皮肤培养的研究进展
作者：谭谦 周宏
单位：(南京铁道医学院附属医院整形烧伤外科，南京 210009)
关键词：皮肤培养；角朊细胞；细胞因子；创面修复
铁道医学000301 [摘要]介绍了皮肤培养的原理、新技术、传递系统、细胞因子及临床应用的最新进展。
[中图分类号]Q813.1+1 [文献标识码]C
[文章编号]1001-0912(2000)03-0143-03
皮肤是人体最大的器官，大面积深度烧伤的创面、广泛瘢痕切除后、外伤性皮肤缺损、皮肤溃疡及色素改变等都需要足够的皮肤进行修复。临床上常用的修复方法有自体游离皮片移植、皮瓣移植术以及异体皮(异种皮)移植术和人工替代物覆盖等方法。大面积烧伤患者缺乏足够的自体皮片，异体皮(异种皮)最终仍因免疫排斥反应而需再度植皮。怎样才能解决这个问题呢？1975年，Rheinwald 与Green 首次提出了表皮细胞培养技术[1]。20多年来，随着现代细胞分子生物学和组织工程学的迅猛发展，细胞培养的理论日趋完善，随之细胞培养的研究和应用也进入了新的阶段。
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1 培养原理与方法
1.1 培养原理 皮肤培养是指应用组织工程学的方法，在体外培养高浓度的角朊F细胞，然后在可被人体逐步降解吸收的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)构成的三维支架上培养扩增角朊细胞，然后将这种角朊细胞-ECM生物复合体种植于创面，ECM逐渐降解，角朊细胞继续增殖，达到修复创面、重建功能的目的。
1.2 体外(in vitro)培养 体外培养的方法主要有二类：一是浸没式培养。浸没式培养又分为细胞悬液培养法和组织块培养法。由Rheinwald与Green发明的经典的细胞悬液培养法，即取材后用胰蛋白酶分解成单个角朊细胞，然后接种至含有经致死剂量照射的3T3.J2细胞的培养皿中，加入含有血清的培养液，放37℃体积分数为5%的CO2培养箱中原代培养10～12d，获得细胞再作次代培养[1]。而组织块培养法，即取材处理后用利剪剪至小于1mm3，培养方法基本同上法。另一是气液面培养法，即将浸没式培养后的角朊细胞转移到玻璃纤维厚膜垫之上，使其浮于含15%胎牛血清的培养液表面，培养14d，接触空气面角化后更加符合皮肤结构，水渗透屏障功能较好[2]。
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1.3 体内(in vivo)培养 获得角朊细胞后种植于传递系统(用于支持、转移角朊细胞的膜片)，再将传递系统应用于创面，使角朊细胞在创面上生长，以达到封闭创面的目的[3]。与体外培养的区别是后者培养成连续的膜片后应用于创面。
2 角朊细胞传递系统
角朊细胞传递系统是种植、支持、转运角朊细胞的三维支架，它既是角朊细胞的附着场所，又是良好的创面覆盖物，要求理化性能良好、能被降解吸收、无抗原性、价格低廉、柔韧耐用、隔离病菌、能防止水分丢失、便于手术应用、生产制备方便、易消毒、易贮存[4]。因此传递系统的研究开发一直是细胞培养的重要方面。
2.1 3T3细胞 经致死剂量照射的3T3细胞源自小鼠胚胎瘤的成纤维细胞株，作为培养表皮细胞的滋养层，能促进表皮细胞的贴附和生长，并具有接触性抑制成纤维细胞生长的功能。
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2.2 聚乌拉坦 聚乌拉坦(polyurethane，聚氨基甲酸乙酯)具有对气体和水蒸气有较大通透性、顺应性好、能维持伤口湿润等特点，应用较多。Duinslaege在大面积烧伤治疗的单盲随机研究中发现，单纯应用聚乌拉坦创面愈合平均需13.6d，而联合应用培养的角朊细胞则为6.7d，且渗出明显减少，疼痛明显减轻[5]。
2.3 透明质酸 透明质酸是ECM中含有的一种氨基葡聚糖。在创面愈合过程中，透明质酸能促进表皮移行和分化，改善血管生成，加强胶原产生。透明质酸经化学修饰后，理化性质改变，但生物学性能与原来相似。Hyaff-NW是透明质酸的苯甲酯化衍生物，先将其处理成纤维，再制备为膜片，它在应用前先在反面种植成纤维细胞。Laserskin是将该膜片激光打孔以使种植上的角朊细胞能从创面获得营养。Harris在一位80%重度烧伤患者取皮片作自体角朊细胞、成纤维细胞培养，早
