颈动脉窦诱导型一氧化氮合酶的抑制对压力感受性反射的影响
作者：乔怀宇 赵连友 杨学东 彭育红 徐海丽
单位：第四军医大学唐都医院心血管内科,陕西 西安 710038
关键词：一氧化氮合酶,诱导型；反义寡核苷酸；压力感受性反射；颈动脉窦
心脏杂志000301摘 要: 目的: 探讨SD大鼠颈动脉窦(CS)诱导型一氧化氮合酶(iNOS)与压力感受性反射(BR)及血压的关系。 方法: 合成的iNOS反义寡核苷酸(ASODN)和其正义链干预SD大鼠CS前后, 用生理记录仪同时记录血压和心率, 测定静脉注射苯肾上腺素(PE)引起的加压反应和压力感受性反射敏感度(BRS)及心率变化中点对应的血压值(MAP50)，CS处iNOS含量的变化通过免疫组化的方法测定,并对其CS的 iNOS进行免疫组化染色分析。 结果:①iNOS-ASODN 干预大鼠CS后, 加压反应较干预前减弱(24±3 vs 44±6 mm Hg, P<0.01,1 mmHg=0.133 kPa), 而iNOS正义链干预CS后加压反应较干预前无变化(37±9 vs 41±7 mm Hg, P>0.05);②iNOS-ASODN干预大鼠CS后, MAP50较干预前下降(135±6 vs 147±6 mm Hg, P<0.01), 压力心率曲线左移, 而iNOS正义链干预CS后, MAP50较干预前无差异(147±7 vs 146±7 mm Hg, P>0.05);③iNOS-ASODN干预 大鼠CS后, BRS较干预前升高(-3.6±0.5 vs -2.3±0.7 beat.s-1.mm Hg-1, P<0.01), 而iNOS正义链干预CS后BRS较干预前无变化(-2.5±0.5 vs -2.5±0.6 beat.s-1.mm Hg-1, P>0.05); ④iNOS-ASODN干预大鼠CS后, 对血压无影响(123±6 vs 121±4 mm Hg, P>0.05), iNOS正义链干预CS后对血压无影响(118±2 vs 121±5 mm Hg, P>0.05);⑤iNOS-ASODN干预大鼠CS后, CS的iNOS的免疫组化染色强度较正义链组减弱, 图象分析光密度结果相差显著(0.14±0.01 vs 0.19±0.02, P<0.01)。结论:大鼠CS处的iNOS基因被iNOS-ASODN抑制后, CS处iNOS的含量减少, 大鼠BR功能加强, 说明iNOS及由其产生的NO对BR有抑制作用。
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中图分类号：R331.32 文献标识码：A
文章编号：1005-3271(2000)03-0165-04
The effect of iNOS depression of carotid sinus on baroreflex
QIAO Huai-yu, ZHAO Lian-you, YANG Xue-dong, PENG Yu-hong, XU Hai-li
(Department of Cardiology, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710038,Shaanxi, China)
Abstract: AIM: To investigate the relation among inducible nitric oxide synthase (iNOS) gene of SD rat's carotid sinus and baroreflex and blood pressure. METHODS: Before and after the synthetic iNOS antisense oligodeoxynucleotides (iNOS-ASODN) and it's sense chain affecting SD rat's carotid sinus, blood pressure and heart rate were adopted by 6-channals physical recorder to measure the pressor response and baroreceptor sensitivity(BRS) to phenlephrine(PE) and blood pressure to the midpoint of heart rate change(MAP50), the content of iNOS of SD rat's carotid sinus was determined by immunohistochemistry. RESULTS:①After iNOS-ASODN affecting SD rat's CS, the pressor response to PE was decreased(24±3 vs 44±6 mm Hg, P<0.01), as iNOS sense chain had no effect on pressor response to PE(37±9 vs 41±7 mm Hg, P>0.05);②after iNOS-ASODN affecting SD rat's CS, MAP50 decreased (135±6 vs 147±6 mm Hg, P<0.01), the curve of blood pressure and heart rate shifted to left, but iNOS sense chain had no effect on MAP50(147±7 vs 146±7 mm Hg, P>0.05); ③after iNOS-ASODN affecting SD rat's CS, BRS was enhanced (-3.6±0.5 vs -2.3±0.7 beat.s-1.mm Hg-1, P<0.01), as iNOS sense chain had no effect on BRS(-2.5±0.5 vs -2.5±0.6 beat.s-1.mm Hg-1, P>0.05); ④iNOS-ASODN affecting SD rat's CS had no effect on blood pressure(123±6 vs 121±4 mm Hg, P>0.05), and iNOS sense chain also had no effect on blood pressure (118±2 vs 121±5 mm Hg, P>0.05); ⑤after iNOS-ASODN affecting SD rat's CS, the stain of iNOS immunohistochemistry was weaker than sense chain group, there were obvious difference between the results of their photo density (0.14±0.01 vs 0.19±0.02, P<0.01). CONCLUSION: After iNOS-ASODN affecting SD rat's CS, the concentration of iNOS decreased, the function of BR was enhanced. It implied that iNOS and it's producing NO of carotid sinus has a negative effect on BR.
