用人肝细胞cDNA文库制备Dig-Fas探针
作者：唐恩洁 杨宗琪 赵明才 冯莉 任碧轩 敬保迁 李仁 眭维耻
单位：唐恩洁 杨宗琪 赵明才 冯莉 任碧轩 敬保迁 李仁(川北医学院分子生物学研究所，四川南充 637007)；眭维耻(川北医学院附属医院 皮肤科)
关键词：Fas；cDNA文库；Dig标记；探针
川北医学院学报000301 摘 要：为探索SLE发生、发展与Fas表达的关系，本文采用降落PCR技 术、分子克隆技术和Fas特异性引物，将从人肝细胞cDNA文库中扩增的Fas cDNA插入T- easy vector中，转染JM109，经耐药性和lacZ插入失活筛选，快速细胞裂解法、限制性内切酶酶 切片段和PCR扩增试验分析鉴定，确证获阳性转化子。然后采用地高辛化学连接标记和查见 方法，标记扩增、分离和纯化的Fas cDNA，经斑点免疫实验证实获高滴度Dig - Fas cDNA探 针。
, 百拇医药
中图分类号：R392.12 文献标识码 ：A 文章编号：1005-3697(2000)03-0001-03
Preparation of Dig-labeled Fas cDNA probe with human liver cDNA l ibrary
TANG En-jie,YANG Zong-qi,ZHAO Ming-cai，FONG Li,REN Bi-xuan,JING Bao-qian,LI Ren
(Research Laboratory of Molecular Biology,North Sichuan Medical Col lege,Nanchong,Sichuan,637000,China)
XI Wei-zhi
Abstract:To investigate the relation between the expressio n of Fas and the course of Systemiclupus Erythematosus (SLE), the TD Polymerase Chain Reaction and the specific primers of Fas were used to amplify Fas cDNA in Humam liver cDNA library. The amplified products were inserted into the PGEM-T e asy vector and the recombinants were transferred into JM109 competent cells. It was confirmed by screening with the genes of resistant drug and lacZ , as well a s the size of the fragments cut with EcoRI that the positive clones contained Fa s cDNA had been gained. The Fas cDNA isolated from positive clones was labeled w ith Dig and Dig-labeled Fas cDNA probe was detected by anti-Dig-AP Conjugation.
, 百拇医药
Key words: fas;cDNA library;dig-label;probe
人体正常功能的维持有赖于细胞数量的恒定，而细胞数量的恒定 是通过贯穿于机体发育过程始终的细胞增殖和细胞死亡之间的平衡来实现的。被称作细胞凋 亡的细胞死亡是一种受基因调控的，不同于细胞坏死的生理性细胞死亡[1]。被称 作“死亡分子”或“自身基因”的Fas分子是相继发现的、与凋亡相关的细胞表面重要蛋白 分子。已有研究表明Fas表达异常(减少、缺失、增高或出现可溶性Fas分子等)已见于肿瘤 、自身免疫性疾病、AIDS等多种疾病。故Fas及Fas配体(FasL)是致细胞凋亡的关键分子， 是细胞免疫应答的重要介质，其涉及到自身免疫、炎症组织损伤等病理损伤[2 - 4] 。SLE是自身免疫性疾病，为探索Fas表达与SLE间的关系，我们制备了地高辛标记的Fas探 针。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 材料：人肝细胞cDNA-λTriplEX溶解物购于Clontech，Taq和10×PCR缓冲液购 于华西医科大学利康实业公司生物技术开发部，EcoRI限制性内切酶是Gibco产品，地高辛化 学连结和查见试剂盒(Dig-Chem-Link Labeling and detection set cat.No.1836463)、d NTPs和尼龙膜是Boehringer Mannheim产品。据Fas cDNA序列设计的由Cybersyn公司合成的F as特异性引物序列为：f 2(上游引物)5′-ATG CTG GGC ATC TGG ACC CT-3′与Fas cDNA 197-217位碱基序列一致；f4(下游引物) 5′-CTC TAG ACC AAG CTT TGG AT -3′由Fas cDNA 3′ 端1185 - 1204位碱基的反向互补序列组成。[5]
1.2 方法
