耳鸣动物模型的建立及药物对大鼠耳鸣的影响
作者：施建蓉 胡寿铭
单位：施建蓉(上海中医药大学生理教研室，上海 200032)；胡寿铭(美国马里兰大学医 学院耳鸣研究中心)
关键词：耳鸣；动物模型；水杨酸钠；抗癫痫药；补肾中药
中国应用生理学杂志000322摘要 目的：建立耳鸣动物模型并测试药物对动物耳鸣的影响。方法：让动 物形成耳内有声音存在是安全的、而耳内无声音感往往伴随着危险因素这样一个条件反射， 当动物有耳鸣时把它也作为部分安全的信号，在行为中表现出来。用注射水杨酸钠的方法造 成动物耳鸣，通过不同组别大鼠行为实验的结果判断动物耳鸣的存在与否及药物的作用。结果：大鼠注射水杨酸钠后有耳呜产生，抗癫痫药Lamotrigine不能有效地缓解耳 鸣，补肾中药复方改善了水杨酸钠造成的耳呜。结论：本耳鸣行为模型能证 实水杨酸钠造成的动物耳鸣的存在，可用于筛选药物是否具有改善耳鸣的作用，但无法提供 药物致/治鸣机制的依据。
, 百拇医药
中图分类号： R764.45文献标识码:A文章编号:1000-683 4(2000)03-0275-04
THE ESTABLISHMENT OF AN ANIMAL MODEL FOR TINNITUS AND THE EFFECTS OF THE DRUGS ON THE TINNITUS OF ANIMAL
SHI Jian-rong,HU Shou-ming
(Department of Physiology, Shanghai University of Traditional Chine se Medicine, Shanghai 200032)
ABSTRACT
Aim: To establish an animal model for tinnitus and to screen drugs for t heir abilities to attenuate tinnitus. Methods: The behavioral pa radigm of an animal model of tinnitus is based on creating and experimental situ ation in which the presence of an auditory signal is associated with safety, whi le its absence, silence, is associated with danger. The tinnitus was induced by sodium salicylate injection. Results: The data of the experimen ts reported in this article suggests the presence of phantom auditory sensation in animals, produced by salicylate. The results also indicated that Lamotrigine was not effective on tinnitus, while the Traditional Chinese Medicine Compound m ade a statistically significant decrease of the behavioral manifestation of tinn itus.Conclusion: This model assesses the perception of a sound ( tinnitus) disregarding its origin and allows for testing of drugs that attenuate tinnitus.
, 百拇医药
KEY WORDS: tinnitus; salicylate; animal model; antiepil eptic drug; kidney tonic drugs
耳鸣是一临床常见症状，其发生机理不详，依然无法客观检测，缺乏有效治疗方法 [1]。对耳鸣的药物治疗包括局部麻醉药、抗癫痫药、神经营养药等，有效率不高。中 医理论认为肾气衰则耳鸣耳聋，对肾虚耳鸣者用扶正益肾的方法治疗后耳鸣的症状有改善， 但还没有找到临床中药治疗耳鸣的规律，更少开展有关的机理研究。限制对耳鸣深入研究的 原因之一是缺少耳鸣动物模型。近年来，国外学者用行为实验(behavioral procedure)的方 法建立了大鼠水杨酸耳鸣模型[2,3]，本实验通过此模型来观察抗癫痫药及补肾中 药对耳鸣的作用。
1 材料与方法
1.1 耳鸣动物模型的建立[2,3]
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1.1.1 总体设计 耳鸣是一主观感觉，而动物无法直接说出其感受。因此 ，需通过观测与外界刺激有关的一般行为表现来推测动物的主观体验，即进行行为实验。根 据感觉动物模型的建立原则以及心理声学的概念，本模型的设计思路为：让动物形成耳内有 声音存在是安全的，而耳内无声音感往往伴随着危险因素这样一个条件反射，当有耳鸣时， 动物把它也作为安全的信号，在行为中表现出来。
