尖锐湿疣患者自然杀伤细胞活性及其与血清白介素-12关系的研究
作者：杨朝晖 钱起丰 吴志华
单位：杨朝晖(广东省花都市人民医院，花都 510800)；钱起丰(深圳市皮肤病研究所，深圳 518029)；吴志华(广东医学院附属医院，湛江 524001)
关键词：尖锐湿疣；白介素12；自然杀伤细胞
广东医学院学报000302 摘要 目的：研究尖锐湿疣(CA)患者自然杀伤(NK)细胞活性及其与血清白介素12(IL-12)水平的关系，探讨其发病机理。方法：应用NK细胞毒性试验乳酸脱氢酶释放法(LDH-释放法)测定32例CA患者NK细胞的活性；用抗体夹心ELISA法检测其血清中IL-12水平；并对其NK细胞活性与血清IL-12水平作相关分析。结果：CA患者NK细胞活性明显低于正常对照组(P<0.05)；血清IL-12水平明显低于正常对照组(P<0.05)；NK细胞活性与血清IL-12水平呈正相关(r＝0.8919，P<0.01)。结论：CA患者IL-12水平低下所导致的一系列免疫抑制效应(包括在病毒早期感染时)，不能有效地启动Th1型细胞对病毒抗原的应答反应以及增强T细胞和NK细胞活性，从而在CA发病机理中起着重要的作用。
, 百拇医药
【中图分类号】 R 752.53 【文献标识码】 A
文章编号：1005-4057(2000)02-0233-02
Natural killer cell activity and its relationship with interleukin-12
in patients with condyloma acuminatum
Yang Zhaohui Qian Qifeng Wu Zhihua
(uadu Municipal People＇s Hospital，Guangdong，510800)
Abstract Objective：To study natural killer(NK) cell activity and its relationship with interleukin-12(IL-12) in patients with condyloma acuminatum(CA).Methods：NK cell activity was determined in 32 cases of CA patients using lactate dehydrogenase (LDH) release cytoroxicity assay.Serum IL-12 levels were detected by ELISA.Correlation analysis was conducted between NK cell activity and IL-12 level in patients with CA.Results：The activity of NK cell was lower in patients with CA then that of controls (P<0.05).The serum IL-12 level in CA patients decreased markedly as compared with normal control (P<0.05)，and positive correlation was found between the IL-12 level and NK cell activity in patients with CA(r＝0.8919，P<0.01).Conclusion：The decreased IL-12 level in CA patients could down-regualte a series of cellular immune events，including failure to effectively trigger type Th 1 cells response to viral antigen and to enhance T cell or NK cell activities in early stage of viral infections，which may be responsible for the pathogenesis of CA.
, 百拇医药
Key words：condyloma acuminatum；interleukin-12；natural killer cell；immune regulation
近年来，人乳头瘤病毒(HPV)感染率明显上升，以往对尖锐湿疣(CA)的研究多集中于HPV，而近期研究发现细胞免疫功能异常者感染HPV的机会增加。80年代对CA的细胞免疫研究进展迅速，有学者[1]发现CA患者外周血自然杀伤(NK)细胞(CD16、CD57)的数目增多，而活化NK细胞(CD16+HLA-DR+)数正常，但其活性降低，NK活性降低可能与HPV感染持久与扩散有关。而90年代学者们又开始研究细胞因子在CA发病机理中的作用，已发现与CA的发生发展密切相关的细胞因子有：IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、1L-15和TNF。为进一步探讨宿主细胞免疫在CA的发生与转归中的作用，本文研究了NK细胞活性、IL-12与CA发病的关系，结果报道如下。