1.2.1 用降落PCR扩增Fas cDNA[6]：取1ml人肝细胞cDNA-λTriplEX文库溶 解物1ul，加入49ul PCR反应混合物中(含50mMol/L KCl、10mMol Tris-HCl、1.5mMol/L Mg Cl2 、100uMol/L dNTPs、1.5u Taq DNA多聚酶、0.4uMol/L Fas引物)，短时离心混匀后 ，置PCR扩增仪(美国Jame公司产)，按下列方案扩增Fas cDNA，94℃ 4 min，94℃变性1mi n，66℃复性1min，72℃延伸1min，3个循环；94℃1min，64℃1min，72℃1min，3个循环；9 4℃1min，62℃1min，72℃1min，3个循环；94℃1min，60℃1min，72℃1min，3个循环；94 ℃1min，58℃1min，72℃1min，3个循环；94℃1min，56℃1min，72℃1min，3个循环；94℃ 1min，54℃1min，72℃1min，3个循环；94℃1min，52℃1min，72℃1min，3个循环；94℃1m in，50℃1min，72℃1min，11个循环；72℃7min。总共进行35个循环扩增反应后，取10ul， 用0.8琼脂糖凝胶进行电泳分析。
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1.2.2 用T- easy vector克隆Fas cDNA PCR扩增产物：首先用高纯PCR产物纯化试剂盒(Hi gh Pure PCR Product Purification kit.cat.No.1732668.BM)，纯化Fas cDNA扩增产物， 然后按PGEM-T easy vector system(Promega.cat.No.A1380)试剂盒说明将纯化的Fas cDN A PCR扩增产物和T- easy vector按3：1(克分子)比例混合，置4 - 8℃连接约24h后，取 连接物4ul转化JM109感受态细胞，接种于含Amp(50ug/ml)、X- gal(50mg/ml)20ul和IPT G(20mg/ml)80ul的LB平板，37℃孵育18 -24h，选择白色菌落，即为含PCR产物的阳性转化 子。
1.2.3 阳性转化子的分析鉴定
1.2.3.1 快速细胞裂解法鉴定：将随机选择的10个白色菌落点种含Amp的LB平板，37℃孵育 18 -24h，刮取菌落，放入Cracking gel裂解缓冲液中[3]，37℃孵育15min，13000 rpm离心15min，用0.8琼脂糖凝胶电泳分析。
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1.2.3.2 EcoRI酶切片段分析：用EcoRI消化扩增、分离、纯化的质粒DNA，并用0 .8琼脂糖凝胶电泳分离和观察酶切片段大小。
1.2.3.3 用PCR扩增分析鉴定阳性转化子：以阳性转化子质粒DNA为模板，用Fas特异性 引物，按前述扩增方案扩增Fas cDNA，再经0.8琼脂糖凝胶分离鉴定扩增引物。
1.2.4 制备Dig-Fas cDNA探针
1.2.4.1 扩增、分离、纯化Fas cDNA：用含Amp的LB培养液扩增阳性转化子，碱裂解法分离 、纯化质粒DNA和EcoRI消化质粒DNA，经低熔点琼脂糖凝胶分离、纯化Fas cDNA。
1.2.4.2 用地高辛化学连接法标记Fas-cDNA：按地高辛化学连接试剂盒说明标记纯化 的Fas cDNA。
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1.2.4.3 用斑点免疫试验鉴定Dig-Fas cDNA：将上述标记物按10倍稀释成不同浓度， 然后各取2ul点于尼龙膜上，再用碱性磷酸酶标记的抗-Dig抗体(抗Dig-AP)滴定Dig-Fas c DNA浓度。
2 结 果
2.1 用降落PCR扩增Fas cDNA结果：以人肝细胞cDNA-λTriplEX文库溶解物为模 板，采用Fas特异性引物和降落PCR技术，扩增Fas cDNA片段的结果(见图1)。在图1的2、3泳 道可见分子大小约为1000bp的阳性条带，表明已获Fas cDNA PCR扩增条带。
2.2 连接和转化结果：用PGEM-T easy vector和Fas cDNA PCR扩增产物的连接混合物 转染的JM109感受态细胞在不含Amp的LB平板上大量生长，在含Amp、X-gal和IPTG的LB平板上 有16个白色菌落和较多的兰色菌落生长，其中白色菌落即可能是含Fas cDNA的阳性转化子。
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2.3 阳性转化子的筛选及鉴定结果
2.3.1 阳性转化子质粒DNA鉴定结果：取16个白色菌落和1个兰色菌落，经快速细胞裂 解法和质粒DNA碱裂解提取法筛选到5个可能含Fas cDNA PCR扩增片段的质粒DNA(见图2)。
2.3.2 用EcoRI酶切片段分析鉴定阳性转化子：用EcoRI消化从阳性转化子扩增培养物 中分离、纯化的质粒DNA，经电泳分离(图3)观察均呈现两条带，其中小带即为插入的Fas cDNA带，但对Fas cDNA片段大小分析可见有两种大小不同的条带。
2.3.3 用PCR扩增试验鉴定Fas cDNA：以阳性转化子质粒DNA为模板，用Fas引物和降落 PCR方法扩增Fas cDNA的结果(见图4)。由图4可见Fas2-3和Fas2-4号质粒，呈现两条分子大 小不同的强阳性带，Fas2-2和Fas2-5仅呈现一条较宽、较弱的条带。
