陕西地区老年动脉粥样硬化群体Rb基因XbaI酶切位点多态性研究
作者：刘军 舒青 郑强荪 杜日映 张宁仔
单位：郑强荪 杜日映 张宁 仔刘军(第四军医大学唐都医院心脏内科)；舒青(第四军医大学生物学教研室，陕西 西安 710038)
关键词：动脉粥样硬化;Rb基因;XbaI;限制性片段长度多态性
心脏杂志000312摘要: 目的：探讨陕西地区老年动脉粥样硬化(AS)群体Rb基因内含子17多态性分布，及其该位点与AS遗传易感性的关系。方法：应用PCR对100例老年AS患者及100例对照组老年人Rb基因内含子17 XbaI酶切位点的限制性片段长度多态性(RFLP)进行对比分析。结果：在AS组及对照组中该位点共检出2种等位基因片段：945 bp(S1)及630 bp加315 bp(S2). AS组基因频率S1:0.46，S2:0.54，对照组基因频率S1:0.42，S2:0.58；二者的等位基因频率无显著差异。结论：Rb基因内含子17 XbaI酶切位点在AS群体中稳定性较高，不易发生突变，对AS的形成、发展可能影响较小。
, http://www.100md.com
中图号: R394.5 文献标识码:A
文章编号：1005-3271(2000)03-0196-02
Rb gene XbaI polymorphism in relation to atherosclerosis in Shaanxi elder population
LIU Jun,ZHENG Qiang-sun,DU Ri-ying,ZHANG Ning-zi
(Department of Cardiovasology, Tangdu Hospital)
SHU Qing
(Department of Biology, Fourth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi, China)
, 百拇医药
Abstract：AIM: To investigate the relationship between the polymorphism of Rb (intron17) in elder population of Shaanxi and atherosclerosis(AS) genetic susceptibility. METHODS: The polymorphism of Rb (intron17) were examined in 100 elder AS individuals and 100 elder control samples in Shaanxi by using PCR-Rb-XbaI-RFLP. RESULTS: There are 2 alletic fragments (945 bp, 630 bp+315 bp) were found in AS group and control group. S1S2 genotype was the most frequent one in the two populations. Allele frequency of AS group is S1 0.46, S2 0.54 and that of control group is S1 0.42,S2 0.58. Allele frequency was no differences in the two groups (P>0.05). CONCLUSION: XbaI site of Rb (intron17) could have been certainly stable in AS population, we infered it was not liable to cause mutation, and the locus might not make a notable impact to the occurrence and development of AS.
, 百拇医药
Key words:atherosclerosis; Rb gene; XbaI; restrict fragment length polymorphism
动脉粥样硬化(AS)是动脉平滑肌细胞(SMC)和巨噬细胞增殖为主的疾病[1]，它是许多心脑血管疾病发生的重要病理基础。目前AS的发生机制尚不十分明确，曾提出不少学说。近年来，关于AS形成的核心环节—SMC增殖及内膜下迁移，大量研究表明有多种癌基因与抑癌基因参与了此过程，但是抑癌基因在其中的作用还不清楚。Rb基因是一对维持细胞正常生长、抑制细胞增殖以及细胞周期循环起重要作用的抑癌基因，其功能的丧失与多种肿瘤的形成和发展关系密切。但是关于老年AS人群中Rb基因多态性的研究国内尚未见报道，为此我们应用限制性片段长度多态性(RFLP)技术，检测并分析了陕西地区老年AS人群及对照组人群Rb基因内含子17多态分布，探讨了该多态位点与AS遗传易感性的相关性。
1 对象和方法
, 百拇医药
1.1 对象 AS人群外周血样100 (男66，女34)例，年龄60±5岁，其中心肌梗死65例；余35例均经冠状动脉造影证实有狭窄和/或外周动脉血管多普勒超声发现有粥样斑块。对照组人群外周血样100 (男71，女29)例, 年龄62±7岁，均经冠状动脉造影和/或外周动脉血管多谱勒超声检查证实无狭窄和粥样斑块。
1.2 方法