, http://www.100md.com
1 资料与方法
1.1 对象
32例CA患者均依据我国卫生部防疫司1991年指定的CA诊断标准，其中男40例，女10例。年龄20～72岁，平均32.9岁。病程7d～3 a，平均7.6个月，其中在3月以内者为短病程，共11例；3月以上者为长病程，共21例。绝大多数患者有非婚性接触史。随机选择30例正常人作对照。
1.2 采用LDH-释放法检测NK细胞的活性
1.2.1 靶细胞的准备用含10%小牛血清的1640培养基连续传代培养K562细胞系备用。实验前1d传代，用1640工作液洗2次后，用台盼兰染色后计数，要求活细胞在95%以上，最后调整靶细胞计数为3×105/mL。
1.2.2 效应细胞的制备 取待检者静脉血3～4mL，肝素抗凝，用1640工作液 1：1稀释，试管内加入3～4mL淋巴细胞分离液，将稀释血液缓慢铺于分离液之上，水平离心2000r/min×20min。吸取中间细胞层(即效应细胞)，用1640工作液洗涤2次，并调整细胞浓度至3×106/mL备用。
, http://www.100md.com
1.2.3NK细胞活性的测定效应细胞和靶细胞按10∶1比例接种于96孔培养板，每个标本设双复孔，混匀细胞后，置于37℃、5%(体积分数)CO2环境中培育2h。取出培养板，每孔吸取上清液100μL，分别置于空白孔内，并加入新鲜配制的酶底物工作液100μL/孔，置37℃3～4min后，每孔加50μL1N盐酸终止反应。然后用酶标仪测OD490值，取每组(复孔)的平均值，按下列公式计算NK细胞的活性。
1.3血清IL-12的检测
采用双抗体夹心ELISA法。在抗人IL-2单抗包被的微孔板内加入样品稀释液50μL，然后加入50μL的标准品及血清样品(做双复孔)，用塑料胶纸封盖，置37℃2h，PBS洗涤5次，加入100μL链霉亲和素，置37℃15min，PBS洗涤5次，加H2O-TMB底物溶液100μL，在室温下孵育20min，最后加入1.8NH2SO4100μL终止反应。以波长450/630nm 处测定A值，作标准曲线，计算出样品含量(ng/L)。
, http://www.100md.com
1.4 统计学处理
实验结果采用SDAT统计学软件作t检验及直线回归分析。
2 结果
CA患者NK细胞活性为(8.10±0.63)%，低于正常人的(22.24±1.37)%，差异有非常显著性(P<0.001)。短、长病程组的NK细胞活性差异无显著性(P>0.05)[(9.00±0.93)%vs(7.86±0.93)%]。CA患者IL-12水平为(97.06±8.84)%)，低于正常人的(137.04±12.99)，差异有显著性(P<0.05)。CA患者NK细胞活性与血清中IL-12的水平呈正相关(r＝0.8919，P<0.01)。
3 讨论
3.1 CA患者NK细胞的活性
, 百拇医药 NK细胞是独特的淋巴细胞亚群，不需抗原刺激，不需识别MHC分子即可介导抗病毒和抗肿瘤的作用，并发挥免疫监视作用，还可通过分泌细胞因子调节免疫应答和造血功能。目前，已公认NK细胞具有抗病毒作用，而且其反应十分迅速，每次免疫反应中可调动大部分NK细胞参与。在病毒感染早期NK细胞活性多增高，当NK活性下降时，常导致病毒播散及病毒滴度增加，进而引起病毒持续性感染。因此NK细胞被誉为是机体抗病毒的前哨，也是反映机体细胞免疫功能的重要指标。本实验结果显示CA患者的NK细胞活性明显低于正常对照组(P<0.001)，不同病程CA患者的NK细胞活性差异无显著性(P>0.05)，表明NK细胞活性在CA的发生发展中起有重要的作用。
3.2 CA患者血清IL-12水平
IL-12最初被称作自然杀伤细胞刺激因子(natural killer cell stimulatory facter，NKSF)或细胞毒性淋巴细胞成熟因子(cytotoxic lymphocyte maturation factor，CLMF)，是由单核/巨噬细胞、B淋巴细胞在免疫应答中产生的细胞因子。体外研究表明，IL-12可明显刺激静止或激活的外周血淋巴细胞、T细胞和NK细胞分泌INF-γ[2，3]。但对静止的细胞需要辅助细胞的参与，IL-12可通过调节Th1和Th2细胞亚群启动细胞免疫[4，6]。已证明IL-12是Th1细胞产生的必须因子，它可以引起Th1细胞分化，同时抑制有IL-12介导的Th2细胞分化。在体外用过敏原作用于CD4+细胞，导致生成Th2型细胞，分泌高浓度IL-4和低浓度的IFN-γ。Hsich[7]等发现能刺激INF-γ产生的细胞因子——IL-12，可以诱导Th前体细胞向Th1细胞分化，从而启动细胞介导免疫。综上可见，IL-12是细胞介导免疫发生的关键因素。本研究发现CA患者血清中tIL-12水平比正常对照组显著降低，说明CA患者由于IL-12低下而导致的一系列细胞免疫反应抑制效应，尤其是Th1细胞介导的免疫，致使T细胞、NK细胞活性降低及其产生的IFN-γ水平下降[8]，使机体对外来病毒清除与抵抗力下降，且溶解和破坏病毒感染靶细胞能力下降，从而促使CA的发生。
