三苯氧胺对人结肠癌细胞增殖的影响及其机理的探讨
作者：黄兴兰 吴浩 陈斌 张正
单位：华西医科大学附属第一医院消化内科 成都 610041
关键词：三苯氧胺；结肠癌；胞内游离钙离子
华西医学000317摘要：目的：探讨三苯氧胺(TAM)对人结肠癌细胞增殖的影响及其机理。方法：采用钙离子荧光指示剂flour-3/Am，流式细胞仪动态检测TAM作用后人结肠癌细胞内游离钙离子([Ca2+]i)水平的变化，同时用MTT比色法测定细胞增殖情况。结果：①TAM使细胞内[Ca2+]i水平在1分钟内上升，以后维持在一个较高水平(349.97nM)，与静息状态细胞内[Ca2+]i水平(107.88nM)相比有显著性差异(P<0.05)。②TAM对癌细胞的增殖有抑制作用，其浓度与细胞增殖率呈显著性相关(r＝-0.957，P<0.05)。结论：TAM有抑制人结肠癌细胞增殖的作用，其作用机理除通过竞争性结合雌激素受体来抑制雌激素的作用外，还可通过诱导细胞内[Ca2+]i水平升高，抑制Ca2+依赖蛋白激酶C和钙调蛋白，从而抑制癌细胞的生长。
, 百拇医药
[中图分类号]R329.2+8；R735.3+5；R979.1 [文献标识码]A
[文章编号]1002-0179(2000)03-0303-03
Studies of the Effect and Mechanism of Tamoxifen on the Proliferation of Human Colonic Cancer Cell Lines
HUANG Xing-Lan，WU Hao，CHEN Bin，et al.
(Department of Gastroenterology，the First University Hospital，West China University of Medical Sciences，Chengdu 610041.)
, http://www.100md.com
Abstract：Object：To study the effect and the mechanism of tamoxifen(TAM) on the proliferation of human colonic cancer cell lines.Methods：Flow cytometry was used to continuously monitor the change of the intracellular free calcium [Ca2+]i with calcium fluoresence indicator (fluo-3/Am)，meanwhile the MTT colorimetry was used to detect proliferation of human colonic cancer cell lines(HT-29cell).Results：Firstly，TAM made the intracellular[Ca2+]i concentrations maintained a higher level (394.97 nM) and was much higher than that of the intracellulay [Ca2+]i of static status cells(107.88nM).There was statistically difference between 349.97 nM and 107.88nM (P<0.05).Secondly，TAM had the effect on inhibiting the proliferation of HT-29 cells.There was a significant negative correlation between the cell proliferation rate and the concentrations of TAM(r＝-0.975，P<0.05).Conclusion：TAM can inhibit proliferation of human colonic cancer cells.The mechanisms of TAM are that it can competitively combine the estrogen receptor and increase the intracellular calcium level to inhibit the activity of the Ca2+-dependent protein kinase C and calmodulin and inhibit proliferation of cancer cells finally.
