一种简单迅速筛选肿瘤基因组中基因突变的方法
作者：于景翠 钟淑琦 傅松滨
单位：哈尔滨医科大学 基础医学院，黑龙江 哈尔滨 10086
关键词：PCR-SSCP；银染；nm23基因；基因突变
中国地方病学杂志000325 [摘要] 目的 建立一种新的非同位素SSCP分析方法。方法 常规提取人类基因组DNA作为模板，PCR扩增nm23-H1基因，变性PCR产物，6%非变性聚丙烯酰胺凝胶SSCP电泳，银染后分析结果。结果 改进了目前PCR-SSCP分析中应用同位素标记的检测方法，采用银染方法，建立起简单迅速的非同位素PCR-SSCP分析方法和适宜条件。并将这种方法成功地应用于肿瘤转移抑制基因点突变的检测。结论 非同位素聚合酶链反应-单链构象多态(Nonisotopic PCR-SSCP)分析是一种迅速、敏感地检测基因顺序中突变的单链DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳技术。
, http://www.100md.com [中图分类号] R73-3 [文献标识码] A
[文章编号]1000-4955(2000)03-0221-03
Analysis of non-isotopic PCR-SSCP A simple and rapid method for detection of gene mutation in the genomic DNA of human tumors
YU Jing-cui,ZHONG Shu-qi,FU Song-bin
(Harbin Medical University,Harbin 150086,China)
[Abstract] Objective Establish a simple and rapid method for nonisotopic PCR-SSCP.Methods Human genomic DNA was extracted from the samples of human gastric cancers and the controls.And nm23-H1 gene was amplified by polymerase chain reaction.Analysis of single stranded conformation polymorphism was performed on 6% homogenous polyacrylamide gel.Results We have improved and established a method for non-isotopic PCR-SSCP to detect gene mutations.Conclusions Non-isotopic PCR-SSCP is a simple and rapid method to detect gene mutations in human tumors.
, 百拇医药
[Key words] PCR-SSCP;Nm23-H1 gene;Gene mutation
聚合酶链式反应—单链构象多态(polymerase chain reaction-single-stranded conformation polymorphism,PCR-SSCP)分析是一项单链DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，它根据不同构象的等长DNA单链在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳迁移率的变化来检测基因突变。这种技术具有简便、快速、敏感(可检出单个碱基突变)和适于大样本初筛等特点。自1989年建立以后，世界各实验室竞相开展，已被广泛应用于突变的鉴定和分析、基因定位等领域[1,2]。最初应用的PCR-SSCP分析都是通过同位素标记的方法进行检测，虽然敏感性很高，但由于对环境有放射性污染以及同位素半衰期限制实验的开展等缺点，使之不能成为常规研究检测手段。我们采用银染方法建立了一种较稳定的非同位素PCR-SSCP分析方法，并应用于肿瘤分子遗传学研究中基因突变的大样本初筛，为进一步基因测序工作打下基础。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 DNA提取 取新鲜肿瘤和正常对照组织标本，用蛋白酶K-苯酚-氯仿法常规提取基因组DNA。
1.2 PCR扩增 以胃癌及对应正常胃组织基因组DNA为模板，以含nm23-H1基因质粒作对照，PCR扩增基因组DNA中nm23-H1基因。
1.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶SSCP电泳[2]