, 百拇医药
3.3 CA患者NK细胞的活性与血清IL-12水平的关系
本研究发现CA患者血清IL-12水平与NK细胞的活性呈正相关性，说明血清中IL-12水平与NK细胞的活性有良好的依赖关系。产生此结果可能有以下原因：一方面IL-12有诱导静止和活化细胞、NK细胞产生IFN；而IFN-γ是巨噬细胞(MΦ)活化因子(MAF)的主体，通过此路径活化MΦ[9]，使MΦ产生更多的IL-12，从而促进NK细胞的活性。另一方面，IFN-γ是NK细胞活性的最强烈激活剂[10]，它可以促进NK细胞上IL-2R密度增加，来促进NK细胞的活性。同时也有人认为，IL-12促进了NK细胞表面粘附分子的表达，如CD2、CD11a和CD54 等，从而促进其对NK细胞的活性。另外，IL-12可促进IL-2激活的NK细胞杀伤活性。因此，上述任何一环节的缺乏，都会发生一系列的连锁反应，将导致机体对病毒侵袭的抵抗力大幅度下降。由此可见，血清中IL-12水平和NK细胞活性的相互关系在尖锐湿疣的发生与发展中起着重要作用。
, http://www.100md.com
基金项目：广东省卫生厅立项资助项目
作者简介：杨朝晖，1968年3月出生，硕士，住院医师
参考文献
[1]Avianovic NLH，Rabinowich YJ，Lee L，et al.Distinct phenotype and characteristics of human natural killer cells obtained by rapid interleukin 2 induced adherence to plastic.Cell Immunol，1993，151：133
[2]ChanSH，PerussiaB，GuptaJW，etal.Induction of interferon gamma production by natural killer cell stimulatory factor：characterization of the responder cells and the synergy with other induces.J Exp Med，1991，173：869
, 百拇医药
[3]Wu CY，Demeure C，Kiniwa M，et al.IL-12 induces the production of IFN-γ by neonatal human CD 4 T cells.J Immunol，1993，151：1938～1949
[4]Germann T，Gately MK，Schocnhaut DS，et al.Interleukin 12/T cell stimulating factor，a cytokine with multiple effects on T helper type 1(Th1)but not on Th2 cell.Eur J Immunol，1993，23：1 762～1 770
[5]Romani L，Mencacci A，Tonnetti L，et al.Interleukin 12 but not interferon-γ correlates with induction of T helper type-1 phenotype in murine candidiasis.Eur J Immunol，1994，24：909～915
, 百拇医药
[6]Schmitt E，Hoehn P，Germann T，et al.Differential effects of interleukin-12 on the development of naive mouse CD4+T cell.Eur J Immunol，1994，24：343～347
[7]Scott P.IL-12：Initiation cytokine for cell-mediated immunity.Science，1993，260：396～497
[8]钱起丰.尖锐湿疣患者血清白介素12及其可溶性受体的酶免疫检测.中国皮肤性病杂志，1996，10(3)：144
[9]Skeen MJ，Miller MA，Shinnick TM，et al.Regulation of murine macrophge IL-12 production.J Immunol 1995，156：1196
[10]Herberman RB.Immunoregulation and natural killer cells.
