HPV核酸探针斑点杂交技术在诊断尖锐湿疣中的应用
作者：夏佩莹 李凤云 汪万英 赵发英
单位：夏佩莹(蚌埠医学院 微生物学教研室，233003)；李凤云(蚌埠医学院 微生物学教研室，233003)；汪万英(蚌埠医学院附属医院，安徽 蚌埠 233004)；赵发英(蚌埠医学院附属医院，安徽 蚌埠 233004)
关键词： 尖锐湿疣；乳头状瘤病毒；核酸杂交
蚌埠医学院学报000304
〔摘要〕 目的：评估人类乳头状瘤病毒(HPV)核酸斑点 杂交技术在诊断尖锐湿疣中的价值。方法：采用地高辛标记的HPV分型核酸探针斑点杂交技术，对50例外阴、阴 道尖锐湿疣和26例保存的尖锐湿疣病理石蜡标本进行HPV DNA检测。结果：50例临床标本阳性率为84.0%，26例病理标本阳性率为84.6%，差异 无显著性(P>0.05)。结论：斑点杂交技术结合组织病理学检查对尖锐湿疣有诊断价值。
, 百拇医药
〔中国图书资料分类法分类号〕 R 752.53；R 373.9 〔 文献标识码〕 A
〔文章编号〕 1000-2200(2000)03-0163-02
Dot hybridization technique in diagnosis of condyloma acuminata
XIA Pei-ying,LI Feng-yun,WANG Wan-ying,ZHAO Fa-ying
(Department of Microbiology,Beng bu Medical College,Anhui 233003,China)
〔Abstract〕 Objective:To evaluate DNA hybridization of H PV for detection of the condyloma acuminata.Methods:Fifty clinical external genital and vaginal specimens a nd 26 pathological sections from patients suspecting of condyloma acuminata were exam ined with dot hybridization technique by using Dig-HPV 6 and 11 gene probes.Results:The positive rate was 84.0% in clinical specimens and 84.6% in histological sections.Conclusions:The results in this study indicate that DNA hybridizatio n together with histological examination are important for the diagnosis of cond yloma acuminata.
, 百拇医药
〔Key words〕 condyloma acuminata;papillomaviruses;nucleic acid hybridization
尖锐湿疣(condyloma acuminatum,CA)是由人类乳头状瘤病毒(HPV)感 染引起的性传播性疾病，近年来发病率有较大增长〔1，2〕。HPV型别达60型之多，C A病因多由6、11型引起。本文采用地高辛标记HPV 6型、11型核酸探针，对50例临床诊断的C A标本和26例CA的石蜡包埋组织标本作斑点杂交检测，以期探讨HPV核酸斑点杂交技术在CA诊 断上的价值。
1 材料与方法
1.1 材料 Dig-HPV-DNA 6、11型探针试剂盒由上海医科大学预防医学 研究所提供。新鲜CA组织由蚌埠医学院附属医院妇产科、激光室提供，取材后即-20℃冻存 待检。蜡块组织取自蚌埠医学院病理学教研室1993～1994年保存的病理标本。蜡块组织作4 μ m连续切片20～30片，收集于离心管中，切片组织经二甲苯、乙醇梯度脱水，脱蜡后组织于- 20℃冻存待检。
, 百拇医药