通过下列过程建立:中断大鼠的自由饮水,将动物始终置于有柔和背景噪声 (55 dB SP L)的环境里,在特殊隔音室中训练从特殊的水管中舔水,每一次舔水都会被系统记录。训练过 程中每当有背景声音中断(本底噪声<20 dB SPL)即给动物足部电刺激,二者多次结合直至动 物在无背景声音时饮水动作明显减少甚至停止,然后不给电刺激强化,动物对安静的恐惧逐渐 减退,即进入条件反射消退期。在消退期每日给动物注射水杨酸钠(主要成分salicylate ac id,简称SA),则在背景声音中断时大鼠将水杨酸钠所致的耳鸣声作为部分安全信号,其消退 过程快于注射生理盐水对照组。
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造模过程持续15 d(图1)。实验中动物缺水后的饮水现象为非条件反射；动物饮水时给 予足底电刺激会引起饮水动作的抑制，将无背景声音(安静)与电刺激多次结合后成为抑制饮 水反应的条件刺激，这样就形成“安静”时动物中断饮水动作的抑制性条件反射。
以条件刺激时的饮水的抑制率(Rb)为观察指标，其计算公式为： Rb＝B/(A+B)
B:在持续1 min的条件刺激期间的总饮水次数； A:在条件刺激前1 min内的饮水总数。
以每次过程中Rb的平均值为某动物某天的行为观察指标，观察Rb随时间的动态变化过程 。在适应无背景声音期间，每一动物的平均Rb均在0.4～0.6，为正常状况；2 d的条件反射 建立训练后Rb应<0.2；消退测试期间Rb逐渐恢复至0.5左右。动物耳鸣存在于否将在消退 测试中表现出来，耳鸣声尽管可能和环境声音不完全一致，但比之于绝对安静的环境，差异 还是很明显的，因此有耳鸣的动物不能注意到环境声音的变化，在条件刺激时饮水动作的抑 制作用小于无耳鸣的动物，即Rb的恢复快。
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1.1.2 动物分组 30只成年雄性杂色大鼠(Strain:Long Evans pigmente d;Source:Charles River，下同)，体重280～330 g，随机分成三组(n=10)：(1)对照 组造模过程如前述，从抑制训练之日起，每日注射生理盐水5 ml/kg至实验结束；(2)SA1组 在造模过程中，动物在适应无背景声音环境之后、抑制训练之前，注射水杨酸钠320 mg/kg (Sigma化学公司)，以后每日注射一次，持续至实验结束，均在实验前2 h注射；(3) SA2组 SA的注射始于2 d抑制训练后，消退测试前。其余均同SA1组。
Fig.1 Time table of the experiments
1:Experiments when salicylate or saline was introduced before the su ppression training (e.g. SA1 or LTG1 or TCM1)
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2:Salicylate or saline was introduced after suppression training (e.g.SA2 or LTG2 or TCM2)
Days: Days from the beginning of the procedures
1.2 药物对耳鸣模型动物的影响
抗癫痫药Lamotrigine (LTG)，5 mg/(kg.d)。将12只大鼠分为2组(n＝6) ：LTG1组和 LTG2组。同前造模方法，分别在抑制训练前、后注射SA；LTG的使用从实验开始 前3 d起持续至实验结束，每日一次，均于实验前2 h皮下注射。LTG由The Wellcome Fundat ion Ltd，London生产，Lot：A42037。
中药(Traditional Chinese Medicine，TCM)复方由狗脊、仙鹤草、磁石、路路通等组 成，按成人公斤体重的20倍折算，水煎、浓缩成混悬液，使其用量为每日3 ml。18只大鼠分 三组(n＝6)：对照组、TCM 1、TCM 2。造模方法同前，分别在抑制训练前、后注射SA； 从实验开始前3日起，三组大鼠分别每日喂以3 ml水或中药，在每日行为实验结束后不固定 的几小时内进行，持续至消退测试结束。
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2 实验结果
2.1 水杨酸耳鸣大鼠模型的确立
如图2,比较对照组、SA1和SA2组动物消退测试期间的饮水抑制率，对照组动物需4 d的时 间逐渐恢复到抑制训练前的水平(Rb接近0.5)：在SA2组动物，由于SA造成大鼠耳鸣Rb的恢复 很快，消退试验的第2 d即达0.5左右；而在SA1组大鼠在抑制训练前给予SA,则动物将耳鸣与 电刺激相联系，条件刺激时饮水抑制这一条件反射消退较慢，Rb恢复至0.5约在消退试验的 第7 d。故本实验中1和2组的设立，排除了实验的假阳性可能，使实验设计更显合理。