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2.3.4 插入T- easy vector中的Fas cDNA的分离、纯化结果：用低熔点琼脂糖凝胶分 离、纯化Fas cDNA插入片段的结果(见图5)。由图5可见阳性转化子经EcoRI消化后分别呈现 一 分子大小为500 - 600bp，另一分子大小约为1000bp的片段。分别切取大、小插入片段，分 离、纯化。
2.3.5 Dig- Fas cDNA探针标记及鉴定结果：用抗Dig-AP和斑点免疫试验检测Dig -Fa s cDNA的结果(见图6)，可见除阴性对照外，其余各点均呈现很强的有色斑点，其滴度1：20 00，表明已获高滴度的Dig-Fas cDNA。
3 讨 论
3.1 细胞死亡的调节与细胞分裂的调节一样复杂，一样重要。多细胞生物中已经分 化的细胞可通过激活细胞凋亡杀死自身细胞，以维持体内平衡。凋亡在胚胎发育、组织发生 、胸腺内细胞的清除、CTL和NK细胞杀伤靶细胞、内分泌依赖细胞的生长萎缩、昆虫幼虫的 羽化、由蝌蚪发育成青蛙等方面均起重要作用。已有研究表明，不能正常进行细胞凋亡过程 的个体，常伴发癌症、自身免疫性疾病、病毒感染(如获得性免疫缺陷综合征，AIDS)和许 多以细胞退化为特征的神经退化性失调等重大疾病。Fas与FasL结合及其信号传导，在诱导 细胞凋亡、维持机体自身稳定和保持内环境平衡方面起重要作用。已知Fas/FasL表达异常与 机体多种疾病，特别是免疫系统紊乱和肿瘤的发生、发展密切相关。因此，Dig-Fas探针的 制备无疑为研究Fas/FasL与疾病的关系奠定了物质基础。[7-9]
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3.2 对插入PGEM-T vector的Fas cDNA进行PCR扩增和限制性内切酶酶切片段进行分析时， 均呈现两条分子大小不同的条带，与Naoto Itoh的观察结果基本一致[10]。Naoto Itoh用Fas cDNA探针分析KT-3，U-937和Chu-2细胞系的Fas表达时，观察到1.9和2.7kb的两 条RNA杂交带。是否人肝cDNA文库中亦存在两个大小不同的Fas cDNA片段，是否大片段为全 长Fas cDNA，小带为不含第6外显子的可溶性Fas cDNA片段，尚待测序确定。
3.3 研究证实在线状T- easy vector T突出末端内侧具EcoRI酶切位点的PGEM-T easy vect or可用于方便、快速、有效地克隆和鉴定PCR产物。
3.4 采用递减复性温度的降落PCR(TD)技术，可在同一PCR反应管内，使用不同的复性温 度以确保获得最佳反应结果。经实验证实，其确实是一种潜在的一步法找到最佳扩增条件的 方法，同时亦可在同一PCR仪内，用相同反应条件扩增不同的DNA片段。
, 百拇医药
图1 Fas cDNA的PCR扩增结果。1～3泳道为Fas cDNA扩增结果，其中 第1泳道用ampliTaq酶，未见明显扩增条带，2、3泳道用Taq酶，可见1000bp的条带。4泳道 为 λDNA/HindⅢMarker，5泳道为t(14；18)PCR扩增结果，(PCR扩增阳性对照)，可见分子 大小为2、3、4的非常强的阳性条带。
图2 从插入Fas cDNA的T easy-vector阳性转化子中分离的质粒DNA电泳结果。每条泳道均 可见一条非常明显、分子大小约为4kb的电泳条带。
图3 Fas cDNA T vector阳性转化子的质粒DNA EcoRI酶切片段电 泳结果。1～5泳道均可见两条电泳带，其中小带即为插入的Fas cDNA，但其分子大小不同。
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图4 Fas cDNA的PCR鉴定结果。其中3、5、6泳道均可见明显的Fas cDNA PC R扩 增条带，其 中6泳道可见一较弱较宽的扩增条带，3、5泳道可见2个大小不同的PCR扩增条带。4泳道是λ DNA/Hind ⅢMarker，2、7泳道为Fas cDNA T vector质粒DNA对照。
图5 大量扩增、分离酶切的插入不同大小Fas cDNA PCR扩增产物的质粒DNA电泳结果。从图 中可见每条泳道均可见两种不同分子大小的Fas cDNA插入片段，切下这些片段，经分离、纯 化后，用作Dig标记探针用。
图6 DigFas cDNA标记探针鉴定结果。图中第4，5列为DigFas cDNA标 记鉴定 结果，不同稀释度的DigFas cDNA经抗DigAP检测，均呈现明显的有色斑点。
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基金项目：四川省卫生厅科研基金资助，960007号。
作者简介：唐恩洁(1946—)，女，重庆市人，教授，主要从事分子生物 学、免疫学与微生物学研究。
参考文献：
[1] 李淑彬. 细胞凋亡与人类疾病[J].国外医学免疫学分册，1997 ,20(6): 293.
[2] 何凤田,等.程序性细胞死亡的哺乳类基因调控[J].免疫学杂志，1996,12 (2): 71.
[3] LeithAuser F，Dhein J，Mechtersheimer G, et al. Constitutive and I nduced Expression of Apo-1, A New Member of the Nerve Growth Factor/Tumor Necros is Factor Receptor Superfamily in Normal and Neoplastic Cells. Laboratory Inves tigation,1993,69(4):415.
