及50 000的表达带(pExSecI-cTnT1)，符合预计值。但pBv220-cTnT1的诱导表达率为10%左右，pExSecI-cTnT1的诱导表达率为18%左右(图4)。
图4 pBv220-cTnT1和pExSecI-cTnT1的表达
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Fig.4 Expression of pBv220-cTnT1and pExSacI-cTnT1
1: Standard protein molecular weight; 2, 7: Noninduced with pExSecI-cTnT1;
3: IPTG induced with pExSecI-cTnT1 (50 kD); 4: Noninduced with pBv220-cTnT1;
5: Induced with pBv220-cTnT1(31 kD); 6: E.coli DH5α;
8: Purified pExSecI-cTnT1 protein (50 kD)
2.6 表达产物的Western印迹鉴定
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经诱导表达的cTnT1 Western 印迹结果显示，在相对分子质量约为31 000和50 000处均呈现单一、清晰条带，而未经诱导表达的菌液则无相应条带。
3 讨论
近年来，国外有关cTnT作为心血管疾病的特异、敏感诊断指标的研究很多，国内则未见报道。Townsend[1]及 Anderson[4]等分别报道了心力衰竭时cTnT亚型的表达，Laurence[2、3]等则进行了衰竭心肌与正常心肌cTnT亚型的mRNA和蛋白表达水平的研究。本研究从心肌组织中直接获得了cTnT1及cTnT2基因，为研究心血管疾病与cTnT胚胎型基因重构的动态变化之间的关系提供了依据。
国外研究均从人心肌基因文库中获得靶基因，但在本研究中获得cTnT特异基因片段时较为困难，因cTnT基因在心肌基因组RNA中丰度极低，而cTnT亚型(cTnT1～cTnT8)之间存在90%以上的同源性[1、4]，唯有通过设计严谨、特异的引物及进行mRNA的富集方有可能达到目的。因cTnT2基因为cTnT在正常成人心肌细胞中的唯一表达方式，它与cTnT其它亚型的同源互补更高达95%，所以借助计算机软件分析，将上游引物设计在78～99 bp处，下游引物则设计在143～161 bp处，横跨cTnT2特异缺失区。尽管如此，因为cTnT2基因片段仅为124 bp，故在PCR时仍然有多条非特异条带出现，最后选定62℃、1 min为退火条件。cTnT2基因片段的获得为后续探针标记应用于心衰的基础研究打下了基础。cTnT1引物则在5＇端引入EcoR I酶切位点及ATG起始码，3＇端引入Bam HI酶切位点及TTA终止码，便于PCR产物的装载。用Goldkey软件分析，引物GC含量合适，引物自身不形成发夹结构或二聚体，且与模板完全匹配。
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在cTnT1的诱导表达过程中，应用计算机软件对pBv220-cTnT1的外源基因表达量进行了预测，获得高效表达模式[6]。pBv220载体为Pr启动子，采用温度诱导，重组蛋白主要以包涵体形式存在，有文献[5]报道cTnT本身一方面易发生蛋白水解，另一方面在高浓度尿素存在时仍有聚集倾向，故构建的pBv220-cTnT1则存在可溶性表达低、包涵体复性困难等问题。本研究将pBv220-cTnT1的特异基因改建在pExSecI载体上，以pExSecI为T7起动子，采用IPTG诱导，经转化E.coli BL21获得了高效可溶性表达。
致谢 感谢军事医学科学院基础医学研究所分子免疫室黎 燕、倪长源、胡美茹、郭燕翔、郑 宇、裴武红、洪海燕等老师的指导和帮助。
全军重点医学科学院开放实验室基金资助(97028)
陆青(1971-)，女，湖南长沙人，1983年毕业于第一军医大学，专科，主管技师
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陆青(第一军医大学珠江医院心内科，广东 广州 510282)
参考文献
[1] Townsend PJ, Barton PJ, Yacoub MH et al. Molecular cloning of human cardiac troponin T isoforms: expression in developing and failing heart[J]. J Mol Cell Cardiol, 1995, 27: 2223～36.
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