, 百拇医药
Key words：Tamoxifen；Colonic cancer；Intracellular free calcium
三苯氧胺是三苯乙烯非甾体抗雌激素类药物的典型代表，是60年代研制、现临床广泛使用的抗癌药，主要治疗乳腺癌。近来发现部分胃肠道等非性激素靶器官肿瘤细胞中存在雌激素受体(ER)，并证实这些受体具有生物活性，雌激素可促ER(+)的胃肠道肿瘤的生长〔1〕，因而雌激素受体拮抗剂三苯氧胺是否可用于胃肠道肿瘤的治疗目前还无定论。本试验用TAM 作用于HT-29人结肠癌细胞株，用流式细胞仪动态检测细胞内[Ca2+]i水平，同时用MTT 比色法测定细胞增殖，探讨TAM对细胞增殖的影响及其机理，为TAM治疗胃肠道肿瘤提供实验室依据。
表1.TAM对癌细胞内[Ca2+]i影响的结果 时间(秒)
0
, 百拇医药
10
30
60
90
120
150
180
TAM
107.88
323.16
319.1
357.40
, 百拇医药
331.43
385.28
380.49
352.94
349.97
(4mcg/L)
Control
116.34
118.14
118.14
131.60
127.04
, 百拇医药
136.24
143.36
122.12
126.62
与静息状态胞内[Ca2+]i对照组相比有显著性差异(P<0.05)
1 材料与方法
1.1 材料 HT-29人结肠癌细胞系从湖南医科大学肿瘤研究所引种，由我院内科实验室传代培养；TAM购自上海华联制药有限公司；MTT购自华美公司；fluor-3/Am购自Sigma公司；流式细胞仪系美国COULER公司产品，酶联检测仪(Bio-Rad550型，美国)。
1.2 方法
, 百拇医药 1.2.1 TAM 用PBS液溶解、过滤、稀释至工作浓度；小牛血清用活性碳10g/L、葡聚糖T70lg/L，50℃搅拌30分钟，以清除游离雌激素。
1.2.2 MTT法测定细胞增殖率 采用96孔培养板，HT-29细胞(3×103个/孔)于含10%小牛血清的1640培养液中，培养24小时后换为无小牛血清1640及不同浓度药物各0.1ml：①空白组不含细胞。②对照组不加受试药。③TAM组：TAM浓度分别为1～4mCg/L。培养24小时，去上清，加MTT50μg培养4小时，去上清，加DMS150μl，摇动10分钟，在酶联检测仪上，以570nm波长，测定各孔OD值。上述各组均行2孔培养测定，取均值按下述公式〔2〕计算细胞生长抑制率和增殖率。
增殖率＝(1-抑制率)×100%
, 百拇医药
1.2.3 流式细胞仪测细胞[Ca2+]i浓度
1.2.3.1 细胞悬液的制备 HT-29细胞在含10%小牛血清1640培养液中培养72小时，实验前换为无血清1640培养液继续培养24小时，用0.25%胰蛋白酶及0.02%EDTA消化后制成单细胞悬液，细胞浓度为107个/ml左右。
1.2.3.2 荧光剂负载 在制备好的细胞悬液中加入flour-3/Am，以10μM浓度，37℃孵育20分钟后，用1640培养液稀释5倍，37℃再孵育40分钟。
1.2.3.3 胞外荧光剂的洗脱 为防止胞外fluon-3/Am对检测的干扰，孵育后用平衡盐溶液冲洗3次，最后用平衡盐溶液制成细胞悬液，细胞浓度为106个/ml，37℃水浴10分钟备用。
1.2.3.4 测定细胞内钙 用流式细胞仪进行荧光值测定(仪器系数：激发光波长505nm，发射光波长525nm)，每次加受试药前用半分钟测定静息状态的荧光值，加受试药(TAM 4mCg/L)后继续监测3分钟，整个过程在37℃恒温下进行。
, 百拇医药
1.2.3.5 细胞内[Ca2+]i按下列公式计算：
(Kd代表解离常数，文献报道为400nm〔3〕。Fmax代表最大荧光值，其值由样品中加入钙离子载体A23187(10-5mol/L)获得。Fmin代表最小荧光值，由Hesketh等提供的方法获得〔4，5〕。
1.2.4 统计学处理 实验数据以平均值()表示，多组均数的显著性检验用F分析和Q检验；药物作用与药物浓度的关系采用直线相关分析。
2 结果
