视网膜母细胞瘤中Fas和bcl-2的表达及意义
作者：郑晓芙 罗伟 杨建国 孙海斌 杨宁 张建波
单位：(郑州铁路局中心医院病理科，河南 郑州 450052)
关键词：视网膜母细胞瘤；凋亡；基因表达
铁道医学000303 [摘要]目的 探讨Fas及bcl.2在视网膜母细胞瘤的表达及意义。方法 用免疫组织化学SP方法检测了45例视网膜母细胞瘤及12例正常视网膜组织中Fas及 bcl.2蛋白的表达，并进行比较。结果 Fas在视网膜母细胞瘤组织及正常视网膜组织的表达分别为0.255±0.441，0.083±0.289，两者比较差异无显著性(P=0.114 8)，均呈低表达；bcl.2在视网膜母细胞瘤中的表达为2.702±1.082，与正常视网膜组织中0.167±0.389相比差异具非常显著性(P<0.000 1)。结论 Fas在视网膜母细胞瘤及正常视网膜中均呈低表达；而bcl.2在视网膜母细胞瘤中呈明显高表达，其可明显抑制凋亡的发生，与肿瘤的发展关系密切。
, 百拇医药
[中图分类号]R739.7+；R361+.3 [文献表识码]A
[文章编号]1001-0912(2000)03-0149-03
A study on the expression of Fas and bcl-2 in retinoblastoma
ZHENG Xiao-fu
(Zhengzhou Railway Central Hospital,Zhengzhou 450052,China)
LUO Wei
(Zhengzhou Railway Central Hospital,Zhengzhou 450052,China)
, 百拇医药
YANG Jian-guo
(Zhengzhou Railway Central Hospital,Zhengzhou 450052,China)
Abstract：Objective To investigate the significant of Fas and bcl.2 expression in retinoblastoma.Methods The immunohistochemical staining was performed to detect Fas and bcl.2 in 45 cases of retinoblastoma and 12 cases of normal retina.Results The expression of Fas in retinoblastoma and normal retina were 0.255±0.441 and 0.083±0.289 respectively (P=0.114 8).bcl.2 was high in retinoblastoma 2.702±1.082 and low in normal retina 0.167±0.389,showing significant difference(P<0.000 1).Conclusion Low regulation of Fas expression in retinoblastoma and normal retina suggested that it is a throughout event which prohibit the apoptosis. The high expression of bcl.2 in retinoblastoma was close associated with the tumour development.
, http://www.100md.com
Key words：retinoblastoma；apoptosis；gene expression
视网膜母细胞瘤是发生在儿童眼部的一种常见恶性肿瘤，该肿瘤的发生与13q14的Rb等位基因的缺失或该位点等位基因的失活有直接关系[1，2]。Fas是一种细胞表面分子[3]，可与其特异性配体Fas L或anti.fas抗体结合，诱导细胞凋亡的发生。最新的研究表明，许多肿瘤细胞均低表达Fas，提示肿瘤细胞表达Fas可明显减弱Fas阳性细胞毒T淋巴细胞的攻击能力，是肿瘤细胞逃避机体免疫攻击的新机制，在肿瘤的发生和发展中起重要作用。Bcl.2[3]是一种癌基因产物，可抑制凋亡的发生而延长细胞的生存，在很多恶性肿瘤细胞中高表达，作者拟研究Fas和bcl.2在视网膜母细胞瘤中的表达及其意义。
1 材料与方法
1.1 研究对象 视网膜母细胞瘤45例及正常视网膜组织12例(均为1994～1998年间存档蜡块)，标本处理前均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋。
, http://www.100md.com
1.2 试剂 兔抗人Fas多克隆抗体(1∶500,Santa Cruz Co.)，鼠抗人bcl.2单克隆抗体(1∶50, Santa Cruz Co.), SP试剂(biotinylated second antibody and enzyme conjugate)均购于中山生物技术公司，DAB(Immunotech Co.)。