1.2.1 DNA分离及PCR扩增 取静脉血4 ml，采用蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提法制备基因组DNA。参考Wiggs等[2]报道的Rb cDNA序列设计引物，引物由美联公司合成。其序列为：5′-TTGAACCTAACACGTTAACG-3′及5′-GGTAA
CAAGAAGTAACCTT-3′，扩增的目的片段长度为945 bp。PCR 方法同文献[3]，PCR反应体系：总体积30 μl. 10×Buffer 3 μl，引物浓度各为25 pmol/L，dNTP 200 μmol/L, TaqDNA聚合酶2.5 U(华美公司)，DNA模板约5 ng。PCR扩增条件：94℃变性45 s，48℃退火45 s，72℃延伸1 min，30个周期循环后，72℃延伸10 min结束PCR反应 (PCR仪为PE公司480型)。
, 百拇医药
1.2.2 PCR扩增产物的消化及电泳 方法同文献[3]。取18 μl PCR扩增产物，加8 U限制性内切酶XbaI及相应的缓冲液(华美公司)，37℃消化4 h后用10 g/L琼脂糖凝胶(Sigma公司)电泳，35 v电泳1 h，溴化乙锭染色，以PBR322/MSPI为标准分子量，紫外检测仪中观察结果并照像。
1.3 统计学处理 统计分析采用 SPSS 软件包。 对组间基因型频率及等位基因频率的差异用χ2检验。
2 结 果
2.1 老年AS人群中的2种等位基因片断 分析100例(200条染色体)陕西地区老年AS患者，发现2种等位基因片段: 945 bp(S1)及630 bp加315 bp(S2) (图1)。基因型频率为S1/S1:0.19，S1/S2:0.54 ，S2 /S2: 0.27 ；基因频率为S1:0.46，S2 :0.54。
, 百拇医药
2.2 对照组中的2种等位基因片断 分析的100例(200条染色体)陕西地区老年对照组人群中，发现2种等位基因片段：945 bp(S1)及630 bp加315 bp(S2)，基因型频率为S1/ S1:0.20，S1/S2 :0.45，S2 /S2 :0.35；基因频率为S1:0.42，S2: 0.58。
图 1 Rb基因内含子17 XbaI酶切位点VNTR的PCR扩增产物图(10 g/L琼脂糖电泳)
1～5为AS标本，6～9为对照组标本, 10为未被酶切的标本
2.3 AS组与对照组基因型频率、等位基因频率比较 两组均以S1 S2基因型较多，两组中基因型分布无显著差异(P>0.05)，两组间等位基因频率比较无显著差异(P>0.05,表1)。
, 百拇医药
表 1 AS组与对照组Rb基因内含子17基因型分布 组别
例数
基因型频率
等位基因频率
S1/S1
S1/S2
S2/S2
S1
S2
动脉粥样硬化组
, 百拇医药
100
19
54
27
0.46(92)
0.54(108)
对照组
100
20
45
35
0.42(85)
0.58(115)
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括弧内为所观察的等位基因数.3 讨论
Rb基因位于染色体13q14，是视网膜母细胞瘤易感基因。近年来在大量肿瘤病因学研究中，发现Rb基因的缺失或变异可导致多种肿瘤的发生。Rb基因的产物可作用于细胞分化周期G1/S控制点[4]，从而调节细胞周期、抑制细胞的过度增生。汪浩川等[5]在动物实验中发现Rb基因在AS动脉中表达减少。夏永静等[6]在动物实验中发现导入兔主动脉平滑肌细胞的Rb基因可抑制SMC生长.Aoki等[7]发现人主动脉平滑肌细胞被反义Rb基因寡脱氧核苷酸(ODN) 转染后，SMC 数目增多不明显。但是反义Rb基因ODN 单独转染SMC后，凋亡细胞明显增加，结果提示Rb基因对SMC的细胞周期起负调控，Rb基因的活性变化可能中介AS和再狭窄中SMC的生长。但Rb基因多态性与AS关系的研究目前尚未见报道。Wiggs[2]在Rb基因上发现5个多态位点，其中信息量最高的是位于位点17的VNTR序列p88PR0.6。本研究应用PCR-Rb-XbaI-RFLP方法检测该位点的多态性，我们通过对陕西地区老年100例AS及100例对照组人群Rb基因内含子17多态分布情况的分析，结果共发现2种等位基因片段：945 bp及630 bp加315 bp。老年AS人群中基因型频率与对照组人群比较后，未发现显著差异。结果提示：Rb基因p88PR0.6位点的遗传多态性与AS易感性的关系可能不太密切。但是本课题组在关于Rb基因1.20位点VNTR多态性与AS易感性的研究中发现(文章待发表)，AS组与对照组该位点上VNTR多态性有显著差异。Torri等[3] 在该位点检测的白种人等位基因频率为S1 0.55、S2 0.45，我们将其与对照组人群进行了比较也未发现显著差异。AS人群、对照组人群及白种人的Rb基因内含子17 XbaI酶切位点的多态性均无差异，推测该位点进化较保守，位于Rb基因的重要功能区，基因频率基本稳定，不易突变。AS的病因复杂，发病机制尚不完全清楚，它的发生、发展是多因素综合作用的结果。通过本实验得出XbaI酶切位点与AS的起始、发展未发现相关性，但由于未对AS斑块组织的Rb基因进行检测，因此是否有该位点发生突变而造成的Rb基因的异常、不稳定以至功能丧失参与了AS的形成与发展，尚不清楚，还有待于进一步深入研究。
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参考文献：
[1] Ross R. The pathogenesis of atherosclrosis: a perspective for the 1990s[J]. Nature, 1993,362(6423):801.