Mol Immunol，1982，19：1313
收稿日期：2000-03-24
修订日期：2000-05-23, 百拇医药
单位：杨朝晖(广东省花都市人民医院，花都 510800)；钱起丰(深圳市皮肤病研究所，深圳 518029)；吴志华(广东医学院附属医院，湛江 524001)
关键词：尖锐湿疣；白介素12；自然杀伤细胞
广东医学院学报000302 摘要 目的：研究尖锐湿疣(CA)患者自然杀伤(NK)细胞活性及其与血清白介素12(IL-12)水平的关系，探讨其发病机理。方法：应用NK细胞毒性试验乳酸脱氢酶释放法(LDH-释放法)测定32例CA患者NK细胞的活性；用抗体夹心ELISA法检测其血清中IL-12水平；并对其NK细胞活性与血清IL-12水平作相关分析。结果：CA患者NK细胞活性明显低于正常对照组(P<0.05)；血清IL-12水平明显低于正常对照组(P<0.05)；NK细胞活性与血清IL-12水平呈正相关(r＝0.8919，P<0.01)。结论：CA患者IL-12水平低下所导致的一系列免疫抑制效应(包括在病毒早期感染时)，不能有效地启动Th1型细胞对病毒抗原的应答反应以及增强T细胞和NK细胞活性，从而在CA发病机理中起着重要的作用。
, 百拇医药
【中图分类号】 R 752.53 【文献标识码】 A
文章编号：1005-4057(2000)02-0233-02
Natural killer cell activity and its relationship with interleukin-12
in patients with condyloma acuminatum
Yang Zhaohui Qian Qifeng Wu Zhihua
(uadu Municipal People＇s Hospital，Guangdong，510800)
Abstract Objective：To study natural killer(NK) cell activity and its relationship with interleukin-12(IL-12) in patients with condyloma acuminatum(CA).Methods：NK cell activity was determined in 32 cases of CA patients using lactate dehydrogenase (LDH) release cytoroxicity assay.Serum IL-12 levels were detected by ELISA.Correlation analysis was conducted between NK cell activity and IL-12 level in patients with CA.Results：The activity of NK cell was lower in patients with CA then that of controls (P<0.05).The serum IL-12 level in CA patients decreased markedly as compared with normal control (P<0.05)，and positive correlation was found between the IL-12 level and NK cell activity in patients with CA(r＝0.8919，P<0.01).Conclusion：The decreased IL-12 level in CA patients could down-regualte a series of cellular immune events，including failure to effectively trigger type Th 1 cells response to viral antigen and to enhance T cell or NK cell activities in early stage of viral infections，which may be responsible for the pathogenesis of CA.
, 百拇医药
Key words：condyloma acuminatum；interleukin-12；natural killer cell；immune regulation
近年来，人乳头瘤病毒(HPV)感染率明显上升，以往对尖锐湿疣(CA)的研究多集中于HPV，而近期研究发现细胞免疫功能异常者感染HPV的机会增加。80年代对CA的细胞免疫研究进展迅速，有学者[1]发现CA患者外周血自然杀伤(NK)细胞(CD16、CD57)的数目增多，而活化NK细胞(CD16+HLA-DR+)数正常，但其活性降低，NK活性降低可能与HPV感染持久与扩散有关。而90年代学者们又开始研究细胞因子在CA发病机理中的作用，已发现与CA的发生发展密切相关的细胞因子有：IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、1L-15和TNF。为进一步探讨宿主细胞免疫在CA的发生与转归中的作用，本文研究了NK细胞活性、IL-12与CA发病的关系，结果报道如下。