2.1 TAM对 HT-29人结肠癌细胞内[Ca2+]i影响的结果 在静息状态下，胞内[Ca2+]i浓度平均为107.88nM，TAM作用后，HT-29细胞内[Ca2+]i水平在1分钟内上升，其后维持在一个较高水平，其平均浓度为349.97nM，与静息状态胞内[Ca2+]i水平相比有显著性差异(P<0.05)(见表1)。
, http://www.100md.com
2.2 TAM对细胞增殖影响的结果 TAM对人结肠癌细胞有抑制作用，其浓度与细胞增殖率呈显著性负相关(r＝-0.957，P<0.05)。(见表2)
表2.不同浓度TAM对癌细胞增殖
影响的结果 药物浓度
光密度值
增长率
(4mCg/L)
control
0.137
1
0.13
0.81
, 百拇医药
2
0.127
0.73
3
0.11
0.27
4
0.107
0.19
注：TAM浓度与细胞增殖率呈显著性负相关(r＝-0.957，P<0.05)
3 讨论
结肠癌是常见的消化道肿瘤，对传统的治疗效果差。近年来的研究发现一些胃肠肿瘤细胞中存在雌激素受体，且这些受体具有生物活性，认为胃肠道肿瘤是雌激素依赖性肿瘤，提出对于晚期雌激素受体阳性的肠道肿瘤患者可给予内分泌治疗，但疗效各家报道不一。Kitaota等〔6〕的研究发现雌激素受体阳性的胃癌患者采用雌激素受体拮抗剂三苯氧胺治疗后，其5年生存明显高于未服药者。但Harrison等〔7〕报道应用雌激素受体拮抗剂未能有效抑制肿瘤的生长，改善愈后，延长生存期。 国内学者〔8〕观察了雌激素及三苯氧胺对胃癌细胞增殖的影响，发现雌激素有促胃癌细胞增殖作用，而三苯氧胺可部分抑制雌激素对胃癌细胞生长的刺激作用。本实验也发现三苯氧胺对人结肠癌细胞有抑制作用，其浓度与细胞增殖率呈显著性负相关(r＝-0.957，P<0.05)。本实验还观察了三苯氧胺对人结肠癌细胞内游离钙离子浓度的影响，发现三苯氧胺作用后，HT-29人结肠癌细胞内[Ca2+]i水平在1分钟内上升，以后维持在一较高水平，其平均浓度为349.97nM，较静息状态细胞内[Ca2+]i水平相比有显著性差异(P<0.05)。钙离子作为一种重要的胞内信使，参与了细胞内多种功能的调节，胞内钙离子水平改变与细胞增殖间的关系被愈来愈多的学者关注。Jain等〔9〕用10-5mol/L或更高浓度的三苯氧胺处理乳腺癌细胞系MCF-7细胞3天，细胞内钙离子浓度缓慢升高。三苯氧胺诱导钙离子浓度升高先于细胞内空泡形成，空泡消失后，细胞死亡，但约有10%细胞继续存活一段时间，但形态退化，最后死亡。当三苯氧胺浓度10-6mol/L作用3天后，细胞内钙离子浓度下降，但不引起细胞死亡，说明三苯氧胺对胞内钙离子的调节作用具有双重性，抑制或诱导钙离子的产生，这种作用取决于三苯氧胺的浓度，高浓度的三苯氧胺诱导钙离子升高，与我们的实验应用高浓度三苯氧胺的作用结果一致。有报道〔9〕认为，三苯氧胺浓度>10-8mol/L时，其抗肿瘤作用除通过竞争性结合雌激素受体来抑制雌激素作用外，部分是通过抑制钙离子依赖蛋白激酶C来执行细胞毒性和抑制细胞生长的功能，而蛋白激酶C和钙调蛋白都是重要的促肿瘤细胞生长因子，它们的生物学活性均部分依赖于钙离子的下调，而其钙离子下调也影响雌激素受体的活性。钙通道拮抗剂异搏定可以恢复<10-8mol/L三苯氧胺对乳腺癌细胞雌激素受体的抑制作用，而钙调蛋白拮抗剂能够抑制许多肿瘤细胞生长，通过改变蛋白的结构，抑制磷酸二脂酶的活性和cAMP的功能，从而影响钙离子通道活性，导致钙离子水平失调，最终影响细胞生长。因此我们认为高浓度的三苯氧胺在体外有抑制结肠癌细胞增殖的作用，其作用机理除通过竞争性结合雌激素受体抑制雌激素作用外，部分还可能通过诱导胞内钙离子升高，抑制钙离子依赖蛋白激酶C和钙调蛋白，从而抑制细胞生长。临床上三苯氧胺的抗结肠肿瘤作用还待进一步探索。
, 百拇医药
参考文献
1，谭端军，汪鸿志：雌激素受体的特征及与胃肠道肿瘤的关系。临床消化病杂志1996；8(2)：71。
2，温汉平，王小宁，孙华蕴，等：肿瘤细胞体外药敏试验MTT分析法。中华肿瘤杂志1993；15(6)：470。
3，Minte A，Kao Joseph P.Y and Tsien R.Y.Fluorescent indicators for cytosolic calcium based an rhodamine and fluorescein chromophores.J Biol Chem.1989；264：8171.