期切痂后用异体皮或Hyaff.NW覆盖，14d后擦去异体皮种植Laserskin3000cm2，24d后发现异体皮和Laserskin 80%部位被覆盖，Hyaff.NW和Laserskin全部覆盖。病理检查显示真皮和表皮连接处交错连续如正常皮肤一样，7周后创面痊愈，无明显瘢痕[6]。
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2.4 纤维蛋白胶 Jiao采用了新的角朊细胞支持物，把角朊细胞混悬于纤维蛋白胶中，移植到创面后角朊细胞在纤维蛋白网格中形成小块状或组织严密的细胞团。7d后新生表皮扩展变厚角质化，10d后创面完全表皮化。这里纤维蛋白胶不仅提供了简易有效并能使角朊细胞高度增殖的场所，而且提供了角朊细胞移植的良好介质[7]。Meana等从冻存的血浆中获得纤维蛋白原，每单位(200ml)血可获得50～300mg纤维蛋白原，溶解后加入含血清培养基、培养的成纤维细胞、牛抑肽酶、牛凝血酶、CaCl2等，置于培养皿中37℃加热凝集成纤维蛋白-成纤维细胞凝胶，用它来取代3T3细胞作角朊细胞的培养[8]。
2.5 脱细胞真皮 采用理化方法去除异体或异种真皮中的细胞成分，可降低免疫原性，使移植物延长或永久成活。Matouskova等创造了一种称为“翻转法(upside down)”的新技术，采用去细胞的猪真皮作为细胞移植支架，将培养的角朊细胞种植到重建人或猪皮(recombined human/pig skin，RHPS)上后，角朊细胞层直接接触创面，而RHPS置于外层起机械保护作用，临床有效率93%以上(59/63)[9]。
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3 培养环境
角朊细胞培养环境主要指培养液，其中添加剂、Ca2+浓度、血清含量、温度、湿度、CO2浓度及pH值对培养起着重要作用。添加剂如营养物质、激素及生长因子可影响表皮增殖、生长和代谢。一般常用的添加剂有腺嘌呤、表皮生长因子、霍乱毒素、胰岛素、甲状腺素、氢化可的松等。Duinslaeger等用自体网状皮片与培养的角朊细胞联合移植治疗三度烧伤创面，实验室结果显示培养的角朊细胞的分泌物可抑制胶原网格的收缩[10]。氨基酸、必需脂肪酸、葡萄糖的水平也影响角朊细胞生长速度。其他如培养基有无滋养层细胞，培养基中的成纤维细胞比例，培养液中有无血清，添加剂的厂家、批号，以及培养液的更换频率等都影响培养的效果，这些都需要进一步研究。
4 角朊细胞供皮区
人体任何部位皮肤均可消化分离出角朊细胞，但培养和移植后的效果有所不同。一般以包皮外板、躯干四肢伸侧的皮肤较佳，因为这些部位表皮丁突较多且长，基底细胞所占比例相对较多。Kumagai研究发现在36例肤色不同、部位各异的烧伤瘢痕治疗中，将瘢痕去除后在其上种植培养的角朊细胞，角朊细胞的供皮区分别为臀部(8例)、足底(6例)、瘢痕周边部位(24例)。2年后随访发现采用瘢痕周边部位供皮效果最佳，肤色接近周围正常皮肤，皮肤张力几乎恢复正常。因此，提出了一个角朊细胞供皮区选择原则──“就近原则(closer is best)”[11]。
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5 细胞因子
角朊细胞是表皮的主要组成细胞，具有强烈的生长、增殖、分化能力，角朊细胞本身有许多细胞因子受体，通过自分泌(autocrine)或旁分泌(paracrine)起作用。这些细胞因子和生长因子为表皮生长因子(EGF)、血小板衍生因子(PDGF)、转移生长因子(TGF)、白介素(IL)、干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)等[10]。