Fig.2 Mean values of Suppression ratios (Rb) during the second suppression training day (S2) and the 7 days exti nction testing (E1-E7)
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● contrl group;■ The group starting salicylate injections before suppressi on training (SA1); ▲The group starting salicylate injections after suppression training (SA2);Bars indicate standard error of mean
为了用单一的指标来反映SA1和SA2组动物行为实验的差异性，我们计算并比较了两组曲线 之间平均面积差[4]，均以对照组的曲线为参照：在消退试验期，代表SA2组和对照 组的二条曲线之间所包围的面积为0.1562±0.0532，(由于Rb为一相对值，故以此为基础求 得的面积无单位)，而代表SA1组和对照组二条曲线所包围的面积为0.0478±0.0434，差 异有 显著性(P<0.05)。这是由于在行为实验过程中注射SA时间的不同，动物对耳鸣的反应 不同，耳鸣的消退时间也不同，说明大鼠注射SA后确实产生了耳鸣。
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2.2 用水杨酸耳鸣模型来观察LTG及中药对动物耳鸣的作用
如图3所示，用同样的面积计算方法并进行统计，P<0.05(0.1400±0.0768 vs 0.024±0.0557)，说明注射SA的动物同时使用LTG(5 mg/(kg.d))后，动物仍有耳 鸣存在，这一剂量的 LTG没能有效地缓解耳鸣。在实验中曾试用了 15 mg/(kg.d) ，实验中动物有行为异常，表现为抽搐、叫、打滚、口腔出血等，12只动物中的4只动物在 实验中死亡，所得Rb结果呈非特异性改变。
Fig.3 Mean values of Suppressio n ratios (Rb) during the second suppression training day (S2) and the 7 days ext inction testing (E1-E7)
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■The group starting daily salicylate injections bef ore suppression training (S A1);▲ The group starting daily salicylate injection s after suppression training (SA2);□ LTG treated, daily salicylate injections starting before suppression training(LTG1);△LTG treated, daily salicylate injections starting after suppression training ( LTG2). Bars indicate standard error of mean
Fig.4 Mean values of Suppressio n ratios (Rb) during the second suppression training day (S2) and the 7 days ex tinction testing (E1-E7)
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■The group starting daily salicylate injections before sup pression training (SA1);▲The group starting daily salicylate injections aft er suppression training (SA2);□TCM treated, daily salicylate injections starting before suppression training (TCM2);△TCM treated, daily salicylate injections starting after suppression training (TCM2).●3 ml water for control. Bars indicate standard err or of mean
