体外IFN-γ对小鼠腹腔巨噬细胞抗瘤作用的影响
作者：覃汉军 江中喜
单位：覃汉军(广东医学院微生物免疫学教研室，湛江 524023)；江中喜(广州医学院附属二院免疫室，广州 510182)
关键词：干扰素Ⅱ型；小鼠；巨噬细胞；肿瘤
广东医学院学报000304
摘要 目的：研究干扰素γ(IFN-γ)对小鼠腹腔巨噬细胞(MΦ)抗瘤作用的影响机制。方法：用MTT法测定IFN-γ对小鼠腹腔MΦ杀伤肿瘤细胞效应的影响，并用ELISA测定IFN-γ作用MΦ后MΦ产生INF-α、IL-1和NO的量。结果：用50～100U/mLIFN-γ可激活小鼠MΦ，促进TNF-α、IL-1，NO分泌，提高MΦ细胞毒性。结论：IFN-γ能活化MΦ，并使其分泌TNF-α、NO等物质参与杀伤肿瘤细胞。
【中图分类号】R 73-3 【文献标识码】A
, 百拇医药
文章编号：1005-4057(2000)03-0237-02
Effect of IFN-γ on the antitumor mechanism of murine peritoneal
macrophages in vitro
Qin Hanjun
(Department of Microbiology and Immunology，Guangdong Medical College，Zhanjiang 524023)
Jiang Zhongxi
(Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College，Guangzhou 510182)
, 百拇医药
Abstract Objective：To study the effects of IFN-γ on the antitumor mechanism of murine peritoneal macrophages in vitro.Methods：The effect of IFN-γ on the antitumor mechanism of murine peritoneal macrophages was tested by MTT method.After treated with IFN-γ，MΦ secreted IFN-γ，IL-1 and NO，and the level of them was detected by ELISA.Results：When treated with 50～100 U/mL of IFN-γ，MΦ was activated and produced significant amounts of INF-α，IL-1，NO.Meanwhile，the effect of macrophage mediated-cytotoxicity was increased.Conclusion：IFN-γ could activate MΦ and made it secrete TNF-α and NO，which involved in killing tumor cells.
, 百拇医药
Key words：interferon-γ；mice；macrophage；tumor
IFN-γ是MΦ的强效激活剂。目前关于干扰素γ(IFN-γ)对巨噬细胞(MΦ)抗瘤作用的影响机制研究时有报道，但对其机理仍末明了。故本文拟就IFN-γ诱导小鼠MΦ产生TNF-α、IL-1、NO和细胞毒作用等几方面进行了研究，从而为肿瘤免疫理论和细胞因子的肿瘤免疫治疗提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料
正常ICR(Swiss Hauschka)小鼠雄性，体重(20±2)g(广州医学院动物中心提供)；小鼠黑色素瘤细胞系B16/F1和成纤维细胞L929(均购自中国科学院细胞库)。主要试剂：IL-1和TNF-α标准品购自深圳晶美生物工程公司；MTT购自Sigma公司；IFN-γ(105U/mL)购自北京帮定公司(中国军事医学科学院北京四环生物制品厂产品，批号：990903)。
, 百拇医药
1.2 方法
IFN-γ对小鼠MΦ细胞毒作用影响测定参照文献[1]用MTT法进行，酶联仪570nm测OD值，按以下公式计算：杀伤率＝[1-(实验孔平均OD值-效应孔平均OD值)/靶细胞孔平均值]×100%。TNF-α的测定[2]以L929为靶细胞的结晶紫染色法在酶联仪570nm波长处比色，按下式计算其毒性指数(CI)