1.3.1 制备6%聚丙烯酰胺凝胶：胶联比为丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=49:1,0.5×TBE为电泳缓冲液。
1.3.2 样品变性：5～10μl PCR反应产物中加入25μl加样缓冲液，混匀后98℃加热变性10min，冷却后上样。
1.3.3 电泳：循环水恒温15℃，恒压20V/cm条件下电泳3h,然后在40V/cm下电泳2h，结束电泳。
, 百拇医药
1.4 银染分析
1.4.1 固定：凝胶用固定液固定10～20min后，回收固定液，用双蒸水漂洗凝胶3次，每次2～3min。
1.4.2 染色：将凝胶浸泡在银染液中振荡，染色8～10min,回收染色液，用双蒸水漂洗凝胶3次，每次2～3min。
1.4.3 显影：将凝胶置于显影液中，轻轻晃动，待显出浅棕色条带时，立即终止反应。
1.4.4 分析：应用凝胶自动成像系统进行分析。
1.5 SSCP方法学与电泳条件的研究 常规应用EB染色法[3]、银染法[4]和同位素法检测nm23-H1基因单链构象多态，同时结合不同浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶、甘油含量、不同温度、不同电压条件进行研究，同时对上述3种方法进行对比研究。
, 百拇医药
2 结果与分析
以含正常nm23-H1基因的质粒为模板DNA，应用上述PCR反应条件可以扩增出高特异性的nm23-H1基因片段。同时，成功地改进了目前PCR-SSCP分析中应用同位素标记的检测方法，采用银染方法，建立起简单迅速的非同位素PCR-SSCP分析方法和适宜条件。图1和图2为EB染色[4]和银染两种方法检测的PCR-SSCP电泳结果。图中可以观察到两条特异的单链电泳区带和一条残存的双链区带。
图1 EB染色法检测的PCR-SSCP的电泳结果
图2 银染法检测的PCR-SSCP电泳结果
(SS代表单链DNA，DS代表双链DNA)
, 百拇医药
2.1 非同位素PCR-SSCP检测结果分析 根据孙开来等的报道[3]，残存双链带和特异单链电泳区带的相对位置不能预先确定，不同电泳条件和不同片段表现不同。我们在实验中检测到的结果都是残存双链DAN区带于前，单链区带在后。这是由于在非变性聚丙烯酰胺凝胶中，DNA双链的电泳迁移率决定于片段长短，而单链DAN片段的电泳迁移率不仅决定于其片段长短，更主要决定于其构象。不同电泳条件下和不同片段的构象个异,电泳迁移率就不同。发生单碱基突变的DNA片段由于构象改变导致电泳迁移率的变化而被检出。
2.2 影响电泳迁移率的条件 DNA单链的构象形成与稳定依赖于外部环境。迄今还无人报道一种适用于各种条件下的标准PCR-SSCP电泳条件。主要从以下几个方面着手探索适于目标DNA单链分离的条件。
2.2.1 凝胶浓度：先后试验了3%、4%、6%和8% 4种浓度的聚丙酰胺凝胶，发现较高浓度凝胶有利于nm23-H1单链DNA分离。但由于根据《分子克隆》记载，大于8%的聚丙烯酰胺凝胶有效分离范围小于400bp，为此我们选择了6%的凝胶浓度。最近有文献报道，高浓度的聚丙烯酰胺凝胶(12%)进行SSCP电泳检测425bp的CFTR基因亦获良好效果。
, http://www.100md.com
2.2.2 甘油含量：添加甘油有利于DNA单链在凝胶中的分离。Orita在1989年报道[5]10%甘油添入凝胶可提高突变顺序的分离，但机理不清。同时，在实验中还发现添加甘油的浓度若增大反而不利于单链DNA分离。甘油在低浓度时，可以部分打开单链折叠空间结构，使更多分子暴露表面，加强丙烯酰胺凝胶纤维与DNA局部构象变化的作用；而甘油浓度过高，因减弱甚至消除单链DNA的空间结构，反而降低分离效果，所以我们将Orita报告的甘油浓度减半使用，效果良好。
2.2.3 温度：恒温是SSCP电泳分析成功的关键，恒定的电泳温度有利于维持单链构象的稳定。本实验结果显示电泳在室温和4℃下进行，对电泳迁移率及单链分离影响不大。厚胶不利于散热恒温，采用0.5mm的凝胶不仅有利于恒定胶温，而且还可以缩短染色时间。
2.3 非同位素PCR-SSCP分析的灵敏性和可靠性 通过SSCP电泳加入具有放射性的PCR产物样品，浓度梯度加样，依次将电泳后凝胶进行EB染色、银染和放射自显影检测，结果见表1。
, http://www.100md.com
表1 PCR-SSCP分析方法的比较(浓度梯度加样*) 检测方法
1μl
2μl
4μl
6μl
8μl
12μl
16μl
EB染色
银染
放射自显影
+
, 百拇医药
+
+
+
+
+
+
+**
+
+
+
+
+
+
+
, http://www.100md.com
+