1.3 方法 石蜡标本切4μm厚，经脱蜡、水化，消除内源性酶活性，血清封闭，在柠檬酸钠缓冲液中微波修复5min2次，分别加入一抗Fas(1∶500)和bcl.2(1∶50)，4℃过夜；加入生物素化的二抗，室温孵育15min，再加入酶复合物，室温孵育15min，DAB显色，苏木素复染。Fas阳性表达部位在细胞膜，bcl.2阳性部位在细胞浆。根据染色范围分为∶0～4 (“0”表示阳性细胞数为0，“1”表达细胞数1%～25%，“2”表达细胞数在26%～50%，“3”表达细胞数在51%～75%，“4”表达细胞数在76%～100%)[4]。所有病例的阳性细胞分布分别由2位病理医师独立观察，当有差异时，取两者的平均值。阳性对照：Fas用肺癌组织中表达阳性的标本,bcl.2用滤泡性淋巴瘤组织，结果均阳性。空白对照：PBS代替一抗，结果均阴性。每次实验均设对照。
, http://www.100md.com
1.4 统计学处理 数据用
±s表示，两组之间表达的差异比较用非配对t检验。
2 结 果
Fas在正常视网膜组织中几乎无表达(0.083±0.289)，在视网膜母细胞瘤中有极弱的表达，且多在细胞浆中表达，细胞膜上几乎无表达(0.255±0.441)(图1)，差异无显著性(P=0.1148)。表明Fas在肿瘤及正常视网膜组织中均为低表达。
bcl.2在正常视网膜组织中表达极弱(0.167±0.389), 且阳性表达细胞均位于视网膜的视杆细胞和色素层；而在视网膜母细胞瘤中表达明显增高(2.702±1.082)(图2)，阳性细胞胞浆着色，分布弥散，差异有非常显著性(P<0.0001)。
, 百拇医药
图1 Fas在正常视网膜及视网膜母细胞瘤中的表达
图2 bel-2在正常视网膜及视网膜母细胞瘤中的表达
3 讨 论
肿瘤的发生和发展与凋亡的关系密切。凋亡是一个自主生理性细胞死亡过程，是机体自身稳定的重要调节机制，参与了胚胎发生、发育、衰老等生理过程。肿瘤的发生和发展与凋亡的关系密切。Fas/FasL系统是近年来认识较深入的与凋亡信号传递有关的系统。Fas与其相应的配体的相互作用是诱导细胞凋亡的重要途径之一，人Fas基因位于10q24.1，70Kb，有8个内含子和9个外显子，编码成熟蛋白的相对分子质量为36，属#Ⅰ#型跨膜蛋白，Fas主要以膜蛋白受体形式存在，还可通过拼接产生可溶性Fas分子，后者对Fas介导的PCD(programmed cell death)有抑制作用。目前的研究资料表明，Fas在许多肿瘤中有表达[5，6]。本研究结果显示，视网膜母细胞瘤的细胞浆中表达较弱的Fas与正常视网膜组织相比差异无显著性(P=0.1148)，表明Fas在正常视网膜组织和肿瘤组织中均不表达或在细胞浆中低表达。在正常情况下，眼部作为一个免疫特赦部位，Fas低表达或不表达和FasL高表达是其特定的物质基础之一，前者有利于维持视网膜组织的完整性，免遭细胞毒T淋巴细胞的攻击；而后者则有利于主动诱导浸润淋巴细胞凋亡的发生，减轻炎症反应。Fas低表达在正常视网膜组织及视网膜母细胞瘤中持续存在，有利于视网膜母细胞瘤的失控性增生，是贯穿视网膜母细胞瘤发生发展过程的一个事件，在肿瘤的发展中起重要作用。
, 百拇医药
bcl.2作为一个癌基因[7]，其编码蛋白位于细胞浆的线粒体内膜表面，可阻断凋亡信号的传递，抑制凋亡发生，延长细胞寿命，称为长寿基因。该基因产物在许多肿瘤中高表达。有研究显示[8]，bcl.2在恶性胶质瘤细胞中高表达，其表达程度和强度与肿瘤分级呈正比；当将鼠bcl.2 cDNA 转染Fas Ag敏感性人恶性胶质瘤细胞株后，该恶性胶质瘤细胞获得了抗Fas.Ag介导凋亡的抗性，而使凋亡的发生明显减少；但当加入细胞因子、α.肿瘤坏死因子、γ.干扰素时，该细胞株抗性被部分削弱，凋亡的发生增多。表明许多其他因素可影响bcl.2的作用，减弱其抗凋亡的抗性，这是制定肿瘤生物治疗对策的依据之一。本实验中，视网膜母细胞瘤细胞bcl.2表达较广，且强度高，与正常视网膜组织相比有高度显著性差异。提示bcl.2在视网膜母细胞瘤的发展过程中起重要作用，其机制可能是抑制肿瘤细胞凋亡的发生，促进肿瘤细胞的恶性增生。
肿瘤的发生和发展是一个复杂的过程，有很多影响因素，包括癌基因的激活、抗癌基因的失活、凋亡机制的异常及其他因子的改变。在视网膜母细胞瘤中Fas的低表达是贯穿肿瘤发生和发展的一个重要因素，而bcl.2的高表达在肿瘤的发展上起重要作用。
, http://www.100md.com
[作者简介]郑晓芙(1953-)，女，河南武陟人，郑州铁路局中心医院病理科主治医师。
[参考文献]
[1]Lee W H,Shew J Y,Hong F D,et al.The retinoblastoma suscepitibility gene encodes a nuclear phosphoprotein associated with DNA binding activity[J]. Nature, 1987,329:642.