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Key words:inducible nitric oxide synthase; antisense oligodeoxynucleotides; baroreflex; carotid sinus
压力感受性反射(BR)是高血压病发生的一个重要的原因, 有学者认为一氧化氮(NO)缺陷后, 先使BR受损, 而后致血压的慢性升高, 最终形成高血压[1]。亦有人认为NO有抑制BR的作用[2～4]。这可能与各实验用的是非特异性一氧化氮合酶(NOS)的抑制剂(L-NAME,L-NNA,L-NMMA), 且对动物多是全身用药, 缺乏对各型NOS作用的特异性有关, 从而导致研究结果不一致。本实验观察了大鼠颈动脉窦(CS)处的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因被其反义寡核苷酸(iNOS-ASODN)抑制后, CS处iNOS 及BR和血压的变化, 旨在探讨CS处iNOS对BR和血压的作用。
1 材料和方法
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1.1 iNOS-ASODN的构建 iNOS-ASODN序列为(5'-3')AGC CAT GTC TGT GAC TTT GTG (genebank No.D14051)[5], 同时构建其正义链, 序列为 (5'-3')CAC AAA GTC ACA GAC ATG GCT, 由BLAST软件确定序列的特异性, 序列由上海生物工程公司合成, PAGE 纯化, 纯度大于99%。 iNOS-ASODN和其正义链由Pluronic(Sigma产,上海华舜分装) 溶液溶解, 浓度为1 g/L, 保存于4℃[6]。
1.2 动物的选择 SD大鼠本校动物中心供应, 共24只, 体重250～300 g, 随机分为两组：对照组(两侧CS给予iNOS正义链)、实验组(两侧CS给予iNOS-ASODN), 每组12只, 雌雄各6只。动物在18～24℃饲养，普通饮食，随意饮水，每天保持12 h的光照。
1.3 基础血压和心率(HR)的测定 动物用戊巴比妥(40 mg/kg, 广州精细化工厂产)麻醉, 仰卧位固定, 股动脉插管, 将压力头连接于Hellige六导生理记录仪, 滤波后记录血压信号。将四个电极连接于大鼠的四肢, 同时记录心电信号, 计算HR。血压和心电信号的记录于大鼠股动、静脉结扎3 h后在麻醉状态下进行。
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1.4 压力感受性反射敏感度(BRS)和加压反应的测定 股静脉插管, 匀速缓慢给入苯肾上腺素(PE, 上海禾丰制药有限公司, 8～12 μg*kg-1*min-1), 平均动脉压(MAP)升高1～2 mm Hg/s, 同时记录HR, 每2 s采样一次[12], 观察HR随血压变动的情况, 由Logstic方程计算BRS[1]。HR=A/{1+exp[B(MAP-C)]}+D, BRS=-A(B/4), 其中A为HR变化的范围, B为斜率相关系数, C为HR变化中点对应的血压值(MAP50), D为最小的HR值，同时获得PE的加压反应值。
1.5 CS的处理 颈部正中切口, 长度3 cm, 分离肌肉, 暴露CS, 在CS的起始处, 每侧用微量注射器在外膜下局部注射溶液2 μl以上, Pluronic溶液在39℃下,可在局部形成一固态包裹层[6], 防止液体扩散。处理后, 将动物放回鼠笼, 7 d后, 再次在麻醉状态下, 用1.4的方法测定血压，BRS，MAP50、加压反应等值。
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1.6 免疫组织化学 测得iNOS-ASODN及其正义链对血压和BR的影响后，经SD大鼠左心室灌注PBS(pH 7.4)100 ml, 取出两侧CS。OCT包埋, 液氮速冻后, 做连续冰冻切片, 厚度5 μm。用多聚赖氨酸(Sigma产，洛阳SABC公司分装)处理的玻片贴片, 室温下用风扇吹干, 纯丙酮固定20 min。3 ml/L H2O2甲醇溶液20 min, 山羊血清封闭40 min。加入1∶100的兔抗大鼠iNOS 抗体(Sigma产,武汉博士德分装), 4℃过夜。生物素标记的羊抗兔抗体(武汉博士德),室温2 h。ABC复合物室温2 h。DAB显色。封片观察。
1.7 图象分析 实验组和对照组各取6只大鼠(雌雄各3只)，每只大鼠两侧CS各取4张切片，每两张切片相距150 μm, 进行图象分析。采用真彩色图象分析系统 CMIAS(北京航空航天大学和空军总医院共同研制)对免疫组化染色切片进行图象光密度的分析。
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1.8 统计学处理 各组之间进行t检验。