IL-1以小鼠胸腺细胞作为检测细胞用间接MTT法测定[1，2]。NO的检测取上清100μL，据重氮化反应法[3]加Griess试剂100μL，置37℃10min后用酶联仪550nm测A值。统计学方法采用方差分析和t检验。
2 结果
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2.1 不同浓度IFN-γ对小鼠腹腔MΦ细胞毒作用的影响 见表1。
表1 IFN-γ不同量对小鼠腹腔MΦ细胞毒作用的影响 IFN-γ(U/mL)
实验次数
MΦ杀伤率(
±s)%
100
100
24±1**
50
100
23±2**
, http://www.100md.com
10
100
10±1*
0(对照)
100
8±2
与对照比较：*P>0.05 **P<0.052.2 不同浓度IFN-γ对小鼠腹腔MΦ诱生TNF-α、IL-1、NO的影响 见表2。
表2表明：50～100U/mLIFN-γ作用小鼠MΦ能有效激活MΦ，并诱生TNF-α、IL-1、NO等分泌物。
表2 IFN-γ不同量对小鼠腹腔MΦ诱生TNF-α、IL-1、NO水平的影响(±s) IFN-γ
, http://www.100md.com
(U/mL)
实验次数
TNF-α
(U/mL)
IL-1
(U/mL)
NO
(A值)
100
100
15.2±2**
16.5±2**
, 百拇医药
0.34±0.1**
50
100
14.8±1**
16.8±2**
0.33±0.05*
10
100
5.2±1
3±1
0.30±0.13
, 百拇医药 0(对照)
100
4.1±2
2±1
0.24±0.12
与对照比较：* P<0.05 **P<0.01
3 讨论
IFN-γ在免疫应答中起着重要的作用。一定浓度的IFN-γ能直接抑制肿瘤细胞，更重要的是能够使肿瘤细胞和抗原提呈细胞表面的粘附分子和MHC抗原表达明显增高。此外，IFN-γ是一种重要的MΦ活化因子，可增强MΦ的杀伤肿瘤细胞活性和抗原处理加工及提呈能力。巨噬细胞活化双重信号激活学说表明，巨噬细胞活化需经预激信号(如IFN-γ)和触发信号(如LPS)的作用，首先经预激信号使巨噬细胞处于预激状态，再经触发信号使巨噬细胞处于完全活化，充分发挥其功能。本研究发现IFN-γ作用MΦ一定时间后，MΦ杀伤肿瘤细胞的活性显著提高，这提示肿瘤细胞的膜性物质有如LPS起触发信号作用。我们还发现MΦ经50～100 U/mL IFN-γ 作用后能产生高水平的TNF-α、IL-1、NO，这可能是IFN-γ和肿瘤细胞膜性物质联合作用于MΦ的结果，而上述激活因子对MΦ有自激活作用，从而进一步增强了杀伤肿瘤细胞效应。已有实验表明[3，4]IFN-γ与第2信号(TNF-α/IL-2/LPS)协同诱导MΦ合成的NO，是活化MΦ对肿瘤细胞毒作用的效应分子之一。NO主要是与肿瘤细胞的DNA合成酶、线粒体呼吸酶的活性部位Fe-s基结合，形成铁一硝酰基复合物，抑制呼吸链中的电子传递，抑制肿瘤细胞的能量合成和DNA复制，导致肿瘤细胞死亡或生长抑制。另外，TNF-α本身通过超氧化物产生，肿瘤出血坏死等表现有抗瘤作用，而与IFN-γ协同诱生NO可加强抗瘤作用[3～5]。
, http://www.100md.com
作者简介：覃汉军，男，1967年11月出生，硕士，助教
参考文献
[1]Hussanin RF，Nouri AM，Oliver RT.A new approach for measurement of cytotoxicity using
colorimetric assay.J Immunol Methods，1993，160(1)：89～96
[2]汪谦主编.现代医学实验方法.人民卫生出版社，1997.480～505
[3]钟慈声，孙安阳主编.一氧化氮的生物医学.上海医科大学出版社，1997.90～120
[4]Jenkins DC，Charles IG，Thomsen LL，et al.Roles of nitric oxide in tumor growth.Proc Natl Acad Sci
USA，1995，92(10)：4 392～4398
[5]Liu W，Kurlander RJ.Analysis of the interrelationship between IL-12，INF-α，and IFN-γ production during murine listeriosis.Cell Immunol，1995，163(2)：260～267
收稿日期：2000-01-19
修订日期：2000-05-02, http://www.100md.com