1997年10月在汉诺威召开的欧洲科学家与整形外科医师会议(ECSAPS)上报道，深二度创面用培养的角朊细胞异体移植后，角朊细胞分泌细胞因子和生长因子，促使创面残留的毛囊上皮细胞增殖形成新上皮。他们用培养的角朊细胞加石蜡纱布在猪模型上进行实验，穿刺活检发现再表皮化，48h后用组蛋白原位杂交发现 S期角朊细胞，毛囊外根鞘S期细胞比例也增多。因此，培养的角朊细胞异体移植可以刺激自身残余毛囊上皮增殖[12]。
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Stoll发现在皮肤创面治疗时，双向调节蛋白、肝素结合的表皮生长因子(HB-EGF)、血管通透因子、角蛋白-6的转录发生上调。高EGF受体专一性酪氨酸激酶抑制剂PD153035和抗EGF受体的单克隆抗体225IgG，可强烈抑制上述4种因子转录的诱导，但对角朊细胞无毒性作用。因此角朊细胞产生的肝素结合配体是皮肤创面愈合信号扩大与转移的重要机制[13]。Eming在脱细胞真皮上种植经基因修饰过的角朊细胞，发现角朊细胞分泌 PDGF-A，创面挛缩明显受到抑制，因此PDGF-A在培养的角朊细胞移植后第1周时过度表达能改善移植行为[14]。
6 存在问题与前景展望
培养的角朊细胞自体移植创面治疗存在的首要问题就是培养时间长(3～5周)，因而采取培养的角朊细胞异体移植可以有效地解决时间问题。培养表皮移植的失败大多归因于感染。与异体植皮技术不同，培养的角朊细胞不会被排斥。因为发生免疫排斥反应的主要原因是人表皮中的HLA-DR(+)和CD-1a(+)的Langerhans细胞，经过体外原代、次代培养后，Langerhans细胞几乎全都消失，培养的角朊细胞不会刺激异体淋巴细胞增殖[15]。Hultman 和Hunt 在大鼠试验中，采用去除角朊细胞的免疫原性，称为主要组织相容性复合物“敲除”(MHC knockout)技术，主要是去除MHC.Ⅱ类抗原，培养后用于全厚创面，发现存活时间比对照组有显著延长，培养的角朊细胞联合“敲除”技术可为重度烧伤创面提供低免疫原性的覆盖物[16]。
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为了确定培养的角朊细胞异体移植后的影响，可采取以下几种方法进行检测：(1)血型标志物；(2)DNA指纹图谱；(3)PCR-RFLP；(4)HLA基因位点分析；(5)PCR扩增染色体特异性DNA片断；(6)Brd U标记角朊细胞；(7)异性的角朊细胞用免疫组化和荧光标记原位杂交检测Y染色体等；均有助于角朊细胞异体移植后的转归及免疫研究。但仍需要解决或进一步完善:(1)角朊细胞自体移植如何缩短培养时间；(2)移植免疫机理及对将来的影响，培养的角朊细胞自体或异体移植后某些成分对机体免疫是否会产生影响(如3T3细胞，异种真皮，……)；(3)在容易获得、使用方便、低抗原性、经济实用的前提下，在有机合成材料及生物工程材料方面继续寻找更好的传递系统；(4)目前国外培养的角朊细胞自体或异体移植患者平均住院日为(114±30)d，平均费用为每人98500美元，培养平均费用为每平方厘米16美元[17]，希望能找到更加经济的、适合我国国情的方法；(5)基因治疗，通过病毒转染等手段，对培养的角朊细胞加入EGF、PDGF、TGF等细胞因子基因，以促进创面愈合。
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培养的角朊细胞自体或异体移植可以早期覆盖烧伤创面，控制伤后瘢痕过度形成，防止多脏器功能衰竭的发生，在烧伤和整形外科领域中有着广泛的应用前景，是目前国内外医学领域的前沿学科，需要我们进一步加强基础学方面的研究和进行临床探索性试验。
[作者简介]谭谦(1964-)，男，安徽阜阳人，南京铁道医学院整形烧伤外科副主任医师，副教授，医学硕士。
[参考文献]
[1]Rheinwald J G,Green H.Serial cultivation of human epidermal keratinocytes:the formation of keratining colonies from single cells[J].Cell,1975,6:331-6.
