混合脐血血浆用于CD3AK细胞培养的研究
作者：彭晓 张宏文 张文
单位：彭晓 (兰州医学院第一附属医院血液病研究室 兰州，730000)；张宏文 (兰州医学院第一附属医院血液病研究室 兰州，730000)；张文 (兰州医学院第一附属医院血液病研究室 兰州，730000)
关键词：脐血；血浆；血清；抗原；CD3
临床血液学杂志000314 摘要 目的：观察比较混合脐血血浆和成人AB血清在CD3AK细胞培养中的作用效果。方法：分别用混合脐血血浆和成人AB血清培养CD3AK细胞，检测两组细胞的增殖特性、杀伤活性及免疫表型。结果：混合脐血血浆组的增殖倍数略低于血清组，对K562、HL-60的杀伤活性则稍高于血清组，但差异均无显著性意义(均为P>0.05)；两组的免疫表型都以CD3+、CD8+为主，亦无显著性差异(P>0.05)。结论：混合脐血血浆在CD3AK等免疫效应细胞的培养中可能和成人AB血清具有相似的效果。
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Effect of mixed cord blood plasma on CD3AK cells culture
PENG Xiao
(The Haematology Research Laboratory of The First Affiliated Hospital
of Lanzhou Medical College,Lanzhou 730000)
ZHANG Hong-wen
(The Haematology Research Laboratory of The First Affiliated Hospital
of Lanzhou Medical College,Lanzhou 730000)
, 百拇医药
ZHANG Wen
(The Haematology Research Laboratory of The First Affiliated Hospital
of Lanzhou Medical College,Lanzhou 730000)
Abstract Objective:To compare and observe the effects of mixed cord blood plasma and adult AB serum on CD3AK cells culture.Methods:Use mixed cord blood plasma and adult AB serum to culture two groups CD3AK cells,measure the multiplication folds、cytoxicity and immune phenotypes of each group on different days of culture.Results:The results showed that the multiplication fold of mixed cord blood plasma groups was lower than that of adult AB serum group (P>0.05),the cytoxicity against K562 and HL-60 target cells of the plasma group was higher than the serum group,the immune phenotypes of two groups were both mainly CD3+and CD8+，but there had no statistical values (P>0.05,respectively).Conclusion:Suggested that the effects of mixed cord blood plasma on CD3AK cells culture were similar to that of adult AB serum.
, 百拇医药
Key words Cord blood Plasma Serum Antigens,CD3
近年来，对于脐血的研究重新引起了人们的重视，如脐血LAK细胞培养，脐血血浆用于造血干细胞体外扩增的研究等，但关于脐血血浆用于免疫效应细胞培养的研究却鲜见报道。鉴于此，为了解混合脐血血浆用于免疫效应细胞培养的效果，我们对其和成人AB血清两组CD3AK细胞进行了比较研究。
1 材料与方法
1.1 脐血采集及混合血浆的制备
无菌条件下采集足月顺产，年龄20～35岁健康产妇的胎儿脐带血，肝素20 U/ml抗凝。将采集的脐血20份(每份约50 ml)，500 r/min离心15 min，分离的血浆混合后再离心(1500 r/min离心15 min)，取上层血浆，置-20 ℃冷冻24 h，然后4 ℃融化，2000 r/min离心15 min，去除沉淀，经0.4 μm滤膜过滤除菌后分装，置-20 ℃贮存备用。
, 百拇医药
1.2 CD3AK细胞制备
常规分离脐血单个核细胞，以1×106/ml细胞浓度接种于24孔培养板，脐血血浆和成人AB血清浓度各为5%，CD3McAb 100 ng/ml，IL-2 1000 U/ml。37 ℃、5% CO2条件下培养21 d。
1.3 检测方法
T淋巴细胞亚群测定用APAAP法(试剂盒为北京邦定公司产品)，杀伤活性用MTT法〔1〕检测。统计学分析采用t检验。
2 结果
2.1 增殖情况
如表1所示，培养3、7、11、14、21 d，成人AB血清组增殖倍率略高于脐血血浆组，但二者差异无统计学意义(均为P>0.05)
, 百拇医药
表1 两组CD3AK细胞不同培养时间的增殖倍数
±s 时间
脐血血浆组
成人血清组
时间
脐血血浆组
成人血清组
3 d
0.86±0.04
0.89±0.05
14 d
18.20±1.33
, 百拇医药
18.64±1.42
7 d
4.15±0.32
4.21±0.36
21 d
23.46±2.18
24.89±2.31
11 d
8.96±0.65
9.03±0.72
两组比较P>0.05 (n=48)2.2 杀伤活性
在培养7、14 d时对K562和HL-60两种肿瘤细胞的杀伤活性，混合脐血血浆组稍高于成人AB血清组，但二者差异无显著意义(均为P>0.05)。见表2。
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2.3 T淋巴细胞亚群
两组都以CD3+、CD8+为主，且随着培养时间的延长，CD4+比例逐渐降低，而CD8+比例则逐渐升高，但二者差异不明显。见表3。