1.2 方法 每份组织置300 μl裂解液中，以眼科剪剪碎呈匀浆状，加入2 0～30 μg蛋白酶K，47℃水浴消化过夜。酚、氯仿抽提蛋白后以3 mol/L醋酸钠、无水乙醇 沉淀 组织DNA。干燥后以TE溶解DNA，于醋酸纤维素膜上抽滤点样，每份DNA加样50 μl(因同时作 两种型别探针，故需各点膜一张)。每张膜分别作阳性、阴性对照各一份。膜上DNA以碱变性 、中和后置80℃ 1 h烘干。将上述醋酸纤维素膜置塑料袋中，加入预杂交液，42℃ 2 h后立 即分别换入已经变性处理的Dig-HPV-DNA 6、11型探针，42℃水浴过夜。倒去杂交液后， 以Buffer反复漂洗以除去非特异性结合的探针，膜片经封闭液处理后加入碱性磷酸酶标记的 Dig抗体37℃温育30 min。膜片经Buffer反复漂洗后，加入底物液NBT+BCIP，37℃避光显色2 h。显色后膜片经ddH2O漂洗，湿片拍照，80℃烘干保存。
1.3 统计学方法 采用χ2检验。
, 百拇医药
2 结果
Dig-HPV-DNA探针检测后阳性标本为深蓝色斑点，阴性标本不显色，与对照标本一致 ，检测结果理想。50例外阴、阴道CA标本及26例石蜡保存标本检测后凡与HPV 6、11两型探 针中之一出现阳性者即判断为阳性，其中分别有36.0%和34.6%标本两种探针检测均为阳性， 两标本总阳性率差异无显著性(P>0.05)(见表1)。26例石蜡保存组织经病理学诊断为C A，见表皮呈乳头状增生，棘细胞层增厚，表皮细胞内有凹空细胞。病理学诊断与HPV-DNA 斑点杂交检测，符合率为84.6%(P>0.05)(见表2)。
表1 两种标本中HPV核酸探针斑点杂交结果 标本
n
(阳性数
合计
, http://www.100md.com
HPV-6
HPV-11
(HPV-6+
HPV-11
性数
总阳性率
(%)
CA临床标本
50
38
22
18
42
, http://www.100md.com
84.0
蜡块CA标本
26
19
12
9
22
84.6
合计
76
57
34
27
, 百拇医药 64
84.2
两标本总阳性率比较：χ2=0.07,P>0.05表2 26例病理诊断CA标本与斑点杂交配对比较(n) 组织病理学检查
(斑点杂交试验
合 计
阴性
阳性
阳性
22
4
26
阴性
, http://www.100md.com
0
0
0
合计
22
4
26
χ2配对=2.25,P>0.053 讨论
尖锐湿疣的发病率近年来有上升趋势，且属性传播疾病中的顽疾，不易根治。同 时HPV的感染与某些恶性肿瘤如阴茎癌、女阴癌、子宫颈癌发病有密切关系。因此从病变组 织中检测HPV核酸序列的有无既是确诊的主要手段，又利于对患者进行跟踪调查。HPV种类繁 多，但CA主要由6、11型引起，而且HPV不同型基因组DNA之间核苷酸序列有很大的同源性， 而这种同源性是HPV共有的标志〔1～3〕。笔者采用非同位素HPV DNA 6、11型探针， 以斑点杂交法检测病变组织中的HPV同源序列，以判定其在HPV感染中的诊断价值。
, 百拇医药
采用斑点杂交技术检测新鲜采取的CA组织与石蜡保存3～5年CA组织，发现检出率差异无显著 性(P>0.05)。说明在石蜡保存的组织块中只要提取方法得当，仍可获得DNA进行斑点 杂交检测，以往报道中曾有用石蜡切片作原位杂交试验〔4〕，两种方法虽均属高度 特异性、高敏感性技术，但原位杂交要求由病理医师在组织片中进行；而斑点杂交操作更为 简便，不需特殊仪器；且每张膜上可作20～30份标本，便于多份标本同时进行；斑点杂交目 测结果， 可在一般检验室中开展，易于推广；本试验表明，斑点杂交还可作为肿瘤回顾性研 究的一种有效手段。
CA诊断常依靠病理报告确定，而其病变主要特征是出现凹空细胞，但实际上凹空细胞并非CA 的特征性改变，其它如假性湿疣、慢性炎症、生理性增生等病变组织中均可出现凹空细胞 〔5〕。何杰等发现在伴有金黄色葡萄球菌L型感染的子宫颈癌细胞中也可见空泡样变细 胞 ，而在这些细胞中并未检测到HPV抗原〔5〕，因此仅以病理学检查中凹空细胞的有无 作为CA的诊断绝非可靠。CA是一种性传播性疾病，一旦误诊，不仅贻误治疗，还可能造成社 会 和家庭纠纷，在笔者检测的26例病理诊断为CA的标本中，HPV-DNA的斑点杂交试验阳性者22 例，阳性率84.6%，鉴于斑点杂交试验的高度敏感性，检测DNA可达pg水平，因此可认为经病 理学确诊的CA中可能有15%左右并无HPV感染，对这部分病例应排除假性湿疣、慢性炎症等其 它疾病，并应考虑细菌L型感染的可能。
, http://www.100md.com
核酸杂交技术仅需组织中有50～100个病毒核苷酸拷贝就可获得阳性结果，因此视为敏感性 极高的检测手段，斑点杂交法简便易行，在一般实验室的常规应用中是一种可供选择的方法 。
作者简介：夏佩莹(1946-)，女，浙江宁波人，副教授.