[2] Wiggs J, Magnus N, Yandell D, et al. Prediction of the risk of hereditary retinoblastoma, Using DNA polymorphisms within the retinoblastoma gene[J]. N Engl J Med,1988,318(3):151.
[3] Torri L., Glem S, David W, et al. Detection of the XbaI RFLP within the retinoblastoma locus by PCR[J]. Nucl Acids Res,1990,18(1):207.
, 百拇医药
[4] Dictor M,Ehinger M,mertens F, et al. Abnormal cell cycle regulation in malignancy[J]. Am J Clin pathol, 1999,112(1):S40.
[5] 汪浩川，刘秉文，傅明德等. 癌基因与抑癌基因在实验性动脉粥样硬化斑块中的转录表达[J]. 华西医科大学报,1996,27(2):117.
[6] 夏永静，蒋 雷，黎 健. 基因对血管平滑肌细胞生长抑制作用的研究[J]. 中华医学杂志,1997,77(4):252.
[7] Aoki M, Morishita R, Matsushita H, et al. Inhibition of the p53 tumor suppressor gene results in growth of human aortic vascular smooth muscle cells. Potential role of p53 in regulation of vascular smooth muscle cell growth[J]. Hypertension, 1999,34(2):192.
(收稿2000-03-27 修回2000-04-20), 百拇医药
单位：郑强荪 杜日映 张宁 仔刘军(第四军医大学唐都医院心脏内科)；舒青(第四军医大学生物学教研室，陕西 西安 710038)
关键词：动脉粥样硬化;Rb基因;XbaI;限制性片段长度多态性
心脏杂志000312摘要: 目的：探讨陕西地区老年动脉粥样硬化(AS)群体Rb基因内含子17多态性分布，及其该位点与AS遗传易感性的关系。方法：应用PCR对100例老年AS患者及100例对照组老年人Rb基因内含子17 XbaI酶切位点的限制性片段长度多态性(RFLP)进行对比分析。结果：在AS组及对照组中该位点共检出2种等位基因片段：945 bp(S1)及630 bp加315 bp(S2). AS组基因频率S1:0.46，S2:0.54，对照组基因频率S1:0.42，S2:0.58；二者的等位基因频率无显著差异。结论：Rb基因内含子17 XbaI酶切位点在AS群体中稳定性较高，不易发生突变，对AS的形成、发展可能影响较小。
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中图号: R394.5 文献标识码:A
文章编号：1005-3271(2000)03-0196-02
Rb gene XbaI polymorphism in relation to atherosclerosis in Shaanxi elder population
LIU Jun,ZHENG Qiang-sun,DU Ri-ying,ZHANG Ning-zi
(Department of Cardiovasology, Tangdu Hospital)
SHU Qing
(Department of Biology, Fourth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi, China)
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Abstract：AIM: To investigate the relationship between the polymorphism of Rb (intron17) in elder population of Shaanxi and atherosclerosis(AS) genetic susceptibility. METHODS: The polymorphism of Rb (intron17) were examined in 100 elder AS individuals and 100 elder control samples in Shaanxi by using PCR-Rb-XbaI-RFLP. RESULTS: There are 2 alletic fragments (945 bp, 630 bp+315 bp) were found in AS group and control group. S1S2 genotype was the most frequent one in the two populations. Allele frequency of AS group is S1 0.46, S2 0.54 and that of control group is S1 0.42,S2 0.58. Allele frequency was no differences in the two groups (P>0.05). CONCLUSION: XbaI site of Rb (intron17) could have been certainly stable in AS population, we infered it was not liable to cause mutation, and the locus might not make a notable impact to the occurrence and development of AS.