2 结果
2.1 对加压反应的影响 iNOS-ASODN干预 CS 后,加压反应与干预前的加压反应比较有显著差异(P<0.01)； iNOS正义链干预CS后的加压反应与干预前比较无统计学差异(P>0.05),见表1。
2.2 对MAP50的影响 iNOS-ASODN干预SD大鼠CS后, MAP50值较干预前下降(P<0.01)，压力HR曲线左移；iNOS正义链干预后的MAP50与干预前比较无统计学差异(P>0.05),见表1。
2.3 对BRS的影响 iNOS-ASODN干预SD大鼠CS后, BRS值较干预前升高(P<0.01)； iNOS正义链干预后的BRS与干预前比较无统计学的差异(P>0.05),表1。
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表 1 干预SD大鼠颈动脉窦前后的血压和压力反射各指标的变化 (
±s，n=12) 指标
时间
iNOS-ASODN组
正义链组
基础MAP(mm Hg)
前
121±4
121±5
后
123±6
118±2
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MAP50(mm Hg)
前
147±6
146±7
后
135±6b
147±7
加压反应(mm Hg)
前
44±6
41±7
后
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24±3b
37±9
BRS(beats/s/mmHg)
前
-2.3±0.7
-2.5±0.6
后
-3.7±0.5b
-2.5±0.5
免疫组化切片光密度
0.14±0.01d
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0.19±0.02
iNOS-ASODN:一氧化氦合酶反义寡核苷酸，MAP：平均动脉压，BRS：压力反射敏感度。与iNOS-ASODN干预前比较,bP<0.01。
2.4 对MAP的影响 iNOS-ASODN与正义链干预SD大鼠CS后, MAP与干预前比较均无统计学差异(P>0.05)，表1。
2.5 对CS处iNOS含量的影响 免疫组织化学方法显示 iNOS-ASODN干预组的CS处血管平滑肌和其滋养血管平滑肌及窦神经iNOS的染色强度弱于其正义链对照组(P<0.01), 图象分析的结果见表1。
3 讨论
Ditro 和Matsukawa指出有高血压病家族史的人和年轻人临界高血压BR的反馈调节作用减弱。说明高血压的发病与BR功能下降有关[7,8]。
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Scrogin的研究表明[1]，在大鼠饮水中加以非特异性NOS抑制剂L-NAME导致NO产生减少后，对BR的影响独立于对血压的影响。 NO下降可使包括CS在内的血管顺应性降低，压力作用下CS的变形力下降，窦神经传入冲动减弱，从而导致BR功能减弱，而后血压升高。以上文献提示NO缺陷后，BR损伤，从而导致高血压的发生。但亦有学者认为NO 有抑制BR的作用[2～4]。业已证实，NO可来源于3种NOS(eNOS，iNOS，nNOS)，其生理和病理作用不一，非特异性NOS抑制剂的具体作用位点和作用的NOS不明确，从而导致了多家的研究结果不同。
本实验结果显示：①iNOS-ASODN干预大鼠的CS后，CS局部血管平滑肌和其滋养血管的平滑肌iNOS的含量下降，说明此ASODN对iNOS基因的表达有封闭作用。其作用机制可能为ASODN与iNOS的mRNA结合，抑制其蛋白的表达，并且可促进mRNA的降解。②iNOS-ASODN干预正常大鼠CS后, 大鼠的MAP50下降。MAP50为HR减慢中点对应的血压值, 是HR相对于血压升高而减慢最快的血压范围。iNOS-ASODN干预CS后, 大鼠的MAP50下降, 这提示CS在iNOS-ASODN干预后感受血压升高的能力加强, 血压有轻微的改变, 即可激活BR对血压进行调节, 从而保持血压在一个稳定范围之内。③iNOS-ASODN干预正常大鼠CS后, BRS值即HR相对于血压升高而降低的最快速率增加，说明iNOS-ASODN干预大鼠的CS后，大鼠通过减慢HR对抗血压升高的能力加强，可使机体的血压水平保持在一个更稳定的水平。④iNOS-ASODN干预正常大鼠CS后，相同剂量和注射速度的PE引起的血压上升幅度减小，加压反应较干预前降低。说明iNOS-ASODN干预CS后, 神经系统对血压升高的调节能力加强, 使PE 的加压反应降低。大鼠CS的iNOS基因被其ASODN抑制后, 出现加压反应的减弱, MAP50的下降和BRS值的升高, 考虑和CS处压力感受器细胞膜电位受局部NO的影响有关。 Matsuda[10]在隔离灌流的家兔CS发现：NO, S-nitrosocysteine, 硫柳汞(NO合成兴奋剂)抑制窦神经放电频率和幅度，使BR阈值升高，BRS 下降。认为其机制为NO激活钙依赖性的钾离子通道，使压力感受器的细胞超极化，从而降低其活性。从本实验可以看出，CS处的iNOS 基因被抑制后，局部的iNOS的表达减少, 由其产生的NO量下降, 压力感受器细胞超极化程度降低，血压变动引起窦神经传入冲动增加，经神经中枢整合后，迷走神经的传出冲动加强，其调控HR的作用加强, 表现为BR对血压升高的感受灵敏度和调节灵敏度加强, HR随血压上升而下降的速率加快, 血压上升幅度降低。