图4所示中药1和2组的曲线走势基本一致，动物的Rb逐渐恢复，在消退试验的第3 d达抑 制前水平，经统计，P>0.05(0.1215±0.0964 vs 0.05972±0.0779)，即注 射SA 的同时服用中药的二组动物行为实验无明显差异，据此推测该二组动物无耳鸣，即中药改善 了SA造成的耳鸣。为了排除每日3 ml液体对实验的影响，特设了一组每日喂饮用水的对照组 ，实验结果显示出完全不同的结果，动物Rb的恢复慢于不饮水的对照组，排除了中药的实验 结果是由于喂3 ml液体造成的实验误差的可能性。
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3 讨论
SA是耳鸣研究中常用的工具药，临床上SA可引起听阈的提高、频率选择性的下降，并且 在大剂量时引起耳鸣。已有大量动物行为实验证实给大鼠注射 SA 320 mg/kg时，动物产生 耳鸣。水杨酸对听觉系统的作用机制尚不十分清楚，有大量的文献报道，认为SA的作用主要 是对耳蜗功能的损害[2,3]。
本实验设计的耳鸣行为模型达到了证实动物是否有耳鸣存在的目的，实验设计并没有考 虑耳鸣的起因，即无论动物是由于噪声致鸣或注射 SA、奎宁致鸣均会得到相同的结果。因 此，本模型的特点是对声音感觉的心理声学参数变化较灵敏，而对致鸣的机制不敏感。如果 某一药物改善耳鸣的作用机制与SA致鸣的机制不同，仍可在此模型上证实[4]。此 动物模型的设计较慎密、合理，充分考虑了听觉方面的影响因素，得到广泛的认可，可用于 筛选药物是否具有改善耳鸣的作用。但实验时需专门的设备和软件、实验周期较长(至少持 续2周)，限制了此模型的广泛应用；且需造成动物缺水，若对动物缺水程度控制不好，会因 动物的一般情况不很好而影响实验结果。因此，仍有改进余地。
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用上述模型对LTG进行行为实验，结果显示大鼠注射小剂量LTG后仍有耳鸣存在，而大 剂量则有明显的副作用，未显示出对耳鸣的改善作用。有报道，痫样(epileptic-like)放 电是与耳鸣有关的神经活动的表现之一[5]，抗癫痫药物有部分缓解耳鸣的作用。L TG是近年来证实具有抗癫痫作用的新药，可减少持续高频重复放电[6]。设想通过 此途径能抑制与耳鸣有关的神经元兴奋性增加，但本实验结果表明其对耳鸣的改善作用不明 显，且大剂量时有明显毒副作用。
本实验所用的补肾中药复方能改善SA所致的耳鸣，但实验结果并不能提示是通过什么途 径达到此效果的。中医认为耳鸣之因系阴阳失衡，致内风或邪风扰乱体内环境而产生；耳鸣 之治，补肾为治虚鸣之首。实验中所用的中药复方取自于临床实践中对部分肾虚耳鸣者治疗 有效、无副作用的方剂，其治则为补肾开窍、活血通络、重镇息风。从现代药理学的观点来 看，组方中的药物分别具有促进肾上腺皮质分泌功能进而调节机体代谢的作用、降低中枢神 经的兴奋性、调节大脑皮层的功能、改善微循环、促进细胞代谢等作用[7]。有报 道，注射SA后下丘某些核团的自发放电率增加(认为此与耳鸣有关)与下丘γ-氨基丁酸水平 的降低有关[5]，而补肾中药能增加老年大鼠下降的γ-氨基丁酸水平[9] 等，推测此补肾中药复方可能是通过对中枢的调节而实现对耳鸣改善作用的，尚待进一步深 入研究。
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本实验工作在美国马里兰大学的耳鸣研究中心的实验室完成，并得到Jastrebof f教授的指导和应允，在此表示感谢!
基金项目:上海市科技启明星计划资助项目(96QB14014)
作者简介:施建蓉(1964-)，女，江苏，副研究员，硕士,从事中西医结合 基础研究工作。
参考文献
[1] 施建蓉，胡寿铭.耳鸣研究进展[J].中华耳鼻咽喉科杂志，1999，2： 124-126.
[2] Jastreboff P J, Brennan J F, Coleman J K, et al. Phantom Auditory Se nsation in Rats: An Animal Model for Tinnitus[J]. Behavioral Neurosicence, 1988,102(6):811-822.
, http://www.100md.com
[3] Jastreboff P J, Sasaki C T. An animal model for tinnitus: a decade of dev elopment[J]. Am J Otol, 1994,15:19-27.
[4] Jastreboff P J, Zhou S T, Jastreboff M M, et al. Attenuation of Salic ylate-Induced Tinnitus by Ginkgo Biloba Extract in Rats[J]. Audiol Neruooto l ,1997,2:197-212.