〔参考文献〕
〔1〕 Chang F.Role of papillomaviruses〔J〕.Clin Pathol,199 0,43(3)∶269.
〔2〕 Nagai N,Nuovo G,Friedman D,et al.Detection of papillomavirus n ucleic acids in genital precancers with the in situ hybridization technique 〔J〕.Int J Gynecol Pathol,1987,6(4)∶366.
〔3〕 孙建方.人类乳头瘤病毒感染的实验室研究〔J〕. 国外医学.皮肤病分册，1991，17(1)∶1.
〔4〕 李德春，王志水，刘彤华，等.核酸原位杂交技术在诊断尖锐湿疣中的价值 〔J〕.中华病理学杂志，1993，22(2)∶101.
〔5〕 何 杰，汪万英，张世馥，等.金黄色葡萄球菌L型和人乳头瘤病毒与宫颈癌 关系的研究〔J〕.中国微生态学杂志，1996，8(1)∶10.
收稿日期：1999-10-21, http://www.100md.com
单位：夏佩莹(蚌埠医学院 微生物学教研室，233003)；李凤云(蚌埠医学院 微生物学教研室，233003)；汪万英(蚌埠医学院附属医院，安徽 蚌埠 233004)；赵发英(蚌埠医学院附属医院，安徽 蚌埠 233004)
关键词： 尖锐湿疣；乳头状瘤病毒；核酸杂交
蚌埠医学院学报000304
〔摘要〕 目的：评估人类乳头状瘤病毒(HPV)核酸斑点 杂交技术在诊断尖锐湿疣中的价值。方法：采用地高辛标记的HPV分型核酸探针斑点杂交技术，对50例外阴、阴 道尖锐湿疣和26例保存的尖锐湿疣病理石蜡标本进行HPV DNA检测。结果：50例临床标本阳性率为84.0%，26例病理标本阳性率为84.6%，差异 无显著性(P>0.05)。结论：斑点杂交技术结合组织病理学检查对尖锐湿疣有诊断价值。
, 百拇医药
〔中国图书资料分类法分类号〕 R 752.53；R 373.9 〔 文献标识码〕 A
〔文章编号〕 1000-2200(2000)03-0163-02
Dot hybridization technique in diagnosis of condyloma acuminata
XIA Pei-ying,LI Feng-yun,WANG Wan-ying,ZHAO Fa-ying
(Department of Microbiology,Beng bu Medical College,Anhui 233003,China)
〔Abstract〕 Objective:To evaluate DNA hybridization of H PV for detection of the condyloma acuminata.Methods:Fifty clinical external genital and vaginal specimens a nd 26 pathological sections from patients suspecting of condyloma acuminata were exam ined with dot hybridization technique by using Dig-HPV 6 and 11 gene probes.Results:The positive rate was 84.0% in clinical specimens and 84.6% in histological sections.Conclusions:The results in this study indicate that DNA hybridizatio n together with histological examination are important for the diagnosis of cond yloma acuminata.