, http://www.100md.com
1 资料与方法
1.1 对象
32例CA患者均依据我国卫生部防疫司1991年指定的CA诊断标准，其中男40例，女10例。年龄20～72岁，平均32.9岁。病程7d～3 a，平均7.6个月，其中在3月以内者为短病程，共11例；3月以上者为长病程，共21例。绝大多数患者有非婚性接触史。随机选择30例正常人作对照。
1.2 采用LDH-释放法检测NK细胞的活性
1.2.1 靶细胞的准备用含10%小牛血清的1640培养基连续传代培养K562细胞系备用。实验前1d传代，用1640工作液洗2次后，用台盼兰染色后计数，要求活细胞在95%以上，最后调整靶细胞计数为3×105/mL。
1.2.2 效应细胞的制备 取待检者静脉血3～4mL，肝素抗凝，用1640工作液 1：1稀释，试管内加入3～4mL淋巴细胞分离液，将稀释血液缓慢铺于分离液之上，水平离心2000r/min×20min。吸取中间细胞层(即效应细胞)，用1640工作液洗涤2次，并调整细胞浓度至3×106/mL备用。
, http://www.100md.com
1.2.3NK细胞活性的测定效应细胞和靶细胞按10∶1比例接种于96孔培养板，每个标本设双复孔，混匀细胞后，置于37℃、5%(体积分数)CO2环境中培育2h。取出培养板，每孔吸取上清液100μL，分别置于空白孔内，并加入新鲜配制的酶底物工作液100μL/孔，置37℃3～4min后，每孔加50μL1N盐酸终止反应。然后用酶标仪测OD490值，取每组(复孔)的平均值，按下列公式计算NK细胞的活性。
1.3血清IL-12的检测
采用双抗体夹心ELISA法。在抗人IL-2单抗包被的微孔板内加入样品稀释液50μL，然后加入50μL的标准品及血清样品(做双复孔)，用塑料胶纸封盖，置37℃2h，PBS洗涤5次，加入100μL链霉亲和素，置37℃15min，PBS洗涤5次，加H2O-TMB底物溶液100μL，在室温下孵育20min，最后加入1.8NH2SO4100μL终止反应。以波长450/630nm 处测定A值，作标准曲线，计算出样品含量(ng/L)。
, http://www.100md.com
1.4 统计学处理
实验结果采用SDAT统计学软件作t检验及直线回归分析。
2 结果
CA患者NK细胞活性为(8.10±0.63)%，低于正常人的(22.24±1.37)%，差异有非常显著性(P<0.001)。短、长病程组的NK细胞活性差异无显著性(P>0.05)[(9.00±0.93)%vs(7.86±0.93)%]。CA患者IL-12水平为(97.06±8.84)%)，低于正常人的(137.04±12.99)，差异有显著性(P<0.05)。CA患者NK细胞活性与血清中IL-12的水平呈正相关(r＝0.8919，P<0.01)。
3 讨论
3.1 CA患者NK细胞的活性
, 百拇医药 NK细胞是独特的淋巴细胞亚群，不需抗原刺激，不需识别MHC分子即可介导抗病毒和抗肿瘤的作用，并发挥免疫监视作用，还可通过分泌细胞因子调节免疫应答和造血功能。目前，已公认NK细胞具有抗病毒作用，而且其反应十分迅速，每次免疫反应中可调动大部分NK细胞参与。在病毒感染早期NK细胞活性多增高，当NK活性下降时，常导致病毒播散及病毒滴度增加，进而引起病毒持续性感染。因此NK细胞被誉为是机体抗病毒的前哨，也是反映机体细胞免疫功能的重要指标。本实验结果显示CA患者的NK细胞活性明显低于正常对照组(P<0.001)，不同病程CA患者的NK细胞活性差异无显著性(P>0.05)，表明NK细胞活性在CA的发生发展中起有重要的作用。
3.2 CA患者血清IL-12水平
IL-12最初被称作自然杀伤细胞刺激因子(natural killer cell stimulatory facter，NKSF)或细胞毒性淋巴细胞成熟因子(cytotoxic lymphocyte maturation factor，CLMF)，是由单核/巨噬细胞、B淋巴细胞在免疫应答中产生的细胞因子。体外研究表明，IL-12可明显刺激静止或激活的外周血淋巴细胞、T细胞和NK细胞分泌INF-γ[2，3]。但对静止的细胞需要辅助细胞的参与，IL-12可通过调节Th1和Th2细胞亚群启动细胞免疫[4，6]。已证明IL-12是Th1细胞产生的必须因子，它可以引起Th1细胞分化，同时抑制有IL-12介导的Th2细胞分化。在体外用过敏原作用于CD4+细胞，导致生成Th2型细胞，分泌高浓度IL-4和低浓度的IFN-γ。Hsich[7]等发现能刺激INF-γ产生的细胞因子——IL-12，可以诱导Th前体细胞向Th1细胞分化，从而启动细胞介导免疫。综上可见，IL-12是细胞介导免疫发生的关键因素。本研究发现CA患者血清中tIL-12水平比正常对照组显著降低，说明CA患者由于IL-12低下而导致的一系列细胞免疫反应抑制效应，尤其是Th1细胞介导的免疫，致使T细胞、NK细胞活性降低及其产生的IFN-γ水平下降[8]，使机体对外来病毒清除与抵抗力下降，且溶解和破坏病毒感染靶细胞能力下降，从而促使CA的发生。