[5] Chen G D, Jastreboff P J. Salicylate-induced abnormal activity in the in ferior colliculus of rats[J]. Hear Res, 1995,82:158-178.
[6] Messenheimer J A. Lamotrigine[J]. CNS Drug Reviews,1995:1(2)190-203 .
[7] 张 青，郑荣华.主观性耳鸣的中医治疗—附100例疗效对比分析[J].上海中 医药杂志，1992;12：18.
[8] 莫启忠,宫 斌，陈坤华，等.调理心肾中药对拟痴呆大鼠脑组织中M和GABA受体功能 的影响[J].核技术，1993，5：295-297.
收稿日期:1999-09-10;修回日期:2000-03-22, 百拇医药
单位：施建蓉(上海中医药大学生理教研室，上海 200032)；胡寿铭(美国马里兰大学医 学院耳鸣研究中心)
关键词：耳鸣；动物模型；水杨酸钠；抗癫痫药；补肾中药
中国应用生理学杂志000322摘要 目的：建立耳鸣动物模型并测试药物对动物耳鸣的影响。方法：让动 物形成耳内有声音存在是安全的、而耳内无声音感往往伴随着危险因素这样一个条件反射， 当动物有耳鸣时把它也作为部分安全的信号，在行为中表现出来。用注射水杨酸钠的方法造 成动物耳鸣，通过不同组别大鼠行为实验的结果判断动物耳鸣的存在与否及药物的作用。结果：大鼠注射水杨酸钠后有耳呜产生，抗癫痫药Lamotrigine不能有效地缓解耳 鸣，补肾中药复方改善了水杨酸钠造成的耳呜。结论：本耳鸣行为模型能证 实水杨酸钠造成的动物耳鸣的存在，可用于筛选药物是否具有改善耳鸣的作用，但无法提供 药物致/治鸣机制的依据。
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中图分类号： R764.45文献标识码:A文章编号:1000-683 4(2000)03-0275-04
THE ESTABLISHMENT OF AN ANIMAL MODEL FOR TINNITUS AND THE EFFECTS OF THE DRUGS ON THE TINNITUS OF ANIMAL
SHI Jian-rong,HU Shou-ming
(Department of Physiology, Shanghai University of Traditional Chine se Medicine, Shanghai 200032)
ABSTRACT
Aim: To establish an animal model for tinnitus and to screen drugs for t heir abilities to attenuate tinnitus. Methods: The behavioral pa radigm of an animal model of tinnitus is based on creating and experimental situ ation in which the presence of an auditory signal is associated with safety, whi le its absence, silence, is associated with danger. The tinnitus was induced by sodium salicylate injection. Results: The data of the experimen ts reported in this article suggests the presence of phantom auditory sensation in animals, produced by salicylate. The results also indicated that Lamotrigine was not effective on tinnitus, while the Traditional Chinese Medicine Compound m ade a statistically significant decrease of the behavioral manifestation of tinn itus.Conclusion: This model assesses the perception of a sound ( tinnitus) disregarding its origin and allows for testing of drugs that attenuate tinnitus.