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本实验还显示: iNOS-ASODN干预正常大鼠CS前后的血压无差异。说明增强的BR对正常大鼠血压无影响。而在对于增强的BR和高血压病之间关系的研究中，Muratani[11]认为依拉普利降低血压，在不影响HR、血浆血管紧张素II和去甲肾上腺素浓度的情况下，单通过升高BRS值，同样可使血压降至正常，提示BR系统可单独影响血压。由此可见, 用iNOS-ASODN干预高血压大鼠或人的CS,造成BR加强后,可能有治疗高血压的作用, 如果用转基因的方法将此ASODN加入CS,可能将已升高的血压降至正常,并保持长期的稳定。
本实验结果与Scrogin[1]的研究有差异, 考虑与对NO的干预方法不同有关, Scrogin对动物给以非特异性的NOS抑制剂,可同时作用于神经中枢和外周血管的各种NOS。而本实验对NO的影响,仅作用于CS处iNOS和由其产生的NO,从而导致结果的不一。另外其提出NO被抑制后,血管的平滑肌细胞可能增殖,造成血管的顺应性下降,CS的变形性下降,进而使BR的功能降低,而在本实验中,未观察到BR下降的现象,可能与NO被抑制的时间短,未出现平滑肌细胞的增殖有关,也有可能与本实验仅抑制了局部的iNOS,而未受影响的eNOS仍发挥着抑制细胞增殖的作用。关于此方面的研究,需进一步探讨.
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总之,正常SD大鼠CS处的iNOS基因被其 ASODN抑制后,CS处的iNOS的含量减少，对动物的基础血压无明显的影响,但BR通过调节HR来降低血压的能力加强,说明CS处由iNOS合成的大量NO 对BR有抑制作用，通过ASODN技术抑制其基因的表达，可加强BR调节血压的功能。
参考文献：
[1] Scrogin KE, Veelken R, Luft FC, et al. Sympathetic baroreceptor responses after chronic NG-nitro-L-argine methyl ester treatment in the concious rats[J]. Hypertension, 1994, 23(part2):982.
[2] Liu JL, Murakami H, Zucker IH. Effect of NO on baroreflex control of heart rate and renal nerve activity in concious rabbits[J]. Am J Physiol, 1996, 270 (Regulatory Intergrative Comp. Physiol 39):R1361.
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[3] Matsumura K, Abe I, Tsuchihashi T, et al. Central nitric oxide attenuates the baroreceptor reflex in the concious rabbits[J]. Am J Physiol, 1998; 274 (Regulatory Intergrative Comp Physiol. 43):R1142.
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[10] Muratani H, Kimura Y, Matsumura K, et al. Baroreceptor reflex in elderly essential hypertensive: effect of chronic inhibition of angiotensin converting enzyme[J]. Clin Exp Hypertens A,1990, 12(1): 97.
[11] Murakami H, Liu J L,Yoneyama H, et al. Blockade of neuronal nitric oxide synthase alters the baroflex control of heart rate in the rabbit. [J] Am J Physiol,1998;274(Regulatory Intergrative Comp Physiol. 43):R181.