单位：覃汉军(广东医学院微生物免疫学教研室，湛江 524023)；江中喜(广州医学院附属二院免疫室，广州 510182)
关键词：干扰素Ⅱ型；小鼠；巨噬细胞；肿瘤
广东医学院学报000304
摘要 目的：研究干扰素γ(IFN-γ)对小鼠腹腔巨噬细胞(MΦ)抗瘤作用的影响机制。方法：用MTT法测定IFN-γ对小鼠腹腔MΦ杀伤肿瘤细胞效应的影响，并用ELISA测定IFN-γ作用MΦ后MΦ产生INF-α、IL-1和NO的量。结果：用50～100U/mLIFN-γ可激活小鼠MΦ，促进TNF-α、IL-1，NO分泌，提高MΦ细胞毒性。结论：IFN-γ能活化MΦ，并使其分泌TNF-α、NO等物质参与杀伤肿瘤细胞。
【中图分类号】R 73-3 【文献标识码】A
, 百拇医药
文章编号：1005-4057(2000)03-0237-02
Effect of IFN-γ on the antitumor mechanism of murine peritoneal
macrophages in vitro
Qin Hanjun
(Department of Microbiology and Immunology，Guangdong Medical College，Zhanjiang 524023)
Jiang Zhongxi
(Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College，Guangzhou 510182)
, 百拇医药
Abstract Objective：To study the effects of IFN-γ on the antitumor mechanism of murine peritoneal macrophages in vitro.Methods：The effect of IFN-γ on the antitumor mechanism of murine peritoneal macrophages was tested by MTT method.After treated with IFN-γ，MΦ secreted IFN-γ，IL-1 and NO，and the level of them was detected by ELISA.Results：When treated with 50～100 U/mL of IFN-γ，MΦ was activated and produced significant amounts of INF-α，IL-1，NO.Meanwhile，the effect of macrophage mediated-cytotoxicity was increased.Conclusion：IFN-γ could activate MΦ and made it secrete TNF-α and NO，which involved in killing tumor cells.
, 百拇医药
Key words：interferon-γ；mice；macrophage；tumor
IFN-γ是MΦ的强效激活剂。目前关于干扰素γ(IFN-γ)对巨噬细胞(MΦ)抗瘤作用的影响机制研究时有报道，但对其机理仍末明了。故本文拟就IFN-γ诱导小鼠MΦ产生TNF-α、IL-1、NO和细胞毒作用等几方面进行了研究，从而为肿瘤免疫理论和细胞因子的肿瘤免疫治疗提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料
正常ICR(Swiss Hauschka)小鼠雄性，体重(20±2)g(广州医学院动物中心提供)；小鼠黑色素瘤细胞系B16/F1和成纤维细胞L929(均购自中国科学院细胞库)。主要试剂：IL-1和TNF-α标准品购自深圳晶美生物工程公司；MTT购自Sigma公司；IFN-γ(105U/mL)购自北京帮定公司(中国军事医学科学院北京四环生物制品厂产品，批号：990903)。
, 百拇医药
1.2 方法
IFN-γ对小鼠MΦ细胞毒作用影响测定参照文献[1]用MTT法进行，酶联仪570nm测OD值，按以下公式计算：杀伤率＝[1-(实验孔平均OD值-效应孔平均OD值)/靶细胞孔平均值]×100%。TNF-α的测定[2]以L929为靶细胞的结晶紫染色法在酶联仪570nm波长处比色，按下式计算其毒性指数(CI)
IL-1以小鼠胸腺细胞作为检测细胞用间接MTT法测定[1，2]。NO的检测取上清100μL，据重氮化反应法[3]加Griess试剂100μL，置37℃10min后用酶联仪550nm测A值。统计学方法采用方差分析和t检验。