表2 两组细胞K562和HL-60靶细胞杀伤活性 E/T=20±s % 时间
细胞
脐血血浆组
成人血清组
7 d
K562
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HL-60
46.3±2.1
43.6±2.3
45.1±2.4
42.8±2.6
14 d
K562
HL-60
42.8±2.2
40.1±1.9
41.7±1.9
39.5±1.7
, 百拇医药
两组比较 P>0.05 (n=36)表3 两组细胞不同培养时间T淋巴细胞亚群比较±s 时
间
细胞
表型
脐血
血浆组
成人
血清组
时
间
细胞
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表型
脐血
血浆组
成人
血清组
7 d
CD3
CD4
CD8
84.32
46.80
50.43
82.69
, 百拇医药
44.98
47.83
14 d
CD3
CD4
CD8
86.74
38.36
55.84
85.72
37.32
53.78
两组比较 P>0.05 (n=36)
, 百拇医药
3 讨论
传统的免疫效应细胞等培养都使用成人AB血清，而其来源少、价格昂贵等缺陷则在一定程度上限制了对过继免疫治疗的研究。脐血血浆则具有来源广、价格便宜、ABO血型抗原性弱等优点，而且脐血血浆中富含多种造血生长因子，如能取代成人AB血清免疫效应细胞培养，不仅化废为宝、节省资源，还可望能提高增殖能力和杀伤活性。本实验结果显示，在培养前3 d，两组细胞都略有下降，其原因可能和细胞凋亡有关〔2〕。此后两组细胞都迅速增殖，均于培养第7天达到高峰，至培养第21天，两组细胞增殖均>20倍，且仍有增殖趋势。其中脐血血浆组CD3AK细胞不同培养天数的增殖倍率略低于成人AB血清组，但二者差异无显著意义(P>0.05)。另外，在培养第7、14天，两组细胞对K562、HL-60都有较强的杀伤活性，混合脐血血清组稍高于成人AB血清组，可能与其中含有多种造血生长因子有关，但二者差异无显著意义(P>0.05)。两组细胞表型均以CD3+、CD8+为主，随着培养时间的延长，CD3+比例无明显变化，而CD4+则逐渐下降，CD8+逐渐上升，但两组各项指标之间差异无显著性(均为P>0.05)。
参考文献
1，田志刚，张建华.MTT法在检测细胞因子与细胞毒效应中的应用.中国肿瘤生物杂志，1994，1：74～75
2，施广霞，程一翟，郭连英，等.CD3AK细胞介导的MHC非限制性溶瘤作用机制的初步研究.中国肿瘤生物治疗杂志，1996，3：211～213
收稿：1999-06-15, 百拇医药
单位：彭晓 (兰州医学院第一附属医院血液病研究室 兰州，730000)；张宏文 (兰州医学院第一附属医院血液病研究室 兰州，730000)；张文 (兰州医学院第一附属医院血液病研究室 兰州，730000)
关键词：脐血；血浆；血清；抗原；CD3
临床血液学杂志000314 摘要 目的：观察比较混合脐血血浆和成人AB血清在CD3AK细胞培养中的作用效果。方法：分别用混合脐血血浆和成人AB血清培养CD3AK细胞，检测两组细胞的增殖特性、杀伤活性及免疫表型。结果：混合脐血血浆组的增殖倍数略低于血清组，对K562、HL-60的杀伤活性则稍高于血清组，但差异均无显著性意义(均为P>0.05)；两组的免疫表型都以CD3+、CD8+为主，亦无显著性差异(P>0.05)。结论：混合脐血血浆在CD3AK等免疫效应细胞的培养中可能和成人AB血清具有相似的效果。
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Effect of mixed cord blood plasma on CD3AK cells culture
PENG Xiao
(The Haematology Research Laboratory of The First Affiliated Hospital
of Lanzhou Medical College,Lanzhou 730000)
ZHANG Hong-wen
(The Haematology Research Laboratory of The First Affiliated Hospital
of Lanzhou Medical College,Lanzhou 730000)
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ZHANG Wen
(The Haematology Research Laboratory of The First Affiliated Hospital
of Lanzhou Medical College,Lanzhou 730000)
Abstract Objective:To compare and observe the effects of mixed cord blood plasma and adult AB serum on CD3AK cells culture.Methods:Use mixed cord blood plasma and adult AB serum to culture two groups CD3AK cells,measure the multiplication folds、cytoxicity and immune phenotypes of each group on different days of culture.Results:The results showed that the multiplication fold of mixed cord blood plasma groups was lower than that of adult AB serum group (P>0.05),the cytoxicity against K562 and HL-60 target cells of the plasma group was higher than the serum group,the immune phenotypes of two groups were both mainly CD3+and CD8+，but there had no statistical values (P>0.05,respectively).Conclusion:Suggested that the effects of mixed cord blood plasma on CD3AK cells culture were similar to that of adult AB serum.