(收稿 1999-11-12 修回 2000-02-11), 百拇医药
单位：第四军医大学唐都医院心血管内科,陕西 西安 710038
关键词：一氧化氮合酶,诱导型；反义寡核苷酸；压力感受性反射；颈动脉窦
心脏杂志000301摘 要: 目的: 探讨SD大鼠颈动脉窦(CS)诱导型一氧化氮合酶(iNOS)与压力感受性反射(BR)及血压的关系。 方法: 合成的iNOS反义寡核苷酸(ASODN)和其正义链干预SD大鼠CS前后, 用生理记录仪同时记录血压和心率, 测定静脉注射苯肾上腺素(PE)引起的加压反应和压力感受性反射敏感度(BRS)及心率变化中点对应的血压值(MAP50)，CS处iNOS含量的变化通过免疫组化的方法测定,并对其CS的 iNOS进行免疫组化染色分析。 结果:①iNOS-ASODN 干预大鼠CS后, 加压反应较干预前减弱(24±3 vs 44±6 mm Hg, P<0.01,1 mmHg=0.133 kPa), 而iNOS正义链干预CS后加压反应较干预前无变化(37±9 vs 41±7 mm Hg, P>0.05);②iNOS-ASODN干预大鼠CS后, MAP50较干预前下降(135±6 vs 147±6 mm Hg, P<0.01), 压力心率曲线左移, 而iNOS正义链干预CS后, MAP50较干预前无差异(147±7 vs 146±7 mm Hg, P>0.05);③iNOS-ASODN干预 大鼠CS后, BRS较干预前升高(-3.6±0.5 vs -2.3±0.7 beat.s-1.mm Hg-1, P<0.01), 而iNOS正义链干预CS后BRS较干预前无变化(-2.5±0.5 vs -2.5±0.6 beat.s-1.mm Hg-1, P>0.05); ④iNOS-ASODN干预大鼠CS后, 对血压无影响(123±6 vs 121±4 mm Hg, P>0.05), iNOS正义链干预CS后对血压无影响(118±2 vs 121±5 mm Hg, P>0.05);⑤iNOS-ASODN干预大鼠CS后, CS的iNOS的免疫组化染色强度较正义链组减弱, 图象分析光密度结果相差显著(0.14±0.01 vs 0.19±0.02, P<0.01)。结论:大鼠CS处的iNOS基因被iNOS-ASODN抑制后, CS处iNOS的含量减少, 大鼠BR功能加强, 说明iNOS及由其产生的NO对BR有抑制作用。
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中图分类号：R331.32 文献标识码：A
文章编号：1005-3271(2000)03-0165-04
The effect of iNOS depression of carotid sinus on baroreflex
QIAO Huai-yu, ZHAO Lian-you, YANG Xue-dong, PENG Yu-hong, XU Hai-li
(Department of Cardiology, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710038,Shaanxi, China)
Abstract: AIM: To investigate the relation among inducible nitric oxide synthase (iNOS) gene of SD rat's carotid sinus and baroreflex and blood pressure. METHODS: Before and after the synthetic iNOS antisense oligodeoxynucleotides (iNOS-ASODN) and it's sense chain affecting SD rat's carotid sinus, blood pressure and heart rate were adopted by 6-channals physical recorder to measure the pressor response and baroreceptor sensitivity(BRS) to phenlephrine(PE) and blood pressure to the midpoint of heart rate change(MAP50), the content of iNOS of SD rat's carotid sinus was determined by immunohistochemistry. RESULTS:①After iNOS-ASODN affecting SD rat's CS, the pressor response to PE was decreased(24±3 vs 44±6 mm Hg, P<0.01), as iNOS sense chain had no effect on pressor response to PE(37±9 vs 41±7 mm Hg, P>0.05);②after iNOS-ASODN affecting SD rat's CS, MAP50 decreased (135±6 vs 147±6 mm Hg, P<0.01), the curve of blood pressure and heart rate shifted to left, but iNOS sense chain had no effect on MAP50(147±7 vs 146±7 mm Hg, P>0.05); ③after iNOS-ASODN affecting SD rat's CS, BRS was enhanced (-3.6±0.5 vs -2.3±0.7 beat.s-1.mm Hg-1, P<0.01), as iNOS sense chain had no effect on BRS(-2.5±0.5 vs -2.5±0.6 beat.s-1.mm Hg-1, P>0.05); ④iNOS-ASODN affecting SD rat's CS had no effect on blood pressure(123±6 vs 121±4 mm Hg, P>0.05), and iNOS sense chain also had no effect on blood pressure (118±2 vs 121±5 mm Hg, P>0.05); ⑤after iNOS-ASODN affecting SD rat's CS, the stain of iNOS immunohistochemistry was weaker than sense chain group, there were obvious difference between the results of their photo density (0.14±0.01 vs 0.19±0.02, P<0.01). CONCLUSION: After iNOS-ASODN affecting SD rat's CS, the concentration of iNOS decreased, the function of BR was enhanced. It implied that iNOS and it's producing NO of carotid sinus has a negative effect on BR.