4，Vandenberghe P.A and Ceuppens J.L.Flow cytometric measurement of cytoplasmic free calcium in human peripheral blood T lymphocytes with fluor-3，a new fluorescent calcium indicater.Journal of lmmunological Methods.1990；127～197.
, 百拇医药
5，Hesketh TR.Free cytoplasmic calcium concentration and the mitogenic stimulation of lymphocytoes.J Biol Chem.1983；258：4876.
6，Kitaota Sex dependence in diffuse carcinoma of the stomach and results of chemoendocrine therapy.Gan No Rinsho.1984；6：741.
7，Harrison JD.A randomized，controlled study of adjuvant tamoxifen in the treatment of gastric carcinoma.Br.J Surg.1987；74(12)：1143.
8，谭端军，等：E3及TAM对胃癌细胞增殖的影响。新消化病杂志 1996；4(2)：64～65。
9，王俊杰，申文江：三苯氧胺抗肿瘤的分子生物学机制。国外医学肿瘤分册1997；(6)：335。
(收稿日期：2000-01-16), 百拇医药
单位：华西医科大学附属第一医院消化内科 成都 610041
关键词：三苯氧胺；结肠癌；胞内游离钙离子
华西医学000317摘要：目的：探讨三苯氧胺(TAM)对人结肠癌细胞增殖的影响及其机理。方法：采用钙离子荧光指示剂flour-3/Am，流式细胞仪动态检测TAM作用后人结肠癌细胞内游离钙离子([Ca2+]i)水平的变化，同时用MTT比色法测定细胞增殖情况。结果：①TAM使细胞内[Ca2+]i水平在1分钟内上升，以后维持在一个较高水平(349.97nM)，与静息状态细胞内[Ca2+]i水平(107.88nM)相比有显著性差异(P<0.05)。②TAM对癌细胞的增殖有抑制作用，其浓度与细胞增殖率呈显著性相关(r＝-0.957，P<0.05)。结论：TAM有抑制人结肠癌细胞增殖的作用，其作用机理除通过竞争性结合雌激素受体来抑制雌激素的作用外，还可通过诱导细胞内[Ca2+]i水平升高，抑制Ca2+依赖蛋白激酶C和钙调蛋白，从而抑制癌细胞的生长。
, 百拇医药
[中图分类号]R329.2+8；R735.3+5；R979.1 [文献标识码]A
[文章编号]1002-0179(2000)03-0303-03
Studies of the Effect and Mechanism of Tamoxifen on the Proliferation of Human Colonic Cancer Cell Lines
HUANG Xing-Lan，WU Hao，CHEN Bin，et al.
(Department of Gastroenterology，the First University Hospital，West China University of Medical Sciences，Chengdu 610041.)