, 百拇医药
3.3 CA患者NK细胞的活性与血清IL-12水平的关系
本研究发现CA患者血清IL-12水平与NK细胞的活性呈正相关性，说明血清中IL-12水平与NK细胞的活性有良好的依赖关系。产生此结果可能有以下原因：一方面IL-12有诱导静止和活化细胞、NK细胞产生IFN；而IFN-γ是巨噬细胞(MΦ)活化因子(MAF)的主体，通过此路径活化MΦ[9]，使MΦ产生更多的IL-12，从而促进NK细胞的活性。另一方面，IFN-γ是NK细胞活性的最强烈激活剂[10]，它可以促进NK细胞上IL-2R密度增加，来促进NK细胞的活性。同时也有人认为，IL-12促进了NK细胞表面粘附分子的表达，如CD2、CD11a和CD54 等，从而促进其对NK细胞的活性。另外，IL-12可促进IL-2激活的NK细胞杀伤活性。因此，上述任何一环节的缺乏，都会发生一系列的连锁反应，将导致机体对病毒侵袭的抵抗力大幅度下降。由此可见，血清中IL-12水平和NK细胞活性的相互关系在尖锐湿疣的发生与发展中起着重要作用。
, http://www.100md.com
基金项目：广东省卫生厅立项资助项目
作者简介：杨朝晖，1968年3月出生，硕士，住院医师
参考文献
[1]Avianovic NLH，Rabinowich YJ，Lee L，et al.Distinct phenotype and characteristics of human natural killer cells obtained by rapid interleukin 2 induced adherence to plastic.Cell Immunol，1993，151：133
[2]ChanSH，PerussiaB，GuptaJW，etal.Induction of interferon gamma production by natural killer cell stimulatory factor：characterization of the responder cells and the synergy with other induces.J Exp Med，1991，173：869
, 百拇医药
[3]Wu CY，Demeure C，Kiniwa M，et al.IL-12 induces the production of IFN-γ by neonatal human CD 4 T cells.J Immunol，1993，151：1938～1949
[4]Germann T，Gately MK，Schocnhaut DS，et al.Interleukin 12/T cell stimulating factor，a cytokine with multiple effects on T helper type 1(Th1)but not on Th2 cell.Eur J Immunol，1993，23：1 762～1 770
[5]Romani L，Mencacci A，Tonnetti L，et al.Interleukin 12 but not interferon-γ correlates with induction of T helper type-1 phenotype in murine candidiasis.Eur J Immunol，1994，24：909～915
, 百拇医药
[6]Schmitt E，Hoehn P，Germann T，et al.Differential effects of interleukin-12 on the development of naive mouse CD4+T cell.Eur J Immunol，1994，24：343～347
[7]Scott P.IL-12：Initiation cytokine for cell-mediated immunity.Science，1993，260：396～497
[8]钱起丰.尖锐湿疣患者血清白介素12及其可溶性受体的酶免疫检测.中国皮肤性病杂志，1996，10(3)：144
[9]Skeen MJ，Miller MA，Shinnick TM，et al.Regulation of murine macrophge IL-12 production.J Immunol 1995，156：1196
[10]Herberman RB.Immunoregulation and natural killer cells.
Mol Immunol，1982，19：1313
收稿日期：2000-03-24
修订日期：2000-05-23, 百拇医药