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Key words Cord blood Plasma Serum Antigens,CD3
近年来，对于脐血的研究重新引起了人们的重视，如脐血LAK细胞培养，脐血血浆用于造血干细胞体外扩增的研究等，但关于脐血血浆用于免疫效应细胞培养的研究却鲜见报道。鉴于此，为了解混合脐血血浆用于免疫效应细胞培养的效果，我们对其和成人AB血清两组CD3AK细胞进行了比较研究。
1 材料与方法
1.1 脐血采集及混合血浆的制备
无菌条件下采集足月顺产，年龄20～35岁健康产妇的胎儿脐带血，肝素20 U/ml抗凝。将采集的脐血20份(每份约50 ml)，500 r/min离心15 min，分离的血浆混合后再离心(1500 r/min离心15 min)，取上层血浆，置-20 ℃冷冻24 h，然后4 ℃融化，2000 r/min离心15 min，去除沉淀，经0.4 μm滤膜过滤除菌后分装，置-20 ℃贮存备用。
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1.2 CD3AK细胞制备
常规分离脐血单个核细胞，以1×106/ml细胞浓度接种于24孔培养板，脐血血浆和成人AB血清浓度各为5%，CD3McAb 100 ng/ml，IL-2 1000 U/ml。37 ℃、5% CO2条件下培养21 d。
1.3 检测方法
T淋巴细胞亚群测定用APAAP法(试剂盒为北京邦定公司产品)，杀伤活性用MTT法〔1〕检测。统计学分析采用t检验。
2 结果
2.1 增殖情况
如表1所示，培养3、7、11、14、21 d，成人AB血清组增殖倍率略高于脐血血浆组，但二者差异无统计学意义(均为P>0.05)
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表1 两组CD3AK细胞不同培养时间的增殖倍数
±s 时间脐血血浆组
成人血清组
时间
脐血血浆组
成人血清组
3 d
0.86±0.04
0.89±0.05
14 d
18.20±1.33
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18.64±1.42
7 d
4.15±0.32
4.21±0.36
21 d
23.46±2.18
24.89±2.31
11 d
8.96±0.65
9.03±0.72
两组比较P>0.05 (n=48)2.2 杀伤活性
在培养7、14 d时对K562和HL-60两种肿瘤细胞的杀伤活性，混合脐血血浆组稍高于成人AB血清组，但二者差异无显著意义(均为P>0.05)。见表2。
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2.3 T淋巴细胞亚群
两组都以CD3+、CD8+为主，且随着培养时间的延长，CD4+比例逐渐降低，而CD8+比例则逐渐升高，但二者差异不明显。见表3。
表2 两组细胞K562和HL-60靶细胞杀伤活性 E/T=20
±s % 时间细胞
脐血血浆组
成人血清组
7 d
K562
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HL-60
46.3±2.1
43.6±2.3
45.1±2.4
42.8±2.6
14 d
K562
HL-60
42.8±2.2
40.1±1.9
41.7±1.9
39.5±1.7
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两组比较 P>0.05 (n=36)表3 两组细胞不同培养时间T淋巴细胞亚群比较
±s 时间
细胞
表型
脐血
血浆组
成人
血清组
时
间
细胞
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表型
脐血
血浆组
成人
血清组
7 d
CD3
CD4
CD8
84.32
46.80
50.43
82.69
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44.98
47.83
14 d
CD3
CD4
CD8
86.74
38.36
55.84
85.72
37.32
53.78
两组比较 P>0.05 (n=36)
, 百拇医药
3 讨论
传统的免疫效应细胞等培养都使用成人AB血清，而其来源少、价格昂贵等缺陷则在一定程度上限制了对过继免疫治疗的研究。脐血血浆则具有来源广、价格便宜、ABO血型抗原性弱等优点，而且脐血血浆中富含多种造血生长因子，如能取代成人AB血清免疫效应细胞培养，不仅化废为宝、节省资源，还可望能提高增殖能力和杀伤活性。本实验结果显示，在培养前3 d，两组细胞都略有下降，其原因可能和细胞凋亡有关〔2〕。此后两组细胞都迅速增殖，均于培养第7天达到高峰，至培养第21天，两组细胞增殖均>20倍，且仍有增殖趋势。其中脐血血浆组CD3AK细胞不同培养天数的增殖倍率略低于成人AB血清组，但二者差异无显著意义(P>0.05)。另外，在培养第7、14天，两组细胞对K562、HL-60都有较强的杀伤活性，混合脐血血清组稍高于成人AB血清组，可能与其中含有多种造血生长因子有关，但二者差异无显著意义(P>0.05)。两组细胞表型均以CD3+、CD8+为主，随着培养时间的延长，CD3+比例无明显变化，而CD4+则逐渐下降，CD8+逐渐上升，但两组各项指标之间差异无显著性(均为P>0.05)。
参考文献
1，田志刚，张建华.MTT法在检测细胞因子与细胞毒效应中的应用.中国肿瘤生物杂志，1994，1：74～75
2，施广霞，程一翟，郭连英，等.CD3AK细胞介导的MHC非限制性溶瘤作用机制的初步研究.中国肿瘤生物治疗杂志，1996，3：211～213
收稿：1999-06-15, 百拇医药