, http://www.100md.com
Abstract：Object：To study the effect and the mechanism of tamoxifen(TAM) on the proliferation of human colonic cancer cell lines.Methods：Flow cytometry was used to continuously monitor the change of the intracellular free calcium [Ca2+]i with calcium fluoresence indicator (fluo-3/Am)，meanwhile the MTT colorimetry was used to detect proliferation of human colonic cancer cell lines(HT-29cell).Results：Firstly，TAM made the intracellular[Ca2+]i concentrations maintained a higher level (394.97 nM) and was much higher than that of the intracellulay [Ca2+]i of static status cells(107.88nM).There was statistically difference between 349.97 nM and 107.88nM (P<0.05).Secondly，TAM had the effect on inhibiting the proliferation of HT-29 cells.There was a significant negative correlation between the cell proliferation rate and the concentrations of TAM(r＝-0.975，P<0.05).Conclusion：TAM can inhibit proliferation of human colonic cancer cells.The mechanisms of TAM are that it can competitively combine the estrogen receptor and increase the intracellular calcium level to inhibit the activity of the Ca2+-dependent protein kinase C and calmodulin and inhibit proliferation of cancer cells finally.
, 百拇医药
Key words：Tamoxifen；Colonic cancer；Intracellular free calcium
三苯氧胺是三苯乙烯非甾体抗雌激素类药物的典型代表，是60年代研制、现临床广泛使用的抗癌药，主要治疗乳腺癌。近来发现部分胃肠道等非性激素靶器官肿瘤细胞中存在雌激素受体(ER)，并证实这些受体具有生物活性，雌激素可促ER(+)的胃肠道肿瘤的生长〔1〕，因而雌激素受体拮抗剂三苯氧胺是否可用于胃肠道肿瘤的治疗目前还无定论。本试验用TAM 作用于HT-29人结肠癌细胞株，用流式细胞仪动态检测细胞内[Ca2+]i水平，同时用MTT 比色法测定细胞增殖，探讨TAM对细胞增殖的影响及其机理，为TAM治疗胃肠道肿瘤提供实验室依据。
表1.TAM对癌细胞内[Ca2+]i影响的结果 时间(秒)
0
, 百拇医药
10
30
60
90
120
150
180
TAM
107.88
323.16
319.1
357.40
, 百拇医药
331.43
385.28
380.49
352.94
349.97
(4mcg/L)
Control
116.34
118.14
118.14
131.60
127.04
, 百拇医药
136.24
143.36
122.12
126.62
与静息状态胞内[Ca2+]i对照组相比有显著性差异(P<0.05)
1 材料与方法