[2]Pu Y, Bernstein I A, Bernstam LI, et al. Growing a stratified,cornified primary culture of rat keratinocytes with epidermis-like water permeation barrier function[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim,1995,31(4):283-7.
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[3]Harris P A,Leigh I M,Navasaria HA. Pre-confluent keratinocyte gra～fting: the future for cultured skin replacements[J]? Burns,1998，24:591-3.
[4]Sheridan R L,Tompkins R G.Skin substitutes in burns[J].Burns,1999，25:97-103.
[5]Duinslaege LAY,Verbeken G,Vanhalle S,et al.Cultured allogeneic ker～atinocytes sheets accelerate healing compared to Op-Site treatment of donor sites in burns[J].J Burn Care Rehabil，1997,18(6):545-51.
, 百拇医药
[6]Harris PA,di Francesco F,Barisoni D,et al.Use of hyaluronic acid and cultured autologous keratinocytes and fibroblasts in extensive burns[J].Lancet,1999,353(9146):35-6.
[7]Jiao X Y,Kopp J,Tanczos E,et al.Cultured keratinocytes suspended in fibrin glue to cover full thickness wounds on athymic nude mice: comparison of two brands of fibrin glue[J].Eur J Plast Surg,1998,21:72-6.
[8]Meana A,Iglesias J,Del Rio M,et al.Large surface of cultured human epithelium obtained on a dermal matrix based on live fibroblast-containing fibrin gels[J].Burns,1998，24:621-30.
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[9]Matouskova E,Bucek S,Vogtova D,et al.Treatment of burns and donor sites with human allogeneic keratinocytes grown on acellular pig dermis[J].Br J Dermatol，1997,136(6):901-7.
[10]Duinslaeger L,Delaey B, Vanderkelen A.Short-and long-term results of application of allogeneic cultured keratinocytes on burn wounds and burn scar[J].Eur J Plast Surg,1998,21:14-8.
[11]Kumagai N, Oshima H, Tanabe M,et al. Favorable donor site for epidermal cultivation for the treatment of burn scars with autologous cultured epithelium[J].Ann Plast Surg,1997,38(5):506-13.
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[13]Stoll S,Garner W,Elder J.Heparin-binding ligands mediate autocrine epidermal growth factor receptor activation in skin organ culture[J].J Clin Invest，1997,100(5):1271-81.
[14]Eming S A,Medalie D A,Tompkins R G,et al.Genetically modified human keratinocytes overexpressing PDGF-A enhance the performance of a composite skin graft[J].Hum Gene Ther，1998,9(4):529-39.
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[16]Hultman C S,Hunt J P,Yamamoto H,et al.Immunogenicity of cultured keratinocyte allografts deficient in major histocompatibility complex antigens[J].J Trauma，1998,45(1):25-34.
[17]Carsin H,Ainaud P,Le-Bever H,et al. Objectives,results and future prospects of burn treatment in 1997[J].Bull Acad Natl Med,1997,181(7):1307-20.