注：*样品为未经稀释PCR反应产物；**可检出2条单链电泳区带为+
从表1中可以看出银染比较灵敏，与放射自显影的灵敏度差距较小，是一种较有实用潜力的非同位素检测手段。关于非同位素PCR-SSCP分析的可靠性研究，我们也是通过对1块凝胶依次使用3种方法检测，然后比较检测结果，结果表明三种方法显示单链位置完全一致。这说明非同位素SSCP检测手段的可靠性与同位素标记的检测手段一样值得信赖。
[基金来源]黑龙江省科学技术计划项目青年基金
[作者简介]于景翠(1960-),女，硕士
[参考文献]
[1] 徐 询，刘震乾.DNA重组技术[M].北京：科技出版社，1990，50.
, 百拇医药
[2] Hayashi K.PCR-SSCP:a simple and sensitive method for detection of mutation in the genomic DNA[J].PCR methods and Appl,1991,1:34.
[3] 孙开来.应用PCR-SSCP法检测第Ⅶ因子内单个碱基置换[J].中华医学遗传学杂志，1993，10(1)：7.
[4] Yap EPH and Mcgee JOD.Nonisotopic SSCP detection on PCR product by ethidium bromide staining[J].Trends in Genet,1992,8:49.
[5] Orita M,Suzuki Y,Sekiya T et al.Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphisms Using the polymerase chain reaction[J].Genomics,1989,5:874.
[收稿日期]1999-09-24
[修订日期]1999-10-06, 百拇医药
单位：哈尔滨医科大学 基础医学院，黑龙江 哈尔滨 10086
关键词：PCR-SSCP；银染；nm23基因；基因突变
中国地方病学杂志000325 [摘要] 目的 建立一种新的非同位素SSCP分析方法。方法 常规提取人类基因组DNA作为模板，PCR扩增nm23-H1基因，变性PCR产物，6%非变性聚丙烯酰胺凝胶SSCP电泳，银染后分析结果。结果 改进了目前PCR-SSCP分析中应用同位素标记的检测方法，采用银染方法，建立起简单迅速的非同位素PCR-SSCP分析方法和适宜条件。并将这种方法成功地应用于肿瘤转移抑制基因点突变的检测。结论 非同位素聚合酶链反应-单链构象多态(Nonisotopic PCR-SSCP)分析是一种迅速、敏感地检测基因顺序中突变的单链DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳技术。
, http://www.100md.com [中图分类号] R73-3 [文献标识码] A
[文章编号]1000-4955(2000)03-0221-03
Analysis of non-isotopic PCR-SSCP A simple and rapid method for detection of gene mutation in the genomic DNA of human tumors
YU Jing-cui,ZHONG Shu-qi,FU Song-bin
(Harbin Medical University,Harbin 150086,China)
[Abstract] Objective Establish a simple and rapid method for nonisotopic PCR-SSCP.Methods Human genomic DNA was extracted from the samples of human gastric cancers and the controls.And nm23-H1 gene was amplified by polymerase chain reaction.Analysis of single stranded conformation polymorphism was performed on 6% homogenous polyacrylamide gel.Results We have improved and established a method for non-isotopic PCR-SSCP to detect gene mutations.Conclusions Non-isotopic PCR-SSCP is a simple and rapid method to detect gene mutations in human tumors.