1.1 材料 HT-29人结肠癌细胞系从湖南医科大学肿瘤研究所引种，由我院内科实验室传代培养；TAM购自上海华联制药有限公司；MTT购自华美公司；fluor-3/Am购自Sigma公司；流式细胞仪系美国COULER公司产品，酶联检测仪(Bio-Rad550型，美国)。
1.2 方法
, 百拇医药 1.2.1 TAM 用PBS液溶解、过滤、稀释至工作浓度；小牛血清用活性碳10g/L、葡聚糖T70lg/L，50℃搅拌30分钟，以清除游离雌激素。
1.2.2 MTT法测定细胞增殖率 采用96孔培养板，HT-29细胞(3×103个/孔)于含10%小牛血清的1640培养液中，培养24小时后换为无小牛血清1640及不同浓度药物各0.1ml：①空白组不含细胞。②对照组不加受试药。③TAM组：TAM浓度分别为1～4mCg/L。培养24小时，去上清，加MTT50μg培养4小时，去上清，加DMS150μl，摇动10分钟，在酶联检测仪上，以570nm波长，测定各孔OD值。上述各组均行2孔培养测定，取均值按下述公式〔2〕计算细胞生长抑制率和增殖率。
增殖率＝(1-抑制率)×100%
, 百拇医药
1.2.3 流式细胞仪测细胞[Ca2+]i浓度
1.2.3.1 细胞悬液的制备 HT-29细胞在含10%小牛血清1640培养液中培养72小时，实验前换为无血清1640培养液继续培养24小时，用0.25%胰蛋白酶及0.02%EDTA消化后制成单细胞悬液，细胞浓度为107个/ml左右。
1.2.3.2 荧光剂负载 在制备好的细胞悬液中加入flour-3/Am，以10μM浓度，37℃孵育20分钟后，用1640培养液稀释5倍，37℃再孵育40分钟。
1.2.3.3 胞外荧光剂的洗脱 为防止胞外fluon-3/Am对检测的干扰，孵育后用平衡盐溶液冲洗3次，最后用平衡盐溶液制成细胞悬液，细胞浓度为106个/ml，37℃水浴10分钟备用。
1.2.3.4 测定细胞内钙 用流式细胞仪进行荧光值测定(仪器系数：激发光波长505nm，发射光波长525nm)，每次加受试药前用半分钟测定静息状态的荧光值，加受试药(TAM 4mCg/L)后继续监测3分钟，整个过程在37℃恒温下进行。
, 百拇医药
1.2.3.5 细胞内[Ca2+]i按下列公式计算：
(Kd代表解离常数，文献报道为400nm〔3〕。Fmax代表最大荧光值，其值由样品中加入钙离子载体A23187(10-5mol/L)获得。Fmin代表最小荧光值，由Hesketh等提供的方法获得〔4，5〕。
1.2.4 统计学处理 实验数据以平均值(
)表示，多组均数的显著性检验用F分析和Q检验；药物作用与药物浓度的关系采用直线相关分析。2 结果
2.1 TAM对 HT-29人结肠癌细胞内[Ca2+]i影响的结果 在静息状态下，胞内[Ca2+]i浓度平均为107.88nM，TAM作用后，HT-29细胞内[Ca2+]i水平在1分钟内上升，其后维持在一个较高水平，其平均浓度为349.97nM，与静息状态胞内[Ca2+]i水平相比有显著性差异(P<0.05)(见表1)。
, http://www.100md.com
2.2 TAM对细胞增殖影响的结果 TAM对人结肠癌细胞有抑制作用，其浓度与细胞增殖率呈显著性负相关(r＝-0.957，P<0.05)。(见表2)
表2.不同浓度TAM对癌细胞增殖
影响的结果 药物浓度
光密度值
增长率
(4mCg/L)
control
0.137
1
0.13
0.81
, 百拇医药
2
0.127
0.73
3
0.11
0.27
4
0.107
0.19
注：TAM浓度与细胞增殖率呈显著性负相关(r＝-0.957，P<0.05)
3 讨论
结肠癌是常见的消化道肿瘤，对传统的治疗效果差。近年来的研究发现一些胃肠肿瘤细胞中存在雌激素受体，且这些受体具有生物活性，认为胃肠道肿瘤是雌激素依赖性肿瘤，提出对于晚期雌激素受体阳性的肠道肿瘤患者可给予内分泌治疗，但疗效各家报道不一。Kitaota等〔6〕的研究发现雌激素受体阳性的胃癌患者采用雌激素受体拮抗剂三苯氧胺治疗后，其5年生存明显高于未服药者。但Harrison等〔7〕报道应用雌激素受体拮抗剂未能有效抑制肿瘤的生长，改善愈后，延长生存期。 国内学者〔8〕观察了雌激素及三苯氧胺对胃癌细胞增殖的影响，发现雌激素有促胃癌细胞增殖作用，而三苯氧胺可部分抑制雌激素对胃癌细胞生长的刺激作用。本实验也发现三苯氧胺对人结肠癌细胞有抑制作用，其浓度与细胞增殖率呈显著性负相关(r＝-0.957，P<0.05)。