[2]Cooper J A,Peter W.Retinoblastoma and the cell cycle: entrance or exit?[J].Cell, 1989,58:1009.
[3]Kawahara A, Kobayashi T, Nagata S. Inhibition of Fas-induced apo～ptosis by bcl.2[J].Oncogene,1998,17(20):2549-54.
, http://www.100md.com
[4]Mitsiades N, Poulaki V,Kotoula V,et al.Fas/fas ligand up-regulation and bcl.2 down-regulation may be significant in the pathogenesis of Hashimoto's thyroiditis[J].J Clin Endocrinol Metab, 1998,83(6):2199-203.
[5]Kondo E, Yoshino T, Yamadori I, et al. Expression of Bcl.2 protein and Fas antigen in non-Hodgkin's lymphomas[J]. Am J Pathol, 1994 ,145(2):330-7.
[6]Ungefroren H, Voss M, Jansen M, et al. Human pancreatic adeno～carcinomas express Fas and Fas ligand yet are resistant to Fas-mediated apoptosis[J]. Cancer Res, 1998, 58(8):1741-9.
, 百拇医药
[7]Hamazki K, Gochi A, Matsubarn N, et al. Expression of Fas antigen and bcl.2 protein in hepatocellular carcinoma[J].Acta Med Okayama, 1995, 49(4):227-30.
[8]Weller M, Malipiero U, Aguzzi A, et al. Protooncogene bcl.2 gene transfer abrogates Fas/APO.1 antibody-mediated apoptosis of human malignant glioma cells and confers resistance to chemotherapeutic drugs and therapeutic irradiation[J].J Clin Invest, 1995,95(6):2633-43.
[收稿日期]1999-11-15, http://www.100md.com
单位：(郑州铁路局中心医院病理科，河南 郑州 450052)
关键词：视网膜母细胞瘤；凋亡；基因表达
铁道医学000303 [摘要]目的 探讨Fas及bcl.2在视网膜母细胞瘤的表达及意义。方法 用免疫组织化学SP方法检测了45例视网膜母细胞瘤及12例正常视网膜组织中Fas及 bcl.2蛋白的表达，并进行比较。结果 Fas在视网膜母细胞瘤组织及正常视网膜组织的表达分别为0.255±0.441，0.083±0.289，两者比较差异无显著性(P=0.114 8)，均呈低表达；bcl.2在视网膜母细胞瘤中的表达为2.702±1.082，与正常视网膜组织中0.167±0.389相比差异具非常显著性(P<0.000 1)。结论 Fas在视网膜母细胞瘤及正常视网膜中均呈低表达；而bcl.2在视网膜母细胞瘤中呈明显高表达，其可明显抑制凋亡的发生，与肿瘤的发展关系密切。
, 百拇医药
[中图分类号]R739.7+；R361+.3 [文献表识码]A
[文章编号]1001-0912(2000)03-0149-03
A study on the expression of Fas and bcl-2 in retinoblastoma
ZHENG Xiao-fu
(Zhengzhou Railway Central Hospital,Zhengzhou 450052,China)
LUO Wei
(Zhengzhou Railway Central Hospital,Zhengzhou 450052,China)
, 百拇医药
YANG Jian-guo
(Zhengzhou Railway Central Hospital,Zhengzhou 450052,China)
Abstract：Objective To investigate the significant of Fas and bcl.2 expression in retinoblastoma.Methods The immunohistochemical staining was performed to detect Fas and bcl.2 in 45 cases of retinoblastoma and 12 cases of normal retina.Results The expression of Fas in retinoblastoma and normal retina were 0.255±0.441 and 0.083±0.289 respectively (P=0.114 8).bcl.2 was high in retinoblastoma 2.702±1.082 and low in normal retina 0.167±0.389,showing significant difference(P<0.000 1).Conclusion Low regulation of Fas expression in retinoblastoma and normal retina suggested that it is a throughout event which prohibit the apoptosis. The high expression of bcl.2 in retinoblastoma was close associated with the tumour development.