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Key words:atherosclerosis; Rb gene; XbaI; restrict fragment length polymorphism
动脉粥样硬化(AS)是动脉平滑肌细胞(SMC)和巨噬细胞增殖为主的疾病[1]，它是许多心脑血管疾病发生的重要病理基础。目前AS的发生机制尚不十分明确，曾提出不少学说。近年来，关于AS形成的核心环节—SMC增殖及内膜下迁移，大量研究表明有多种癌基因与抑癌基因参与了此过程，但是抑癌基因在其中的作用还不清楚。Rb基因是一对维持细胞正常生长、抑制细胞增殖以及细胞周期循环起重要作用的抑癌基因，其功能的丧失与多种肿瘤的形成和发展关系密切。但是关于老年AS人群中Rb基因多态性的研究国内尚未见报道，为此我们应用限制性片段长度多态性(RFLP)技术，检测并分析了陕西地区老年AS人群及对照组人群Rb基因内含子17多态分布，探讨了该多态位点与AS遗传易感性的相关性。
1 对象和方法
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1.1 对象 AS人群外周血样100 (男66，女34)例，年龄60±5岁，其中心肌梗死65例；余35例均经冠状动脉造影证实有狭窄和/或外周动脉血管多普勒超声发现有粥样斑块。对照组人群外周血样100 (男71，女29)例, 年龄62±7岁，均经冠状动脉造影和/或外周动脉血管多谱勒超声检查证实无狭窄和粥样斑块。
1.2 方法
1.2.1 DNA分离及PCR扩增 取静脉血4 ml，采用蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提法制备基因组DNA。参考Wiggs等[2]报道的Rb cDNA序列设计引物，引物由美联公司合成。其序列为：5′-TTGAACCTAACACGTTAACG-3′及5′-GGTAA
CAAGAAGTAACCTT-3′，扩增的目的片段长度为945 bp。PCR 方法同文献[3]，PCR反应体系：总体积30 μl. 10×Buffer 3 μl，引物浓度各为25 pmol/L，dNTP 200 μmol/L, TaqDNA聚合酶2.5 U(华美公司)，DNA模板约5 ng。PCR扩增条件：94℃变性45 s，48℃退火45 s，72℃延伸1 min，30个周期循环后，72℃延伸10 min结束PCR反应 (PCR仪为PE公司480型)。
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1.2.2 PCR扩增产物的消化及电泳 方法同文献[3]。取18 μl PCR扩增产物，加8 U限制性内切酶XbaI及相应的缓冲液(华美公司)，37℃消化4 h后用10 g/L琼脂糖凝胶(Sigma公司)电泳，35 v电泳1 h，溴化乙锭染色，以PBR322/MSPI为标准分子量，紫外检测仪中观察结果并照像。
1.3 统计学处理 统计分析采用 SPSS 软件包。 对组间基因型频率及等位基因频率的差异用χ2检验。
2 结 果
2.1 老年AS人群中的2种等位基因片断 分析100例(200条染色体)陕西地区老年AS患者，发现2种等位基因片段: 945 bp(S1)及630 bp加315 bp(S2) (图1)。基因型频率为S1/S1:0.19，S1/S2:0.54 ，S2 /S2: 0.27 ；基因频率为S1:0.46，S2 :0.54。
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2.2 对照组中的2种等位基因片断 分析的100例(200条染色体)陕西地区老年对照组人群中，发现2种等位基因片段：945 bp(S1)及630 bp加315 bp(S2)，基因型频率为S1/ S1:0.20，S1/S2 :0.45，S2 /S2 :0.35；基因频率为S1:0.42，S2: 0.58。
图 1 Rb基因内含子17 XbaI酶切位点VNTR的PCR扩增产物图(10 g/L琼脂糖电泳)
1～5为AS标本，6～9为对照组标本, 10为未被酶切的标本
2.3 AS组与对照组基因型频率、等位基因频率比较 两组均以S1 S2基因型较多，两组中基因型分布无显著差异(P>0.05)，两组间等位基因频率比较无显著差异(P>0.05,表1)。
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表 1 AS组与对照组Rb基因内含子17基因型分布 组别
例数
基因型频率
等位基因频率
S1/S1
S1/S2
S2/S2
S1
S2
动脉粥样硬化组
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100
19
54
27
0.46(92)
0.54(108)
对照组
100
20
45
35
0.42(85)