本实验还观察了三苯氧胺对人结肠癌细胞内游离钙离子浓度的影响，发现三苯氧胺作用后，HT-29人结肠癌细胞内[Ca2+]i水平在1分钟内上升，以后维持在一较高水平，其平均浓度为349.97nM，较静息状态细胞内[Ca2+]i水平相比有显著性差异(P<0.05)。钙离子作为一种重要的胞内信使，参与了细胞内多种功能的调节，胞内钙离子水平改变与细胞增殖间的关系被愈来愈多的学者关注。Jain等〔9〕用10-5mol/L或更高浓度的三苯氧胺处理乳腺癌细胞系MCF-7细胞3天，细胞内钙离子浓度缓慢升高。三苯氧胺诱导钙离子浓度升高先于细胞内空泡形成，空泡消失后，细胞死亡，但约有10%细胞继续存活一段时间，但形态退化，最后死亡。当三苯氧胺浓度10-6mol/L作用3天后，细胞内钙离子浓度下降，但不引起细胞死亡，说明三苯氧胺对胞内钙离子的调节作用具有双重性，抑制或诱导钙离子的产生，这种作用取决于三苯氧胺的浓度，高浓度的三苯氧胺诱导钙离子升高，与我们的实验应用高浓度三苯氧胺的作用结果一致。有报道〔9〕认为，三苯氧胺浓度>10-8mol/L时，其抗肿瘤作用除通过竞争性结合雌激素受体来抑制雌激素作用外，部分是通过抑制钙离子依赖蛋白激酶C来执行细胞毒性和抑制细胞生长的功能，而蛋白激酶C和钙调蛋白都是重要的促肿瘤细胞生长因子，它们的生物学活性均部分依赖于钙离子的下调，而其钙离子下调也影响雌激素受体的活性。钙通道拮抗剂异搏定可以恢复<10-8mol/L三苯氧胺对乳腺癌细胞雌激素受体的抑制作用，而钙调蛋白拮抗剂能够抑制许多肿瘤细胞生长，通过改变蛋白的结构，抑制磷酸二脂酶的活性和cAMP的功能，从而影响钙离子通道活性，导致钙离子水平失调，最终影响细胞生长。因此我们认为高浓度的三苯氧胺在体外有抑制结肠癌细胞增殖的作用，其作用机理除通过竞争性结合雌激素受体抑制雌激素作用外，部分还可能通过诱导胞内钙离子升高，抑制钙离子依赖蛋白激酶C和钙调蛋白，从而抑制细胞生长。临床上三苯氧胺的抗结肠肿瘤作用还待进一步探索。
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参考文献
1，谭端军，汪鸿志：雌激素受体的特征及与胃肠道肿瘤的关系。临床消化病杂志1996；8(2)：71。
2，温汉平，王小宁，孙华蕴，等：肿瘤细胞体外药敏试验MTT分析法。中华肿瘤杂志1993；15(6)：470。
3，Minte A，Kao Joseph P.Y and Tsien R.Y.Fluorescent indicators for cytosolic calcium based an rhodamine and fluorescein chromophores.J Biol Chem.1989；264：8171.
4，Vandenberghe P.A and Ceuppens J.L.Flow cytometric measurement of cytoplasmic free calcium in human peripheral blood T lymphocytes with fluor-3，a new fluorescent calcium indicater.Journal of lmmunological Methods.1990；127～197.
, 百拇医药
5，Hesketh TR.Free cytoplasmic calcium concentration and the mitogenic stimulation of lymphocytoes.J Biol Chem.1983；258：4876.
6，Kitaota Sex dependence in diffuse carcinoma of the stomach and results of chemoendocrine therapy.Gan No Rinsho.1984；6：741.
7，Harrison JD.A randomized，controlled study of adjuvant tamoxifen in the treatment of gastric carcinoma.Br.J Surg.1987；74(12)：1143.
8，谭端军，等：E3及TAM对胃癌细胞增殖的影响。新消化病杂志 1996；4(2)：64～65。
9，王俊杰，申文江：三苯氧胺抗肿瘤的分子生物学机制。国外医学肿瘤分册1997；(6)：335。
(收稿日期：2000-01-16), 百拇医药