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[4] Rose M L, Latchman S D, IsenBerg A D. Bcl-2 and Fas molecules wh ich Influence Apoptosis, a possible Role in Systemiclupus Erythematosus. Autoimm unity, 1994,17:271.
[5] Dieffenbach WC, Dveksler SG. PCR Primer : A Laboratory Manual. C old Spring Harbor Laboratory press,1995.
[6] 黄培善，等译.PCR技术实验指南[M].北京：科学出版社，1998，33 .
[7] Itoh N, Yonehara S, Ishii A et al. The Polypeptide Encoded by the cDNA for Human cell Surface Antigen Fas can Mediate Apoptosis. Cell, 1991, 66:2 33.
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[8] 张国驰. Fas/FasL(配体)与免疫相关疾病[J]. 国外医学免疫学分册， 1999,22(1): 40.
[9] 吴雪平. Fas系统介导的细胞凋亡与肝脏疾病[J]. 国外医学免疫学分册 ，1999, 22(2): 68.
[10] Rukavina D, Podack RE. Abundant perforin expression at the matern al-fetal interface: guarding the Semiallogeneic transplant. Immunology Today, 20 00,21(4):16011 Nitsche F, Doshi R. The kiss of Death. Immunology News,1998, 5 (4):188.
(收稿日期：2000-06-01), http://www.100md.com
单位：唐恩洁 杨宗琪 赵明才 冯莉 任碧轩 敬保迁 李仁(川北医学院分子生物学研究所，四川南充 637007)；眭维耻(川北医学院附属医院 皮肤科)
关键词：Fas；cDNA文库；Dig标记；探针
川北医学院学报000301 摘 要：为探索SLE发生、发展与Fas表达的关系，本文采用降落PCR技 术、分子克隆技术和Fas特异性引物，将从人肝细胞cDNA文库中扩增的Fas cDNA插入T- easy vector中，转染JM109，经耐药性和lacZ插入失活筛选，快速细胞裂解法、限制性内切酶酶 切片段和PCR扩增试验分析鉴定，确证获阳性转化子。然后采用地高辛化学连接标记和查见 方法，标记扩增、分离和纯化的Fas cDNA，经斑点免疫实验证实获高滴度Dig - Fas cDNA探 针。
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TANG En-jie,YANG Zong-qi,ZHAO Ming-cai，FONG Li,REN Bi-xuan,JING Bao-qian,LI Ren
(Research Laboratory of Molecular Biology,North Sichuan Medical Col lege,Nanchong,Sichuan,637000,China)
XI Wei-zhi
Abstract:To investigate the relation between the expressio n of Fas and the course of Systemiclupus Erythematosus (SLE), the TD Polymerase Chain Reaction and the specific primers of Fas were used to amplify Fas cDNA in Humam liver cDNA library. The amplified products were inserted into the PGEM-T e asy vector and the recombinants were transferred into JM109 competent cells. It was confirmed by screening with the genes of resistant drug and lacZ , as well a s the size of the fragments cut with EcoRI that the positive clones contained Fa s cDNA had been gained. The Fas cDNA isolated from positive clones was labeled w ith Dig and Dig-labeled Fas cDNA probe was detected by anti-Dig-AP Conjugation.