0.58(115)
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括弧内为所观察的等位基因数.3 讨论
Rb基因位于染色体13q14，是视网膜母细胞瘤易感基因。近年来在大量肿瘤病因学研究中，发现Rb基因的缺失或变异可导致多种肿瘤的发生。Rb基因的产物可作用于细胞分化周期G1/S控制点[4]，从而调节细胞周期、抑制细胞的过度增生。汪浩川等[5]在动物实验中发现Rb基因在AS动脉中表达减少。夏永静等[6]在动物实验中发现导入兔主动脉平滑肌细胞的Rb基因可抑制SMC生长.Aoki等[7]发现人主动脉平滑肌细胞被反义Rb基因寡脱氧核苷酸(ODN) 转染后，SMC 数目增多不明显。但是反义Rb基因ODN 单独转染SMC后，凋亡细胞明显增加，结果提示Rb基因对SMC的细胞周期起负调控，Rb基因的活性变化可能中介AS和再狭窄中SMC的生长。但Rb基因多态性与AS关系的研究目前尚未见报道。Wiggs[2]在Rb基因上发现5个多态位点，其中信息量最高的是位于位点17的VNTR序列p88PR0.6。本研究应用PCR-Rb-XbaI-RFLP方法检测该位点的多态性，我们通过对陕西地区老年100例AS及100例对照组人群Rb基因内含子17多态分布情况的分析，结果共发现2种等位基因片段：945 bp及630 bp加315 bp。老年AS人群中基因型频率与对照组人群比较后，未发现显著差异。结果提示：Rb基因p88PR0.6位点的遗传多态性与AS易感性的关系可能不太密切。但是本课题组在关于Rb基因1.20位点VNTR多态性与AS易感性的研究中发现(文章待发表)，AS组与对照组该位点上VNTR多态性有显著差异。Torri等[3] 在该位点检测的白种人等位基因频率为S1 0.55、S2 0.45，我们将其与对照组人群进行了比较也未发现显著差异。AS人群、对照组人群及白种人的Rb基因内含子17 XbaI酶切位点的多态性均无差异，推测该位点进化较保守，位于Rb基因的重要功能区，基因频率基本稳定，不易突变。AS的病因复杂，发病机制尚不完全清楚，它的发生、发展是多因素综合作用的结果。通过本实验得出XbaI酶切位点与AS的起始、发展未发现相关性，但由于未对AS斑块组织的Rb基因进行检测，因此是否有该位点发生突变而造成的Rb基因的异常、不稳定以至功能丧失参与了AS的形成与发展，尚不清楚，还有待于进一步深入研究。
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参考文献：
[1] Ross R. The pathogenesis of atherosclrosis: a perspective for the 1990s[J]. Nature, 1993,362(6423):801.
[2] Wiggs J, Magnus N, Yandell D, et al. Prediction of the risk of hereditary retinoblastoma, Using DNA polymorphisms within the retinoblastoma gene[J]. N Engl J Med,1988,318(3):151.
[3] Torri L., Glem S, David W, et al. Detection of the XbaI RFLP within the retinoblastoma locus by PCR[J]. Nucl Acids Res,1990,18(1):207.
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[4] Dictor M,Ehinger M,mertens F, et al. Abnormal cell cycle regulation in malignancy[J]. Am J Clin pathol, 1999,112(1):S40.
[5] 汪浩川，刘秉文，傅明德等. 癌基因与抑癌基因在实验性动脉粥样硬化斑块中的转录表达[J]. 华西医科大学报,1996,27(2):117.
[6] 夏永静，蒋 雷，黎 健. 基因对血管平滑肌细胞生长抑制作用的研究[J]. 中华医学杂志,1997,77(4):252.
[7] Aoki M, Morishita R, Matsushita H, et al. Inhibition of the p53 tumor suppressor gene results in growth of human aortic vascular smooth muscle cells. Potential role of p53 in regulation of vascular smooth muscle cell growth[J]. Hypertension, 1999,34(2):192.
(收稿2000-03-27 修回2000-04-20), 百拇医药