2 结果
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2.1 不同浓度IFN-γ对小鼠腹腔MΦ细胞毒作用的影响 见表1。
表1 IFN-γ不同量对小鼠腹腔MΦ细胞毒作用的影响 IFN-γ(U/mL)
实验次数
MΦ杀伤率(
±s)%100
100
24±1**
50
100
23±2**
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10
100
10±1*
0(对照)
100
8±2
与对照比较：*P>0.05 **P<0.052.2 不同浓度IFN-γ对小鼠腹腔MΦ诱生TNF-α、IL-1、NO的影响 见表2。
表2表明：50～100U/mLIFN-γ作用小鼠MΦ能有效激活MΦ，并诱生TNF-α、IL-1、NO等分泌物。
表2 IFN-γ不同量对小鼠腹腔MΦ诱生TNF-α、IL-1、NO水平的影响(
±s) IFN-γ, http://www.100md.com
(U/mL)
实验次数
TNF-α
(U/mL)
IL-1
(U/mL)
NO
(A值)
100
100
15.2±2**
16.5±2**
, 百拇医药
0.34±0.1**
50
100
14.8±1**
16.8±2**
0.33±0.05*
10
100
5.2±1
3±1
0.30±0.13
, 百拇医药 0(对照)
100
4.1±2
2±1
0.24±0.12
与对照比较：* P<0.05 **P<0.01
3 讨论
IFN-γ在免疫应答中起着重要的作用。一定浓度的IFN-γ能直接抑制肿瘤细胞，更重要的是能够使肿瘤细胞和抗原提呈细胞表面的粘附分子和MHC抗原表达明显增高。此外，IFN-γ是一种重要的MΦ活化因子，可增强MΦ的杀伤肿瘤细胞活性和抗原处理加工及提呈能力。巨噬细胞活化双重信号激活学说表明，巨噬细胞活化需经预激信号(如IFN-γ)和触发信号(如LPS)的作用，首先经预激信号使巨噬细胞处于预激状态，再经触发信号使巨噬细胞处于完全活化，充分发挥其功能。本研究发现IFN-γ作用MΦ一定时间后，MΦ杀伤肿瘤细胞的活性显著提高，这提示肿瘤细胞的膜性物质有如LPS起触发信号作用。我们还发现MΦ经50～100 U/mL IFN-γ 作用后能产生高水平的TNF-α、IL-1、NO，这可能是IFN-γ和肿瘤细胞膜性物质联合作用于MΦ的结果，而上述激活因子对MΦ有自激活作用，从而进一步增强了杀伤肿瘤细胞效应。已有实验表明[3，4]IFN-γ与第2信号(TNF-α/IL-2/LPS)协同诱导MΦ合成的NO，是活化MΦ对肿瘤细胞毒作用的效应分子之一。NO主要是与肿瘤细胞的DNA合成酶、线粒体呼吸酶的活性部位Fe-s基结合，形成铁一硝酰基复合物，抑制呼吸链中的电子传递，抑制肿瘤细胞的能量合成和DNA复制，导致肿瘤细胞死亡或生长抑制。另外，TNF-α本身通过超氧化物产生，肿瘤出血坏死等表现有抗瘤作用，而与IFN-γ协同诱生NO可加强抗瘤作用[3～5]。
, http://www.100md.com
作者简介：覃汉军，男，1967年11月出生，硕士，助教
参考文献
[1]Hussanin RF，Nouri AM，Oliver RT.A new approach for measurement of cytotoxicity using
colorimetric assay.J Immunol Methods，1993，160(1)：89～96
[2]汪谦主编.现代医学实验方法.人民卫生出版社，1997.480～505
[3]钟慈声，孙安阳主编.一氧化氮的生物医学.上海医科大学出版社，1997.90～120
[4]Jenkins DC，Charles IG，Thomsen LL，et al.Roles of nitric oxide in tumor growth.Proc Natl Acad Sci
USA，1995，92(10)：4 392～4398
[5]Liu W，Kurlander RJ.Analysis of the interrelationship between IL-12，INF-α，and IFN-γ production during murine listeriosis.Cell Immunol，1995，163(2)：260～267
收稿日期：2000-01-19
修订日期：2000-05-02, http://www.100md.com