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Key words:inducible nitric oxide synthase; antisense oligodeoxynucleotides; baroreflex; carotid sinus
压力感受性反射(BR)是高血压病发生的一个重要的原因, 有学者认为一氧化氮(NO)缺陷后, 先使BR受损, 而后致血压的慢性升高, 最终形成高血压[1]。亦有人认为NO有抑制BR的作用[2～4]。这可能与各实验用的是非特异性一氧化氮合酶(NOS)的抑制剂(L-NAME,L-NNA,L-NMMA), 且对动物多是全身用药, 缺乏对各型NOS作用的特异性有关, 从而导致研究结果不一致。本实验观察了大鼠颈动脉窦(CS)处的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因被其反义寡核苷酸(iNOS-ASODN)抑制后, CS处iNOS 及BR和血压的变化, 旨在探讨CS处iNOS对BR和血压的作用。
1 材料和方法
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1.1 iNOS-ASODN的构建 iNOS-ASODN序列为(5'-3')AGC CAT GTC TGT GAC TTT GTG (genebank No.D14051)[5], 同时构建其正义链, 序列为 (5'-3')CAC AAA GTC ACA GAC ATG GCT, 由BLAST软件确定序列的特异性, 序列由上海生物工程公司合成, PAGE 纯化, 纯度大于99%。 iNOS-ASODN和其正义链由Pluronic(Sigma产,上海华舜分装) 溶液溶解, 浓度为1 g/L, 保存于4℃[6]。
1.2 动物的选择 SD大鼠本校动物中心供应, 共24只, 体重250～300 g, 随机分为两组：对照组(两侧CS给予iNOS正义链)、实验组(两侧CS给予iNOS-ASODN), 每组12只, 雌雄各6只。动物在18～24℃饲养，普通饮食，随意饮水，每天保持12 h的光照。
1.3 基础血压和心率(HR)的测定 动物用戊巴比妥(40 mg/kg, 广州精细化工厂产)麻醉, 仰卧位固定, 股动脉插管, 将压力头连接于Hellige六导生理记录仪, 滤波后记录血压信号。将四个电极连接于大鼠的四肢, 同时记录心电信号, 计算HR。血压和心电信号的记录于大鼠股动、静脉结扎3 h后在麻醉状态下进行。
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1.4 压力感受性反射敏感度(BRS)和加压反应的测定 股静脉插管, 匀速缓慢给入苯肾上腺素(PE, 上海禾丰制药有限公司, 8～12 μg*kg-1*min-1), 平均动脉压(MAP)升高1～2 mm Hg/s, 同时记录HR, 每2 s采样一次[12], 观察HR随血压变动的情况, 由Logstic方程计算BRS[1]。HR=A/{1+exp[B(MAP-C)]}+D, BRS=-A(B/4), 其中A为HR变化的范围, B为斜率相关系数, C为HR变化中点对应的血压值(MAP50), D为最小的HR值，同时获得PE的加压反应值。
1.5 CS的处理 颈部正中切口, 长度3 cm, 分离肌肉, 暴露CS, 在CS的起始处, 每侧用微量注射器在外膜下局部注射溶液2 μl以上, Pluronic溶液在39℃下,可在局部形成一固态包裹层[6], 防止液体扩散。处理后, 将动物放回鼠笼, 7 d后, 再次在麻醉状态下, 用1.4的方法测定血压，BRS，MAP50、加压反应等值。
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1.6 免疫组织化学 测得iNOS-ASODN及其正义链对血压和BR的影响后，经SD大鼠左心室灌注PBS(pH 7.4)100 ml, 取出两侧CS。OCT包埋, 液氮速冻后, 做连续冰冻切片, 厚度5 μm。用多聚赖氨酸(Sigma产，洛阳SABC公司分装)处理的玻片贴片, 室温下用风扇吹干, 纯丙酮固定20 min。3 ml/L H2O2甲醇溶液20 min, 山羊血清封闭40 min。加入1∶100的兔抗大鼠iNOS 抗体(Sigma产,武汉博士德分装), 4℃过夜。生物素标记的羊抗兔抗体(武汉博士德),室温2 h。ABC复合物室温2 h。DAB显色。封片观察。
1.7 图象分析 实验组和对照组各取6只大鼠(雌雄各3只)，每只大鼠两侧CS各取4张切片，每两张切片相距150 μm, 进行图象分析。采用真彩色图象分析系统 CMIAS(北京航空航天大学和空军总医院共同研制)对免疫组化染色切片进行图象光密度的分析。
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1.8 统计学处理 各组之间进行t检验。
2 结果
2.1 对加压反应的影响 iNOS-ASODN干预 CS 后,加压反应与干预前的加压反应比较有显著差异(P<0.01)； iNOS正义链干预CS后的加压反应与干预前比较无统计学差异(P>0.05),见表1。
2.2 对MAP50的影响 iNOS-ASODN干预SD大鼠CS后, MAP50值较干预前下降(P<0.01)，压力HR曲线左移；iNOS正义链干预后的MAP50与干预前比较无统计学差异(P>0.05),见表1。
2.3 对BRS的影响 iNOS-ASODN干预SD大鼠CS后, BRS值较干预前升高(P<0.01)； iNOS正义链干预后的BRS与干预前比较无统计学的差异(P>0.05),表1。
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表 1 干预SD大鼠颈动脉窦前后的血压和压力反射各指标的变化 (