, 百拇医药
[Key words] PCR-SSCP;Nm23-H1 gene;Gene mutation
聚合酶链式反应—单链构象多态(polymerase chain reaction-single-stranded conformation polymorphism,PCR-SSCP)分析是一项单链DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，它根据不同构象的等长DNA单链在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳迁移率的变化来检测基因突变。这种技术具有简便、快速、敏感(可检出单个碱基突变)和适于大样本初筛等特点。自1989年建立以后，世界各实验室竞相开展，已被广泛应用于突变的鉴定和分析、基因定位等领域[1,2]。最初应用的PCR-SSCP分析都是通过同位素标记的方法进行检测，虽然敏感性很高，但由于对环境有放射性污染以及同位素半衰期限制实验的开展等缺点，使之不能成为常规研究检测手段。我们采用银染方法建立了一种较稳定的非同位素PCR-SSCP分析方法，并应用于肿瘤分子遗传学研究中基因突变的大样本初筛，为进一步基因测序工作打下基础。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 DNA提取 取新鲜肿瘤和正常对照组织标本，用蛋白酶K-苯酚-氯仿法常规提取基因组DNA。
1.2 PCR扩增 以胃癌及对应正常胃组织基因组DNA为模板，以含nm23-H1基因质粒作对照，PCR扩增基因组DNA中nm23-H1基因。
1.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶SSCP电泳[2]
1.3.1 制备6%聚丙烯酰胺凝胶：胶联比为丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=49:1,0.5×TBE为电泳缓冲液。
1.3.2 样品变性：5～10μl PCR反应产物中加入25μl加样缓冲液，混匀后98℃加热变性10min，冷却后上样。
1.3.3 电泳：循环水恒温15℃，恒压20V/cm条件下电泳3h,然后在40V/cm下电泳2h，结束电泳。
, 百拇医药
1.4 银染分析
1.4.1 固定：凝胶用固定液固定10～20min后，回收固定液，用双蒸水漂洗凝胶3次，每次2～3min。
1.4.2 染色：将凝胶浸泡在银染液中振荡，染色8～10min,回收染色液，用双蒸水漂洗凝胶3次，每次2～3min。
1.4.3 显影：将凝胶置于显影液中，轻轻晃动，待显出浅棕色条带时，立即终止反应。
1.4.4 分析：应用凝胶自动成像系统进行分析。
1.5 SSCP方法学与电泳条件的研究 常规应用EB染色法[3]、银染法[4]和同位素法检测nm23-H1基因单链构象多态，同时结合不同浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶、甘油含量、不同温度、不同电压条件进行研究，同时对上述3种方法进行对比研究。
, 百拇医药
2 结果与分析
以含正常nm23-H1基因的质粒为模板DNA，应用上述PCR反应条件可以扩增出高特异性的nm23-H1基因片段。同时，成功地改进了目前PCR-SSCP分析中应用同位素标记的检测方法，采用银染方法，建立起简单迅速的非同位素PCR-SSCP分析方法和适宜条件。图1和图2为EB染色[4]和银染两种方法检测的PCR-SSCP电泳结果。图中可以观察到两条特异的单链电泳区带和一条残存的双链区带。
图1 EB染色法检测的PCR-SSCP的电泳结果
图2 银染法检测的PCR-SSCP电泳结果
(SS代表单链DNA，DS代表双链DNA)
, 百拇医药
2.1 非同位素PCR-SSCP检测结果分析 根据孙开来等的报道[3]，残存双链带和特异单链电泳区带的相对位置不能预先确定，不同电泳条件和不同片段表现不同。我们在实验中检测到的结果都是残存双链DAN区带于前，单链区带在后。这是由于在非变性聚丙烯酰胺凝胶中，DNA双链的电泳迁移率决定于片段长短，而单链DAN片段的电泳迁移率不仅决定于其片段长短，更主要决定于其构象。不同电泳条件下和不同片段的构象个异,电泳迁移率就不同。发生单碱基突变的DNA片段由于构象改变导致电泳迁移率的变化而被检出。