, 百拇医药
〔Key words〕 condyloma acuminata;papillomaviruses;nucleic acid hybridization
尖锐湿疣(condyloma acuminatum,CA)是由人类乳头状瘤病毒(HPV)感 染引起的性传播性疾病，近年来发病率有较大增长〔1，2〕。HPV型别达60型之多，C A病因多由6、11型引起。本文采用地高辛标记HPV 6型、11型核酸探针，对50例临床诊断的C A标本和26例CA的石蜡包埋组织标本作斑点杂交检测，以期探讨HPV核酸斑点杂交技术在CA诊 断上的价值。
1 材料与方法
1.1 材料 Dig-HPV-DNA 6、11型探针试剂盒由上海医科大学预防医学 研究所提供。新鲜CA组织由蚌埠医学院附属医院妇产科、激光室提供，取材后即-20℃冻存 待检。蜡块组织取自蚌埠医学院病理学教研室1993～1994年保存的病理标本。蜡块组织作4 μ m连续切片20～30片，收集于离心管中，切片组织经二甲苯、乙醇梯度脱水，脱蜡后组织于- 20℃冻存待检。
, 百拇医药
1.2 方法 每份组织置300 μl裂解液中，以眼科剪剪碎呈匀浆状，加入2 0～30 μg蛋白酶K，47℃水浴消化过夜。酚、氯仿抽提蛋白后以3 mol/L醋酸钠、无水乙醇 沉淀 组织DNA。干燥后以TE溶解DNA，于醋酸纤维素膜上抽滤点样，每份DNA加样50 μl(因同时作 两种型别探针，故需各点膜一张)。每张膜分别作阳性、阴性对照各一份。膜上DNA以碱变性 、中和后置80℃ 1 h烘干。将上述醋酸纤维素膜置塑料袋中，加入预杂交液，42℃ 2 h后立 即分别换入已经变性处理的Dig-HPV-DNA 6、11型探针，42℃水浴过夜。倒去杂交液后， 以Buffer反复漂洗以除去非特异性结合的探针，膜片经封闭液处理后加入碱性磷酸酶标记的 Dig抗体37℃温育30 min。膜片经Buffer反复漂洗后，加入底物液NBT+BCIP，37℃避光显色2 h。显色后膜片经ddH2O漂洗，湿片拍照，80℃烘干保存。
1.3 统计学方法 采用χ2检验。
, 百拇医药
2 结果
Dig-HPV-DNA探针检测后阳性标本为深蓝色斑点，阴性标本不显色，与对照标本一致 ，检测结果理想。50例外阴、阴道CA标本及26例石蜡保存标本检测后凡与HPV 6、11两型探 针中之一出现阳性者即判断为阳性，其中分别有36.0%和34.6%标本两种探针检测均为阳性， 两标本总阳性率差异无显著性(P>0.05)(见表1)。26例石蜡保存组织经病理学诊断为C A，见表皮呈乳头状增生，棘细胞层增厚，表皮细胞内有凹空细胞。病理学诊断与HPV-DNA 斑点杂交检测，符合率为84.6%(P>0.05)(见表2)。
表1 两种标本中HPV核酸探针斑点杂交结果 标本
n
(阳性数
合计
, http://www.100md.com
HPV-6
HPV-11
(HPV-6+
HPV-11
性数
总阳性率
(%)
CA临床标本
50
38
22
18
42
, http://www.100md.com
84.0
蜡块CA标本
26
19
12
9
22
84.6
合计
76
57
34
27
, 百拇医药 64
84.2
两标本总阳性率比较：χ2=0.07,P>0.05表2 26例病理诊断CA标本与斑点杂交配对比较(n) 组织病理学检查
(斑点杂交试验
合 计
阴性
阳性
阳性
22
4
26
阴性
, http://www.100md.com
0
0
0
合计
22
4
26
χ2配对=2.25,P>0.053 讨论