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Key words: fas;cDNA library;dig-label;probe
人体正常功能的维持有赖于细胞数量的恒定，而细胞数量的恒定 是通过贯穿于机体发育过程始终的细胞增殖和细胞死亡之间的平衡来实现的。被称作细胞凋 亡的细胞死亡是一种受基因调控的，不同于细胞坏死的生理性细胞死亡[1]。被称 作“死亡分子”或“自身基因”的Fas分子是相继发现的、与凋亡相关的细胞表面重要蛋白 分子。已有研究表明Fas表达异常(减少、缺失、增高或出现可溶性Fas分子等)已见于肿瘤 、自身免疫性疾病、AIDS等多种疾病。故Fas及Fas配体(FasL)是致细胞凋亡的关键分子， 是细胞免疫应答的重要介质，其涉及到自身免疫、炎症组织损伤等病理损伤[2 - 4] 。SLE是自身免疫性疾病，为探索Fas表达与SLE间的关系，我们制备了地高辛标记的Fas探 针。
1 材料和方法
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1.1 材料：人肝细胞cDNA-λTriplEX溶解物购于Clontech，Taq和10×PCR缓冲液购 于华西医科大学利康实业公司生物技术开发部，EcoRI限制性内切酶是Gibco产品，地高辛化 学连结和查见试剂盒(Dig-Chem-Link Labeling and detection set cat.No.1836463)、d NTPs和尼龙膜是Boehringer Mannheim产品。据Fas cDNA序列设计的由Cybersyn公司合成的F as特异性引物序列为：f 2(上游引物)5′-ATG CTG GGC ATC TGG ACC CT-3′与Fas cDNA 197-217位碱基序列一致；f4(下游引物) 5′-CTC TAG ACC AAG CTT TGG AT -3′由Fas cDNA 3′ 端1185 - 1204位碱基的反向互补序列组成。[5]
1.2 方法
1.2.1 用降落PCR扩增Fas cDNA[6]：取1ml人肝细胞cDNA-λTriplEX文库溶 解物1ul，加入49ul PCR反应混合物中(含50mMol/L KCl、10mMol Tris-HCl、1.5mMol/L Mg Cl2 、100uMol/L dNTPs、1.5u Taq DNA多聚酶、0.4uMol/L Fas引物)，短时离心混匀后 ，置PCR扩增仪(美国Jame公司产)，按下列方案扩增Fas cDNA，94℃ 4 min，94℃变性1mi n，66℃复性1min，72℃延伸1min，3个循环；94℃1min，64℃1min，72℃1min，3个循环；9 4℃1min，62℃1min，72℃1min，3个循环；94℃1min，60℃1min，72℃1min，3个循环；94 ℃1min，58℃1min，72℃1min，3个循环；94℃1min，56℃1min，72℃1min，3个循环；94℃ 1min，54℃1min，72℃1min，3个循环；94℃1min，52℃1min，72℃1min，3个循环；94℃1m in，50℃1min，72℃1min，11个循环；72℃7min。总共进行35个循环扩增反应后，取10ul， 用0.8琼脂糖凝胶进行电泳分析。
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1.2.2 用T- easy vector克隆Fas cDNA PCR扩增产物：首先用高纯PCR产物纯化试剂盒(Hi gh Pure PCR Product Purification kit.cat.No.1732668.BM)，纯化Fas cDNA扩增产物， 然后按PGEM-T easy vector system(Promega.cat.No.A1380)试剂盒说明将纯化的Fas cDN A PCR扩增产物和T- easy vector按3：1(克分子)比例混合，置4 - 8℃连接约24h后，取 连接物4ul转化JM109感受态细胞，接种于含Amp(50ug/ml)、X- gal(50mg/ml)20ul和IPT G(20mg/ml)80ul的LB平板，37℃孵育18 -24h，选择白色菌落，即为含PCR产物的阳性转化 子。