2.2 影响电泳迁移率的条件 DNA单链的构象形成与稳定依赖于外部环境。迄今还无人报道一种适用于各种条件下的标准PCR-SSCP电泳条件。主要从以下几个方面着手探索适于目标DNA单链分离的条件。
2.2.1 凝胶浓度：先后试验了3%、4%、6%和8% 4种浓度的聚丙酰胺凝胶，发现较高浓度凝胶有利于nm23-H1单链DNA分离。但由于根据《分子克隆》记载，大于8%的聚丙烯酰胺凝胶有效分离范围小于400bp，为此我们选择了6%的凝胶浓度。最近有文献报道，高浓度的聚丙烯酰胺凝胶(12%)进行SSCP电泳检测425bp的CFTR基因亦获良好效果。
, http://www.100md.com
2.2.2 甘油含量：添加甘油有利于DNA单链在凝胶中的分离。Orita在1989年报道[5]10%甘油添入凝胶可提高突变顺序的分离，但机理不清。同时，在实验中还发现添加甘油的浓度若增大反而不利于单链DNA分离。甘油在低浓度时，可以部分打开单链折叠空间结构，使更多分子暴露表面，加强丙烯酰胺凝胶纤维与DNA局部构象变化的作用；而甘油浓度过高，因减弱甚至消除单链DNA的空间结构，反而降低分离效果，所以我们将Orita报告的甘油浓度减半使用，效果良好。
2.2.3 温度：恒温是SSCP电泳分析成功的关键，恒定的电泳温度有利于维持单链构象的稳定。本实验结果显示电泳在室温和4℃下进行，对电泳迁移率及单链分离影响不大。厚胶不利于散热恒温，采用0.5mm的凝胶不仅有利于恒定胶温，而且还可以缩短染色时间。
2.3 非同位素PCR-SSCP分析的灵敏性和可靠性 通过SSCP电泳加入具有放射性的PCR产物样品，浓度梯度加样，依次将电泳后凝胶进行EB染色、银染和放射自显影检测，结果见表1。
, http://www.100md.com
表1 PCR-SSCP分析方法的比较(浓度梯度加样*) 检测方法
1μl
2μl
4μl
6μl
8μl
12μl
16μl
EB染色
银染
放射自显影
+
, 百拇医药
+
+
+
+
+
+
+**
+
+
+
+
+
+
+
, http://www.100md.com
+
注：*样品为未经稀释PCR反应产物；**可检出2条单链电泳区带为+
从表1中可以看出银染比较灵敏，与放射自显影的灵敏度差距较小，是一种较有实用潜力的非同位素检测手段。关于非同位素PCR-SSCP分析的可靠性研究，我们也是通过对1块凝胶依次使用3种方法检测，然后比较检测结果，结果表明三种方法显示单链位置完全一致。这说明非同位素SSCP检测手段的可靠性与同位素标记的检测手段一样值得信赖。
[基金来源]黑龙江省科学技术计划项目青年基金
[作者简介]于景翠(1960-),女，硕士
[参考文献]
[1] 徐 询，刘震乾.DNA重组技术[M].北京：科技出版社，1990，50.
, 百拇医药
[2] Hayashi K.PCR-SSCP:a simple and sensitive method for detection of mutation in the genomic DNA[J].PCR methods and Appl,1991,1:34.
[3] 孙开来.应用PCR-SSCP法检测第Ⅶ因子内单个碱基置换[J].中华医学遗传学杂志，1993，10(1)：7.
[4] Yap EPH and Mcgee JOD.Nonisotopic SSCP detection on PCR product by ethidium bromide staining[J].Trends in Genet,1992,8:49.
[5] Orita M,Suzuki Y,Sekiya T et al.Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphisms Using the polymerase chain reaction[J].Genomics,1989,5:874.
[收稿日期]1999-09-24
[修订日期]1999-10-06, 百拇医药