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KEY WORDS: tinnitus; salicylate; animal model; antiepil eptic drug; kidney tonic drugs
耳鸣是一临床常见症状，其发生机理不详，依然无法客观检测，缺乏有效治疗方法 [1]。对耳鸣的药物治疗包括局部麻醉药、抗癫痫药、神经营养药等，有效率不高。中 医理论认为肾气衰则耳鸣耳聋，对肾虚耳鸣者用扶正益肾的方法治疗后耳鸣的症状有改善， 但还没有找到临床中药治疗耳鸣的规律，更少开展有关的机理研究。限制对耳鸣深入研究的 原因之一是缺少耳鸣动物模型。近年来，国外学者用行为实验(behavioral procedure)的方 法建立了大鼠水杨酸耳鸣模型[2,3]，本实验通过此模型来观察抗癫痫药及补肾中 药对耳鸣的作用。
1 材料与方法
1.1 耳鸣动物模型的建立[2,3]
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1.1.1 总体设计 耳鸣是一主观感觉，而动物无法直接说出其感受。因此 ，需通过观测与外界刺激有关的一般行为表现来推测动物的主观体验，即进行行为实验。根 据感觉动物模型的建立原则以及心理声学的概念，本模型的设计思路为：让动物形成耳内有 声音存在是安全的，而耳内无声音感往往伴随着危险因素这样一个条件反射，当有耳鸣时， 动物把它也作为安全的信号，在行为中表现出来。
通过下列过程建立:中断大鼠的自由饮水,将动物始终置于有柔和背景噪声 (55 dB SP L)的环境里,在特殊隔音室中训练从特殊的水管中舔水,每一次舔水都会被系统记录。训练过 程中每当有背景声音中断(本底噪声<20 dB SPL)即给动物足部电刺激,二者多次结合直至动 物在无背景声音时饮水动作明显减少甚至停止,然后不给电刺激强化,动物对安静的恐惧逐渐 减退,即进入条件反射消退期。在消退期每日给动物注射水杨酸钠(主要成分salicylate ac id,简称SA),则在背景声音中断时大鼠将水杨酸钠所致的耳鸣声作为部分安全信号,其消退 过程快于注射生理盐水对照组。
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造模过程持续15 d(图1)。实验中动物缺水后的饮水现象为非条件反射；动物饮水时给 予足底电刺激会引起饮水动作的抑制，将无背景声音(安静)与电刺激多次结合后成为抑制饮 水反应的条件刺激，这样就形成“安静”时动物中断饮水动作的抑制性条件反射。
以条件刺激时的饮水的抑制率(Rb)为观察指标，其计算公式为： Rb＝B/(A+B)
B:在持续1 min的条件刺激期间的总饮水次数； A:在条件刺激前1 min内的饮水总数。
以每次过程中Rb的平均值为某动物某天的行为观察指标，观察Rb随时间的动态变化过程 。在适应无背景声音期间，每一动物的平均Rb均在0.4～0.6，为正常状况；2 d的条件反射 建立训练后Rb应<0.2；消退测试期间Rb逐渐恢复至0.5左右。动物耳鸣存在于否将在消退 测试中表现出来，耳鸣声尽管可能和环境声音不完全一致，但比之于绝对安静的环境，差异 还是很明显的，因此有耳鸣的动物不能注意到环境声音的变化，在条件刺激时饮水动作的抑 制作用小于无耳鸣的动物，即Rb的恢复快。
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1.1.2 动物分组 30只成年雄性杂色大鼠(Strain:Long Evans pigmente d;Source:Charles River，下同)，体重280～330 g，随机分成三组(n=10)：(1)对照 组造模过程如前述，从抑制训练之日起，每日注射生理盐水5 ml/kg至实验结束；(2)SA1组 在造模过程中，动物在适应无背景声音环境之后、抑制训练之前，注射水杨酸钠320 mg/kg (Sigma化学公司)，以后每日注射一次，持续至实验结束，均在实验前2 h注射；(3) SA2组 SA的注射始于2 d抑制训练后，消退测试前。其余均同SA1组。
Fig.1 Time table of the experiments1:Experiments when salicylate or saline was introduced before the su ppression training (e.g. SA1 or LTG1 or TCM1)
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2:Salicylate or saline was introduced after suppression training (e.g.SA2 or LTG2 or TCM2)
Days: Days from the beginning of the procedures
1.2 药物对耳鸣模型动物的影响