[收稿日期]1999-11-22, 百拇医药
单位：(南京铁道医学院附属医院整形烧伤外科，南京 210009)
关键词：皮肤培养；角朊细胞；细胞因子；创面修复
铁道医学000301 [摘要]介绍了皮肤培养的原理、新技术、传递系统、细胞因子及临床应用的最新进展。
[中图分类号]Q813.1+1 [文献标识码]C
[文章编号]1001-0912(2000)03-0143-03
皮肤是人体最大的器官，大面积深度烧伤的创面、广泛瘢痕切除后、外伤性皮肤缺损、皮肤溃疡及色素改变等都需要足够的皮肤进行修复。临床上常用的修复方法有自体游离皮片移植、皮瓣移植术以及异体皮(异种皮)移植术和人工替代物覆盖等方法。大面积烧伤患者缺乏足够的自体皮片，异体皮(异种皮)最终仍因免疫排斥反应而需再度植皮。怎样才能解决这个问题呢？1975年，Rheinwald 与Green 首次提出了表皮细胞培养技术[1]。20多年来，随着现代细胞分子生物学和组织工程学的迅猛发展，细胞培养的理论日趋完善，随之细胞培养的研究和应用也进入了新的阶段。
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1 培养原理与方法
1.1 培养原理 皮肤培养是指应用组织工程学的方法，在体外培养高浓度的角朊F细胞，然后在可被人体逐步降解吸收的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)构成的三维支架上培养扩增角朊细胞，然后将这种角朊细胞-ECM生物复合体种植于创面，ECM逐渐降解，角朊细胞继续增殖，达到修复创面、重建功能的目的。
1.2 体外(in vitro)培养 体外培养的方法主要有二类：一是浸没式培养。浸没式培养又分为细胞悬液培养法和组织块培养法。由Rheinwald与Green发明的经典的细胞悬液培养法，即取材后用胰蛋白酶分解成单个角朊细胞，然后接种至含有经致死剂量照射的3T3.J2细胞的培养皿中，加入含有血清的培养液，放37℃体积分数为5%的CO2培养箱中原代培养10～12d，获得细胞再作次代培养[1]。而组织块培养法，即取材处理后用利剪剪至小于1mm3，培养方法基本同上法。另一是气液面培养法，即将浸没式培养后的角朊细胞转移到玻璃纤维厚膜垫之上，使其浮于含15%胎牛血清的培养液表面，培养14d，接触空气面角化后更加符合皮肤结构，水渗透屏障功能较好[2]。
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1.3 体内(in vivo)培养 获得角朊细胞后种植于传递系统(用于支持、转移角朊细胞的膜片)，再将传递系统应用于创面，使角朊细胞在创面上生长，以达到封闭创面的目的[3]。与体外培养的区别是后者培养成连续的膜片后应用于创面。
2 角朊细胞传递系统
角朊细胞传递系统是种植、支持、转运角朊细胞的三维支架，它既是角朊细胞的附着场所，又是良好的创面覆盖物，要求理化性能良好、能被降解吸收、无抗原性、价格低廉、柔韧耐用、隔离病菌、能防止水分丢失、便于手术应用、生产制备方便、易消毒、易贮存[4]。因此传递系统的研究开发一直是细胞培养的重要方面。
2.1 3T3细胞 经致死剂量照射的3T3细胞源自小鼠胚胎瘤的成纤维细胞株，作为培养表皮细胞的滋养层，能促进表皮细胞的贴附和生长，并具有接触性抑制成纤维细胞生长的功能。
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2.2 聚乌拉坦 聚乌拉坦(polyurethane，聚氨基甲酸乙酯)具有对气体和水蒸气有较大通透性、顺应性好、能维持伤口湿润等特点，应用较多。Duinslaege在大面积烧伤治疗的单盲随机研究中发现，单纯应用聚乌拉坦创面愈合平均需13.6d，而联合应用培养的角朊细胞则为6.7d，且渗出明显减少，疼痛明显减轻[5]。
2.3 透明质酸 透明质酸是ECM中含有的一种氨基葡聚糖。在创面愈合过程中，透明质酸能促进表皮移行和分化，改善血管生成，加强胶原产生。透明质酸经化学修饰后，理化性质改变，但生物学性能与原来相似。Hyaff-NW是透明质酸的苯甲酯化衍生物，先将其处理成纤维，再制备为膜片，它在应用前先在反面种植成纤维细胞。Laserskin是将该膜片激光打孔以使种植上的角朊细胞能从创面获得营养。Harris在一位80%重度烧伤患者取皮片作自体角朊细胞、成纤维细胞培养，早