1.2.3 阳性转化子的分析鉴定
1.2.3.1 快速细胞裂解法鉴定：将随机选择的10个白色菌落点种含Amp的LB平板，37℃孵育 18 -24h，刮取菌落，放入Cracking gel裂解缓冲液中[3]，37℃孵育15min，13000 rpm离心15min，用0.8琼脂糖凝胶电泳分析。
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1.2.3.2 EcoRI酶切片段分析：用EcoRI消化扩增、分离、纯化的质粒DNA，并用0 .8琼脂糖凝胶电泳分离和观察酶切片段大小。
1.2.3.3 用PCR扩增分析鉴定阳性转化子：以阳性转化子质粒DNA为模板，用Fas特异性 引物，按前述扩增方案扩增Fas cDNA，再经0.8琼脂糖凝胶分离鉴定扩增引物。
1.2.4 制备Dig-Fas cDNA探针
1.2.4.1 扩增、分离、纯化Fas cDNA：用含Amp的LB培养液扩增阳性转化子，碱裂解法分离 、纯化质粒DNA和EcoRI消化质粒DNA，经低熔点琼脂糖凝胶分离、纯化Fas cDNA。
1.2.4.2 用地高辛化学连接法标记Fas-cDNA：按地高辛化学连接试剂盒说明标记纯化 的Fas cDNA。
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1.2.4.3 用斑点免疫试验鉴定Dig-Fas cDNA：将上述标记物按10倍稀释成不同浓度， 然后各取2ul点于尼龙膜上，再用碱性磷酸酶标记的抗-Dig抗体(抗Dig-AP)滴定Dig-Fas c DNA浓度。
2 结 果
2.1 用降落PCR扩增Fas cDNA结果：以人肝细胞cDNA-λTriplEX文库溶解物为模 板，采用Fas特异性引物和降落PCR技术，扩增Fas cDNA片段的结果(见图1)。在图1的2、3泳 道可见分子大小约为1000bp的阳性条带，表明已获Fas cDNA PCR扩增条带。
2.2 连接和转化结果：用PGEM-T easy vector和Fas cDNA PCR扩增产物的连接混合物 转染的JM109感受态细胞在不含Amp的LB平板上大量生长，在含Amp、X-gal和IPTG的LB平板上 有16个白色菌落和较多的兰色菌落生长，其中白色菌落即可能是含Fas cDNA的阳性转化子。
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2.3 阳性转化子的筛选及鉴定结果
2.3.1 阳性转化子质粒DNA鉴定结果：取16个白色菌落和1个兰色菌落，经快速细胞裂 解法和质粒DNA碱裂解提取法筛选到5个可能含Fas cDNA PCR扩增片段的质粒DNA(见图2)。
2.3.2 用EcoRI酶切片段分析鉴定阳性转化子：用EcoRI消化从阳性转化子扩增培养物 中分离、纯化的质粒DNA，经电泳分离(图3)观察均呈现两条带，其中小带即为插入的Fas cDNA带，但对Fas cDNA片段大小分析可见有两种大小不同的条带。
2.3.3 用PCR扩增试验鉴定Fas cDNA：以阳性转化子质粒DNA为模板，用Fas引物和降落 PCR方法扩增Fas cDNA的结果(见图4)。由图4可见Fas2-3和Fas2-4号质粒，呈现两条分子大 小不同的强阳性带，Fas2-2和Fas2-5仅呈现一条较宽、较弱的条带。
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2.3.4 插入T- easy vector中的Fas cDNA的分离、纯化结果：用低熔点琼脂糖凝胶分 离、纯化Fas cDNA插入片段的结果(见图5)。由图5可见阳性转化子经EcoRI消化后分别呈现 一 分子大小为500 - 600bp，另一分子大小约为1000bp的片段。分别切取大、小插入片段，分 离、纯化。
2.3.5 Dig- Fas cDNA探针标记及鉴定结果：用抗Dig-AP和斑点免疫试验检测Dig -Fa s cDNA的结果(见图6)，可见除阴性对照外，其余各点均呈现很强的有色斑点，其滴度1：20 00，表明已获高滴度的Dig-Fas cDNA。
3 讨 论