±s，n=12) 指标时间
iNOS-ASODN组
正义链组
基础MAP(mm Hg)
前
121±4
121±5
后
123±6
118±2
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MAP50(mm Hg)
前
147±6
146±7
后
135±6b
147±7
加压反应(mm Hg)
前
44±6
41±7
后
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24±3b
37±9
BRS(beats/s/mmHg)
前
-2.3±0.7
-2.5±0.6
后
-3.7±0.5b
-2.5±0.5
免疫组化切片光密度
0.14±0.01d
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0.19±0.02
iNOS-ASODN:一氧化氦合酶反义寡核苷酸，MAP：平均动脉压，BRS：压力反射敏感度。与iNOS-ASODN干预前比较,bP<0.01。
2.4 对MAP的影响 iNOS-ASODN与正义链干预SD大鼠CS后, MAP与干预前比较均无统计学差异(P>0.05)，表1。
2.5 对CS处iNOS含量的影响 免疫组织化学方法显示 iNOS-ASODN干预组的CS处血管平滑肌和其滋养血管平滑肌及窦神经iNOS的染色强度弱于其正义链对照组(P<0.01), 图象分析的结果见表1。
3 讨论
Ditro 和Matsukawa指出有高血压病家族史的人和年轻人临界高血压BR的反馈调节作用减弱。说明高血压的发病与BR功能下降有关[7,8]。
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Scrogin的研究表明[1]，在大鼠饮水中加以非特异性NOS抑制剂L-NAME导致NO产生减少后，对BR的影响独立于对血压的影响。 NO下降可使包括CS在内的血管顺应性降低，压力作用下CS的变形力下降，窦神经传入冲动减弱，从而导致BR功能减弱，而后血压升高。以上文献提示NO缺陷后，BR损伤，从而导致高血压的发生。但亦有学者认为NO 有抑制BR的作用[2～4]。业已证实，NO可来源于3种NOS(eNOS，iNOS，nNOS)，其生理和病理作用不一，非特异性NOS抑制剂的具体作用位点和作用的NOS不明确，从而导致了多家的研究结果不同。
本实验结果显示：①iNOS-ASODN干预大鼠的CS后，CS局部血管平滑肌和其滋养血管的平滑肌iNOS的含量下降，说明此ASODN对iNOS基因的表达有封闭作用。其作用机制可能为ASODN与iNOS的mRNA结合，抑制其蛋白的表达，并且可促进mRNA的降解。②iNOS-ASODN干预正常大鼠CS后, 大鼠的MAP50下降。MAP50为HR减慢中点对应的血压值, 是HR相对于血压升高而减慢最快的血压范围。iNOS-ASODN干预CS后, 大鼠的MAP50下降, 这提示CS在iNOS-ASODN干预后感受血压升高的能力加强, 血压有轻微的改变, 即可激活BR对血压进行调节, 从而保持血压在一个稳定范围之内。③iNOS-ASODN干预正常大鼠CS后, BRS值即HR相对于血压升高而降低的最快速率增加，说明iNOS-ASODN干预大鼠的CS后，大鼠通过减慢HR对抗血压升高的能力加强，可使机体的血压水平保持在一个更稳定的水平。④iNOS-ASODN干预正常大鼠CS后，相同剂量和注射速度的PE引起的血压上升幅度减小，加压反应较干预前降低。说明iNOS-ASODN干预CS后, 神经系统对血压升高的调节能力加强, 使PE 的加压反应降低。大鼠CS的iNOS基因被其ASODN抑制后, 出现加压反应的减弱, MAP50的下降和BRS值的升高, 考虑和CS处压力感受器细胞膜电位受局部NO的影响有关。 Matsuda[10]在隔离灌流的家兔CS发现：NO, S-nitrosocysteine, 硫柳汞(NO合成兴奋剂)抑制窦神经放电频率和幅度，使BR阈值升高，BRS 下降。认为其机制为NO激活钙依赖性的钾离子通道，使压力感受器的细胞超极化，从而降低其活性。从本实验可以看出，CS处的iNOS 基因被抑制后，局部的iNOS的表达减少, 由其产生的NO量下降, 压力感受器细胞超极化程度降低，血压变动引起窦神经传入冲动增加，经神经中枢整合后，迷走神经的传出冲动加强，其调控HR的作用加强, 表现为BR对血压升高的感受灵敏度和调节灵敏度加强, HR随血压上升而下降的速率加快, 血压上升幅度降低。
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本实验还显示: iNOS-ASODN干预正常大鼠CS前后的血压无差异。说明增强的BR对正常大鼠血压无影响。而在对于增强的BR和高血压病之间关系的研究中，Muratani[11]认为依拉普利降低血压，在不影响HR、血浆血管紧张素II和去甲肾上腺素浓度的情况下，单通过升高BRS值，同样可使血压降至正常，提示BR系统可单独影响血压。由此可见, 用iNOS-ASODN干预高血压大鼠或人的CS,造成BR加强后,可能有治疗高血压的作用, 如果用转基因的方法将此ASODN加入CS,可能将已升高的血压降至正常,并保持长期的稳定。
本实验结果与Scrogin[1]的研究有差异, 考虑与对NO的干预方法不同有关, Scrogin对动物给以非特异性的NOS抑制剂,可同时作用于神经中枢和外周血管的各种NOS。而本实验对NO的影响,仅作用于CS处iNOS和由其产生的NO,从而导致结果的不一。另外其提出NO被抑制后,血管的平滑肌细胞可能增殖,造成血管的顺应性下降,CS的变形性下降,进而使BR的功能降低,而在本实验中,未观察到BR下降的现象,可能与NO被抑制的时间短,未出现平滑肌细胞的增殖有关,也有可能与本实验仅抑制了局部的iNOS,而未受影响的eNOS仍发挥着抑制细胞增殖的作用。关于此方面的研究,需进一步探讨.