, http://www.100md.com
Key words：retinoblastoma；apoptosis；gene expression
视网膜母细胞瘤是发生在儿童眼部的一种常见恶性肿瘤，该肿瘤的发生与13q14的Rb等位基因的缺失或该位点等位基因的失活有直接关系[1，2]。Fas是一种细胞表面分子[3]，可与其特异性配体Fas L或anti.fas抗体结合，诱导细胞凋亡的发生。最新的研究表明，许多肿瘤细胞均低表达Fas，提示肿瘤细胞表达Fas可明显减弱Fas阳性细胞毒T淋巴细胞的攻击能力，是肿瘤细胞逃避机体免疫攻击的新机制，在肿瘤的发生和发展中起重要作用。Bcl.2[3]是一种癌基因产物，可抑制凋亡的发生而延长细胞的生存，在很多恶性肿瘤细胞中高表达，作者拟研究Fas和bcl.2在视网膜母细胞瘤中的表达及其意义。
1 材料与方法
1.1 研究对象 视网膜母细胞瘤45例及正常视网膜组织12例(均为1994～1998年间存档蜡块)，标本处理前均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋。
, http://www.100md.com
1.2 试剂 兔抗人Fas多克隆抗体(1∶500,Santa Cruz Co.)，鼠抗人bcl.2单克隆抗体(1∶50, Santa Cruz Co.), SP试剂(biotinylated second antibody and enzyme conjugate)均购于中山生物技术公司，DAB(Immunotech Co.)。
1.3 方法 石蜡标本切4μm厚，经脱蜡、水化，消除内源性酶活性，血清封闭，在柠檬酸钠缓冲液中微波修复5min2次，分别加入一抗Fas(1∶500)和bcl.2(1∶50)，4℃过夜；加入生物素化的二抗，室温孵育15min，再加入酶复合物，室温孵育15min，DAB显色，苏木素复染。Fas阳性表达部位在细胞膜，bcl.2阳性部位在细胞浆。根据染色范围分为∶0～4 (“0”表示阳性细胞数为0，“1”表达细胞数1%～25%，“2”表达细胞数在26%～50%，“3”表达细胞数在51%～75%，“4”表达细胞数在76%～100%)[4]。所有病例的阳性细胞分布分别由2位病理医师独立观察，当有差异时，取两者的平均值。阳性对照：Fas用肺癌组织中表达阳性的标本,bcl.2用滤泡性淋巴瘤组织，结果均阳性。空白对照：PBS代替一抗，结果均阴性。每次实验均设对照。
, http://www.100md.com
1.4 统计学处理 数据用
±s表示，两组之间表达的差异比较用非配对t检验。2 结 果
Fas在正常视网膜组织中几乎无表达(0.083±0.289)，在视网膜母细胞瘤中有极弱的表达，且多在细胞浆中表达，细胞膜上几乎无表达(0.255±0.441)(图1)，差异无显著性(P=0.1148)。表明Fas在肿瘤及正常视网膜组织中均为低表达。
bcl.2在正常视网膜组织中表达极弱(0.167±0.389), 且阳性表达细胞均位于视网膜的视杆细胞和色素层；而在视网膜母细胞瘤中表达明显增高(2.702±1.082)(图2)，阳性细胞胞浆着色，分布弥散，差异有非常显著性(P<0.0001)。
, 百拇医药
图1 Fas在正常视网膜及视网膜母细胞瘤中的表达
图2 bel-2在正常视网膜及视网膜母细胞瘤中的表达
3 讨 论
肿瘤的发生和发展与凋亡的关系密切。凋亡是一个自主生理性细胞死亡过程，是机体自身稳定的重要调节机制，参与了胚胎发生、发育、衰老等生理过程。肿瘤的发生和发展与凋亡的关系密切。Fas/FasL系统是近年来认识较深入的与凋亡信号传递有关的系统。Fas与其相应的配体的相互作用是诱导细胞凋亡的重要途径之一，人Fas基因位于10q24.1，70Kb，有8个内含子和9个外显子，编码成熟蛋白的相对分子质量为36，属#Ⅰ#型跨膜蛋白，Fas主要以膜蛋白受体形式存在，还可通过拼接产生可溶性Fas分子，后者对Fas介导的PCD(programmed cell death)有抑制作用。目前的研究资料表明，Fas在许多肿瘤中有表达[5，6]。本研究结果显示，视网膜母细胞瘤的细胞浆中表达较弱的Fas与正常视网膜组织相比差异无显著性(P=0.1148)，表明Fas在正常视网膜组织和肿瘤组织中均不表达或在细胞浆中低表达。在正常情况下，眼部作为一个免疫特赦部位，Fas低表达或不表达和FasL高表达是其特定的物质基础之一，前者有利于维持视网膜组织的完整性，免遭细胞毒T淋巴细胞的攻击；而后者则有利于主动诱导浸润淋巴细胞凋亡的发生，减轻炎症反应。Fas低表达在正常视网膜组织及视网膜母细胞瘤中持续存在，有利于视网膜母细胞瘤的失控性增生，是贯穿视网膜母细胞瘤发生发展过程的一个事件，在肿瘤的发展中起重要作用。