3.1 细胞死亡的调节与细胞分裂的调节一样复杂，一样重要。多细胞生物中已经分 化的细胞可通过激活细胞凋亡杀死自身细胞，以维持体内平衡。凋亡在胚胎发育、组织发生 、胸腺内细胞的清除、CTL和NK细胞杀伤靶细胞、内分泌依赖细胞的生长萎缩、昆虫幼虫的 羽化、由蝌蚪发育成青蛙等方面均起重要作用。已有研究表明，不能正常进行细胞凋亡过程 的个体，常伴发癌症、自身免疫性疾病、病毒感染(如获得性免疫缺陷综合征，AIDS)和许 多以细胞退化为特征的神经退化性失调等重大疾病。Fas与FasL结合及其信号传导，在诱导 细胞凋亡、维持机体自身稳定和保持内环境平衡方面起重要作用。已知Fas/FasL表达异常与 机体多种疾病，特别是免疫系统紊乱和肿瘤的发生、发展密切相关。因此，Dig-Fas探针的 制备无疑为研究Fas/FasL与疾病的关系奠定了物质基础。[7-9]
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3.2 对插入PGEM-T vector的Fas cDNA进行PCR扩增和限制性内切酶酶切片段进行分析时， 均呈现两条分子大小不同的条带，与Naoto Itoh的观察结果基本一致[10]。Naoto Itoh用Fas cDNA探针分析KT-3，U-937和Chu-2细胞系的Fas表达时，观察到1.9和2.7kb的两 条RNA杂交带。是否人肝cDNA文库中亦存在两个大小不同的Fas cDNA片段，是否大片段为全 长Fas cDNA，小带为不含第6外显子的可溶性Fas cDNA片段，尚待测序确定。
3.3 研究证实在线状T- easy vector T突出末端内侧具EcoRI酶切位点的PGEM-T easy vect or可用于方便、快速、有效地克隆和鉴定PCR产物。
3.4 采用递减复性温度的降落PCR(TD)技术，可在同一PCR反应管内，使用不同的复性温 度以确保获得最佳反应结果。经实验证实，其确实是一种潜在的一步法找到最佳扩增条件的 方法，同时亦可在同一PCR仪内，用相同反应条件扩增不同的DNA片段。
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图1 Fas cDNA的PCR扩增结果。1～3泳道为Fas cDNA扩增结果，其中 第1泳道用ampliTaq酶，未见明显扩增条带，2、3泳道用Taq酶，可见1000bp的条带。4泳道 为 λDNA/HindⅢMarker，5泳道为t(14；18)PCR扩增结果，(PCR扩增阳性对照)，可见分子 大小为2、3、4的非常强的阳性条带。
图2 从插入Fas cDNA的T easy-vector阳性转化子中分离的质粒DNA电泳结果。每条泳道均 可见一条非常明显、分子大小约为4kb的电泳条带。
图3 Fas cDNA T vector阳性转化子的质粒DNA EcoRI酶切片段电 泳结果。1～5泳道均可见两条电泳带，其中小带即为插入的Fas cDNA，但其分子大小不同。
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图4 Fas cDNA的PCR鉴定结果。其中3、5、6泳道均可见明显的Fas cDNA PC R扩 增条带，其 中6泳道可见一较弱较宽的扩增条带，3、5泳道可见2个大小不同的PCR扩增条带。4泳道是λ DNA/Hind ⅢMarker，2、7泳道为Fas cDNA T vector质粒DNA对照。
图5 大量扩增、分离酶切的插入不同大小Fas cDNA PCR扩增产物的质粒DNA电泳结果。从图 中可见每条泳道均可见两种不同分子大小的Fas cDNA插入片段，切下这些片段，经分离、纯 化后，用作Dig标记探针用。
图6 DigFas cDNA标记探针鉴定结果。图中第4，5列为DigFas cDNA标 记鉴定 结果，不同稀释度的DigFas cDNA经抗DigAP检测，均呈现明显的有色斑点。
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基金项目：四川省卫生厅科研基金资助，960007号。
作者简介：唐恩洁(1946—)，女，重庆市人，教授，主要从事分子生物 学、免疫学与微生物学研究。
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(收稿日期：2000-06-01), http://www.100md.com