期切痂后用异体皮或Hyaff.NW覆盖，14d后擦去异体皮种植Laserskin3000cm2，24d后发现异体皮和Laserskin 80%部位被覆盖，Hyaff.NW和Laserskin全部覆盖。病理检查显示真皮和表皮连接处交错连续如正常皮肤一样，7周后创面痊愈，无明显瘢痕[6]。
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2.4 纤维蛋白胶 Jiao采用了新的角朊细胞支持物，把角朊细胞混悬于纤维蛋白胶中，移植到创面后角朊细胞在纤维蛋白网格中形成小块状或组织严密的细胞团。7d后新生表皮扩展变厚角质化，10d后创面完全表皮化。这里纤维蛋白胶不仅提供了简易有效并能使角朊细胞高度增殖的场所，而且提供了角朊细胞移植的良好介质[7]。Meana等从冻存的血浆中获得纤维蛋白原，每单位(200ml)血可获得50～300mg纤维蛋白原，溶解后加入含血清培养基、培养的成纤维细胞、牛抑肽酶、牛凝血酶、CaCl2等，置于培养皿中37℃加热凝集成纤维蛋白-成纤维细胞凝胶，用它来取代3T3细胞作角朊细胞的培养[8]。
2.5 脱细胞真皮 采用理化方法去除异体或异种真皮中的细胞成分，可降低免疫原性，使移植物延长或永久成活。Matouskova等创造了一种称为“翻转法(upside down)”的新技术，采用去细胞的猪真皮作为细胞移植支架，将培养的角朊细胞种植到重建人或猪皮(recombined human/pig skin，RHPS)上后，角朊细胞层直接接触创面，而RHPS置于外层起机械保护作用，临床有效率93%以上(59/63)[9]。
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3 培养环境
角朊细胞培养环境主要指培养液，其中添加剂、Ca2+浓度、血清含量、温度、湿度、CO2浓度及pH值对培养起着重要作用。添加剂如营养物质、激素及生长因子可影响表皮增殖、生长和代谢。一般常用的添加剂有腺嘌呤、表皮生长因子、霍乱毒素、胰岛素、甲状腺素、氢化可的松等。Duinslaeger等用自体网状皮片与培养的角朊细胞联合移植治疗三度烧伤创面，实验室结果显示培养的角朊细胞的分泌物可抑制胶原网格的收缩[10]。氨基酸、必需脂肪酸、葡萄糖的水平也影响角朊细胞生长速度。其他如培养基有无滋养层细胞，培养基中的成纤维细胞比例，培养液中有无血清，添加剂的厂家、批号，以及培养液的更换频率等都影响培养的效果，这些都需要进一步研究。
4 角朊细胞供皮区
人体任何部位皮肤均可消化分离出角朊细胞，但培养和移植后的效果有所不同。一般以包皮外板、躯干四肢伸侧的皮肤较佳，因为这些部位表皮丁突较多且长，基底细胞所占比例相对较多。Kumagai研究发现在36例肤色不同、部位各异的烧伤瘢痕治疗中，将瘢痕去除后在其上种植培养的角朊细胞，角朊细胞的供皮区分别为臀部(8例)、足底(6例)、瘢痕周边部位(24例)。2年后随访发现采用瘢痕周边部位供皮效果最佳，肤色接近周围正常皮肤，皮肤张力几乎恢复正常。因此，提出了一个角朊细胞供皮区选择原则──“就近原则(closer is best)”[11]。
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5 细胞因子
角朊细胞是表皮的主要组成细胞，具有强烈的生长、增殖、分化能力，角朊细胞本身有许多细胞因子受体，通过自分泌(autocrine)或旁分泌(paracrine)起作用。这些细胞因子和生长因子为表皮生长因子(EGF)、血小板衍生因子(PDGF)、转移生长因子(TGF)、白介素(IL)、干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)等[10]。
1997年10月在汉诺威召开的欧洲科学家与整形外科医师会议(ECSAPS)上报道，深二度创面用培养的角朊细胞异体移植后，角朊细胞分泌细胞因子和生长因子，促使创面残留的毛囊上皮细胞增殖形成新上皮。他们用培养的角朊细胞加石蜡纱布在猪模型上进行实验，穿刺活检发现再表皮化，48h后用组蛋白原位杂交发现 S期角朊细胞，毛囊外根鞘S期细胞比例也增多。因此，培养的角朊细胞异体移植可以刺激自身残余毛囊上皮增殖[12]。
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Stoll发现在皮肤创面治疗时，双向调节蛋白、肝素结合的表皮生长因子(HB-EGF)、血管通透因子、角蛋白-6的转录发生上调。高EGF受体专一性酪氨酸激酶抑制剂PD153035和抗EGF受体的单克隆抗体225IgG，可强烈抑制上述4种因子转录的诱导，但对角朊细胞无毒性作用。因此角朊细胞产生的肝素结合配体是皮肤创面愈合信号扩大与转移的重要机制[13]。Eming在脱细胞真皮上种植经基因修饰过的角朊细胞，发现角朊细胞分泌 PDGF-A，创面挛缩明显受到抑制，因此PDGF-A在培养的角朊细胞移植后第1周时过度表达能改善移植行为[14]。