, 百拇医药
bcl.2作为一个癌基因[7]，其编码蛋白位于细胞浆的线粒体内膜表面，可阻断凋亡信号的传递，抑制凋亡发生，延长细胞寿命，称为长寿基因。该基因产物在许多肿瘤中高表达。有研究显示[8]，bcl.2在恶性胶质瘤细胞中高表达，其表达程度和强度与肿瘤分级呈正比；当将鼠bcl.2 cDNA 转染Fas Ag敏感性人恶性胶质瘤细胞株后，该恶性胶质瘤细胞获得了抗Fas.Ag介导凋亡的抗性，而使凋亡的发生明显减少；但当加入细胞因子、α.肿瘤坏死因子、γ.干扰素时，该细胞株抗性被部分削弱，凋亡的发生增多。表明许多其他因素可影响bcl.2的作用，减弱其抗凋亡的抗性，这是制定肿瘤生物治疗对策的依据之一。本实验中，视网膜母细胞瘤细胞bcl.2表达较广，且强度高，与正常视网膜组织相比有高度显著性差异。提示bcl.2在视网膜母细胞瘤的发展过程中起重要作用，其机制可能是抑制肿瘤细胞凋亡的发生，促进肿瘤细胞的恶性增生。
肿瘤的发生和发展是一个复杂的过程，有很多影响因素，包括癌基因的激活、抗癌基因的失活、凋亡机制的异常及其他因子的改变。在视网膜母细胞瘤中Fas的低表达是贯穿肿瘤发生和发展的一个重要因素，而bcl.2的高表达在肿瘤的发展上起重要作用。
, http://www.100md.com
[作者简介]郑晓芙(1953-)，女，河南武陟人，郑州铁路局中心医院病理科主治医师。
[参考文献]
[1]Lee W H,Shew J Y,Hong F D,et al.The retinoblastoma suscepitibility gene encodes a nuclear phosphoprotein associated with DNA binding activity[J]. Nature, 1987,329:642.
[2]Cooper J A,Peter W.Retinoblastoma and the cell cycle: entrance or exit?[J].Cell, 1989,58:1009.
[3]Kawahara A, Kobayashi T, Nagata S. Inhibition of Fas-induced apo～ptosis by bcl.2[J].Oncogene,1998,17(20):2549-54.
, http://www.100md.com
[4]Mitsiades N, Poulaki V,Kotoula V,et al.Fas/fas ligand up-regulation and bcl.2 down-regulation may be significant in the pathogenesis of Hashimoto's thyroiditis[J].J Clin Endocrinol Metab, 1998,83(6):2199-203.
[5]Kondo E, Yoshino T, Yamadori I, et al. Expression of Bcl.2 protein and Fas antigen in non-Hodgkin's lymphomas[J]. Am J Pathol, 1994 ,145(2):330-7.
[6]Ungefroren H, Voss M, Jansen M, et al. Human pancreatic adeno～carcinomas express Fas and Fas ligand yet are resistant to Fas-mediated apoptosis[J]. Cancer Res, 1998, 58(8):1741-9.
, 百拇医药
[7]Hamazki K, Gochi A, Matsubarn N, et al. Expression of Fas antigen and bcl.2 protein in hepatocellular carcinoma[J].Acta Med Okayama, 1995, 49(4):227-30.
[8]Weller M, Malipiero U, Aguzzi A, et al. Protooncogene bcl.2 gene transfer abrogates Fas/APO.1 antibody-mediated apoptosis of human malignant glioma cells and confers resistance to chemotherapeutic drugs and therapeutic irradiation[J].J Clin Invest, 1995,95(6):2633-43.
[收稿日期]1999-11-15, http://www.100md.com