抗癫痫药Lamotrigine (LTG)，5 mg/(kg.d)。将12只大鼠分为2组(n＝6) ：LTG1组和 LTG2组。同前造模方法，分别在抑制训练前、后注射SA；LTG的使用从实验开始 前3 d起持续至实验结束，每日一次，均于实验前2 h皮下注射。LTG由The Wellcome Fundat ion Ltd，London生产，Lot：A42037。
中药(Traditional Chinese Medicine，TCM)复方由狗脊、仙鹤草、磁石、路路通等组 成，按成人公斤体重的20倍折算，水煎、浓缩成混悬液，使其用量为每日3 ml。18只大鼠分 三组(n＝6)：对照组、TCM 1、TCM 2。造模方法同前，分别在抑制训练前、后注射SA； 从实验开始前3日起，三组大鼠分别每日喂以3 ml水或中药，在每日行为实验结束后不固定 的几小时内进行，持续至消退测试结束。
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2 实验结果
2.1 水杨酸耳鸣大鼠模型的确立
如图2,比较对照组、SA1和SA2组动物消退测试期间的饮水抑制率，对照组动物需4 d的时 间逐渐恢复到抑制训练前的水平(Rb接近0.5)：在SA2组动物，由于SA造成大鼠耳鸣Rb的恢复 很快，消退试验的第2 d即达0.5左右；而在SA1组大鼠在抑制训练前给予SA,则动物将耳鸣与 电刺激相联系，条件刺激时饮水抑制这一条件反射消退较慢，Rb恢复至0.5约在消退试验的 第7 d。故本实验中1和2组的设立，排除了实验的假阳性可能，使实验设计更显合理。
Fig.2 Mean values of Suppression ratios (Rb) during the second suppression training day (S2) and the 7 days exti nction testing (E1-E7), http://www.100md.com
● contrl group;■ The group starting salicylate injections before suppressi on training (SA1); ▲The group starting salicylate injections after suppression training (SA2);Bars indicate standard error of mean
为了用单一的指标来反映SA1和SA2组动物行为实验的差异性，我们计算并比较了两组曲线 之间平均面积差[4]，均以对照组的曲线为参照：在消退试验期，代表SA2组和对照 组的二条曲线之间所包围的面积为0.1562±0.0532，(由于Rb为一相对值，故以此为基础求 得的面积无单位)，而代表SA1组和对照组二条曲线所包围的面积为0.0478±0.0434，差 异有 显著性(P<0.05)。这是由于在行为实验过程中注射SA时间的不同，动物对耳鸣的反应 不同，耳鸣的消退时间也不同，说明大鼠注射SA后确实产生了耳鸣。
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2.2 用水杨酸耳鸣模型来观察LTG及中药对动物耳鸣的作用
如图3所示，用同样的面积计算方法并进行统计，P<0.05(0.1400±0.0768 vs 0.024±0.0557)，说明注射SA的动物同时使用LTG(5 mg/(kg.d))后，动物仍有耳 鸣存在，这一剂量的 LTG没能有效地缓解耳鸣。在实验中曾试用了 15 mg/(kg.d) ，实验中动物有行为异常，表现为抽搐、叫、打滚、口腔出血等，12只动物中的4只动物在 实验中死亡，所得Rb结果呈非特异性改变。
Fig.3 Mean values of Suppressio n ratios (Rb) during the second suppression training day (S2) and the 7 days ext inction testing (E1-E7), 百拇医药
■The group starting daily salicylate injections bef ore suppression training (S A1);▲ The group starting daily salicylate injection s after suppression training (SA2);□ LTG treated, daily salicylate injections starting before suppression training(LTG1);△LTG treated, daily salicylate injections starting after suppression training ( LTG2). Bars indicate standard error of mean
Fig.4 Mean values of Suppressio n ratios (Rb) during the second suppression training day (S2) and the 7 days ex tinction testing (E1-E7), http://www.100md.com