6 存在问题与前景展望
培养的角朊细胞自体移植创面治疗存在的首要问题就是培养时间长(3～5周)，因而采取培养的角朊细胞异体移植可以有效地解决时间问题。培养表皮移植的失败大多归因于感染。与异体植皮技术不同，培养的角朊细胞不会被排斥。因为发生免疫排斥反应的主要原因是人表皮中的HLA-DR(+)和CD-1a(+)的Langerhans细胞，经过体外原代、次代培养后，Langerhans细胞几乎全都消失，培养的角朊细胞不会刺激异体淋巴细胞增殖[15]。Hultman 和Hunt 在大鼠试验中，采用去除角朊细胞的免疫原性，称为主要组织相容性复合物“敲除”(MHC knockout)技术，主要是去除MHC.Ⅱ类抗原，培养后用于全厚创面，发现存活时间比对照组有显著延长，培养的角朊细胞联合“敲除”技术可为重度烧伤创面提供低免疫原性的覆盖物[16]。
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为了确定培养的角朊细胞异体移植后的影响，可采取以下几种方法进行检测：(1)血型标志物；(2)DNA指纹图谱；(3)PCR-RFLP；(4)HLA基因位点分析；(5)PCR扩增染色体特异性DNA片断；(6)Brd U标记角朊细胞；(7)异性的角朊细胞用免疫组化和荧光标记原位杂交检测Y染色体等；均有助于角朊细胞异体移植后的转归及免疫研究。但仍需要解决或进一步完善:(1)角朊细胞自体移植如何缩短培养时间；(2)移植免疫机理及对将来的影响，培养的角朊细胞自体或异体移植后某些成分对机体免疫是否会产生影响(如3T3细胞，异种真皮，……)；(3)在容易获得、使用方便、低抗原性、经济实用的前提下，在有机合成材料及生物工程材料方面继续寻找更好的传递系统；(4)目前国外培养的角朊细胞自体或异体移植患者平均住院日为(114±30)d，平均费用为每人98500美元，培养平均费用为每平方厘米16美元[17]，希望能找到更加经济的、适合我国国情的方法；(5)基因治疗，通过病毒转染等手段，对培养的角朊细胞加入EGF、PDGF、TGF等细胞因子基因，以促进创面愈合。
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培养的角朊细胞自体或异体移植可以早期覆盖烧伤创面，控制伤后瘢痕过度形成，防止多脏器功能衰竭的发生，在烧伤和整形外科领域中有着广泛的应用前景，是目前国内外医学领域的前沿学科，需要我们进一步加强基础学方面的研究和进行临床探索性试验。
[作者简介]谭谦(1964-)，男，安徽阜阳人，南京铁道医学院整形烧伤外科副主任医师，副教授，医学硕士。
[参考文献]
[1]Rheinwald J G,Green H.Serial cultivation of human epidermal keratinocytes:the formation of keratining colonies from single cells[J].Cell,1975,6:331-6.
[2]Pu Y, Bernstein I A, Bernstam LI, et al. Growing a stratified,cornified primary culture of rat keratinocytes with epidermis-like water permeation barrier function[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim,1995,31(4):283-7.
, 百拇医药
[3]Harris P A,Leigh I M,Navasaria HA. Pre-confluent keratinocyte gra～fting: the future for cultured skin replacements[J]? Burns,1998，24:591-3.
[4]Sheridan R L,Tompkins R G.Skin substitutes in burns[J].Burns,1999，25:97-103.
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[收稿日期]1999-11-22, 百拇医药