尖锐湿疣的发病率近年来有上升趋势，且属性传播疾病中的顽疾，不易根治。同 时HPV的感染与某些恶性肿瘤如阴茎癌、女阴癌、子宫颈癌发病有密切关系。因此从病变组 织中检测HPV核酸序列的有无既是确诊的主要手段，又利于对患者进行跟踪调查。HPV种类繁 多，但CA主要由6、11型引起，而且HPV不同型基因组DNA之间核苷酸序列有很大的同源性， 而这种同源性是HPV共有的标志〔1～3〕。笔者采用非同位素HPV DNA 6、11型探针， 以斑点杂交法检测病变组织中的HPV同源序列，以判定其在HPV感染中的诊断价值。
, 百拇医药
采用斑点杂交技术检测新鲜采取的CA组织与石蜡保存3～5年CA组织，发现检出率差异无显著 性(P>0.05)。说明在石蜡保存的组织块中只要提取方法得当，仍可获得DNA进行斑点 杂交检测，以往报道中曾有用石蜡切片作原位杂交试验〔4〕，两种方法虽均属高度 特异性、高敏感性技术，但原位杂交要求由病理医师在组织片中进行；而斑点杂交操作更为 简便，不需特殊仪器；且每张膜上可作20～30份标本，便于多份标本同时进行；斑点杂交目 测结果， 可在一般检验室中开展，易于推广；本试验表明，斑点杂交还可作为肿瘤回顾性研 究的一种有效手段。
CA诊断常依靠病理报告确定，而其病变主要特征是出现凹空细胞，但实际上凹空细胞并非CA 的特征性改变，其它如假性湿疣、慢性炎症、生理性增生等病变组织中均可出现凹空细胞 〔5〕。何杰等发现在伴有金黄色葡萄球菌L型感染的子宫颈癌细胞中也可见空泡样变细 胞 ，而在这些细胞中并未检测到HPV抗原〔5〕，因此仅以病理学检查中凹空细胞的有无 作为CA的诊断绝非可靠。CA是一种性传播性疾病，一旦误诊，不仅贻误治疗，还可能造成社 会 和家庭纠纷，在笔者检测的26例病理诊断为CA的标本中，HPV-DNA的斑点杂交试验阳性者22 例，阳性率84.6%，鉴于斑点杂交试验的高度敏感性，检测DNA可达pg水平，因此可认为经病 理学确诊的CA中可能有15%左右并无HPV感染，对这部分病例应排除假性湿疣、慢性炎症等其 它疾病，并应考虑细菌L型感染的可能。
, http://www.100md.com
核酸杂交技术仅需组织中有50～100个病毒核苷酸拷贝就可获得阳性结果，因此视为敏感性 极高的检测手段，斑点杂交法简便易行，在一般实验室的常规应用中是一种可供选择的方法 。
作者简介：夏佩莹(1946-)，女，浙江宁波人，副教授.
〔参考文献〕
〔1〕 Chang F.Role of papillomaviruses〔J〕.Clin Pathol,199 0,43(3)∶269.
〔2〕 Nagai N,Nuovo G,Friedman D,et al.Detection of papillomavirus n ucleic acids in genital precancers with the in situ hybridization technique 〔J〕.Int J Gynecol Pathol,1987,6(4)∶366.
〔3〕 孙建方.人类乳头瘤病毒感染的实验室研究〔J〕. 国外医学.皮肤病分册，1991，17(1)∶1.
〔4〕 李德春，王志水，刘彤华，等.核酸原位杂交技术在诊断尖锐湿疣中的价值 〔J〕.中华病理学杂志，1993，22(2)∶101.
〔5〕 何 杰，汪万英，张世馥，等.金黄色葡萄球菌L型和人乳头瘤病毒与宫颈癌 关系的研究〔J〕.中国微生态学杂志，1996，8(1)∶10.
收稿日期：1999-10-21, http://www.100md.com