■The group starting daily salicylate injections before sup pression training (SA1);▲The group starting daily salicylate injections aft er suppression training (SA2);□TCM treated, daily salicylate injections starting before suppression training (TCM2);△TCM treated, daily salicylate injections starting after suppression training (TCM2).●3 ml water for control. Bars indicate standard err or of mean
图4所示中药1和2组的曲线走势基本一致，动物的Rb逐渐恢复，在消退试验的第3 d达抑 制前水平，经统计，P>0.05(0.1215±0.0964 vs 0.05972±0.0779)，即注 射SA 的同时服用中药的二组动物行为实验无明显差异，据此推测该二组动物无耳鸣，即中药改善 了SA造成的耳鸣。为了排除每日3 ml液体对实验的影响，特设了一组每日喂饮用水的对照组 ，实验结果显示出完全不同的结果，动物Rb的恢复慢于不饮水的对照组，排除了中药的实验 结果是由于喂3 ml液体造成的实验误差的可能性。
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3 讨论
SA是耳鸣研究中常用的工具药，临床上SA可引起听阈的提高、频率选择性的下降，并且 在大剂量时引起耳鸣。已有大量动物行为实验证实给大鼠注射 SA 320 mg/kg时，动物产生 耳鸣。水杨酸对听觉系统的作用机制尚不十分清楚，有大量的文献报道，认为SA的作用主要 是对耳蜗功能的损害[2,3]。
本实验设计的耳鸣行为模型达到了证实动物是否有耳鸣存在的目的，实验设计并没有考 虑耳鸣的起因，即无论动物是由于噪声致鸣或注射 SA、奎宁致鸣均会得到相同的结果。因 此，本模型的特点是对声音感觉的心理声学参数变化较灵敏，而对致鸣的机制不敏感。如果 某一药物改善耳鸣的作用机制与SA致鸣的机制不同，仍可在此模型上证实[4]。此 动物模型的设计较慎密、合理，充分考虑了听觉方面的影响因素，得到广泛的认可，可用于 筛选药物是否具有改善耳鸣的作用。但实验时需专门的设备和软件、实验周期较长(至少持 续2周)，限制了此模型的广泛应用；且需造成动物缺水，若对动物缺水程度控制不好，会因 动物的一般情况不很好而影响实验结果。因此，仍有改进余地。
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用上述模型对LTG进行行为实验，结果显示大鼠注射小剂量LTG后仍有耳鸣存在，而大 剂量则有明显的副作用，未显示出对耳鸣的改善作用。有报道，痫样(epileptic-like)放 电是与耳鸣有关的神经活动的表现之一[5]，抗癫痫药物有部分缓解耳鸣的作用。L TG是近年来证实具有抗癫痫作用的新药，可减少持续高频重复放电[6]。设想通过 此途径能抑制与耳鸣有关的神经元兴奋性增加，但本实验结果表明其对耳鸣的改善作用不明 显，且大剂量时有明显毒副作用。
本实验所用的补肾中药复方能改善SA所致的耳鸣，但实验结果并不能提示是通过什么途 径达到此效果的。中医认为耳鸣之因系阴阳失衡，致内风或邪风扰乱体内环境而产生；耳鸣 之治，补肾为治虚鸣之首。实验中所用的中药复方取自于临床实践中对部分肾虚耳鸣者治疗 有效、无副作用的方剂，其治则为补肾开窍、活血通络、重镇息风。从现代药理学的观点来 看，组方中的药物分别具有促进肾上腺皮质分泌功能进而调节机体代谢的作用、降低中枢神 经的兴奋性、调节大脑皮层的功能、改善微循环、促进细胞代谢等作用[7]。有报 道，注射SA后下丘某些核团的自发放电率增加(认为此与耳鸣有关)与下丘γ-氨基丁酸水平 的降低有关[5]，而补肾中药能增加老年大鼠下降的γ-氨基丁酸水平[9] 等，推测此补肾中药复方可能是通过对中枢的调节而实现对耳鸣改善作用的，尚待进一步深 入研究。
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本实验工作在美国马里兰大学的耳鸣研究中心的实验室完成，并得到Jastrebof f教授的指导和应允，在此表示感谢!
基金项目:上海市科技启明星计划资助项目(96QB14014)
作者简介:施建蓉(1964-)，女，江苏，副研究员，硕士,从事中西医结合 基础研究工作。
参考文献
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收稿日期:1999-09-10;修回日期:2000-03-22, 百拇医药