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总之,正常SD大鼠CS处的iNOS基因被其 ASODN抑制后,CS处的iNOS的含量减少，对动物的基础血压无明显的影响,但BR通过调节HR来降低血压的能力加强,说明CS处由iNOS合成的大量NO 对BR有抑制作用，通过ASODN技术抑制其基因的表达，可加强BR调节血压的功能。
参考文献：
[1] Scrogin KE, Veelken R, Luft FC, et al. Sympathetic baroreceptor responses after chronic NG-nitro-L-argine methyl ester treatment in the concious rats[J]. Hypertension, 1994, 23(part2):982.
[2] Liu JL, Murakami H, Zucker IH. Effect of NO on baroreflex control of heart rate and renal nerve activity in concious rabbits[J]. Am J Physiol, 1996, 270 (Regulatory Intergrative Comp. Physiol 39):R1361.
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[3] Matsumura K, Abe I, Tsuchihashi T, et al. Central nitric oxide attenuates the baroreceptor reflex in the concious rabbits[J]. Am J Physiol, 1998; 274 (Regulatory Intergrative Comp Physiol. 43):R1142.
[4] Vasquez EC, Cunha RS, Cabral AM. Baroreceptor reflex function in rats submitted to chronic inhibition of nitric oxide synthasis[J]. Braz J Med Biol Res, 1994, 27:767.
[5] Noiri E, Peresleni T, Miller F, et al. In vivo targeting of inducible NO synthase with oligodeoxynucleotides protects rat kidney against ischemia[J]. J Clin Invest, 1996, 97(10):2377.
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[6] Simons M, Edelman ER, DeKeyser JL,et al. Antisense c-myb oligodeoxynucleotides inhibit intimal arterial smooth muscle cell accumulation in vivo[J]. Nature(1), 1992, 259(1):67.
[7] Ditro B. Carotid baroreflex sensitivity at rest and during psychological stress in offspring of hypertensive and non-twin sibling pairs[J]. Psychosom Med,1990, 52(6):610.
[8] Matsukawa T. Reduced arterial baroreflex control of muscle sympathetic nerve activity in young bordline hypertensives[J]. Funct Neueral,1991, 6(12):113.
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[9] Matsuda T, Bates JN, Lewis SJ, et al. Modulation of baroreceptor activity by nitric oxide and S-nitrosocysteine[J]. Circ Res(4), 1995, 76:426.
[10] Muratani H, Kimura Y, Matsumura K, et al. Baroreceptor reflex in elderly essential hypertensive: effect of chronic inhibition of angiotensin converting enzyme[J]. Clin Exp Hypertens A,1990, 12(1): 97.
[11] Murakami H, Liu J L,Yoneyama H, et al. Blockade of neuronal nitric oxide synthase alters the baroflex control of heart rate in the rabbit. [J] Am J Physiol,1998;274(Regulatory Intergrative Comp Physiol. 43):R181.
(收稿 1999-11-12 修回 2000-02-11), 百拇医药