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编号:10227415
运动增加糖尿病大鼠葡萄糖运载体蛋白含量及基因表达的研究
http://www.100md.com 《中国医学杂志》 2000年第3期
     作者:吴毅 杨晓冰 李益明 冯光斌 胡永善 占飞 朱禧星 朱尚权 张新堂

    单位:吴毅 杨晓冰 李益明 冯光斌 胡永善 占飞 朱禧星(上海医科大学附属华山医院内分泌科 200040);朱尚权 张新堂(中国科学院上海生物化学研究所)

    关键词:糖尿病;链脲菌素;基因表达

    中华医学杂志000304 摘 要:目的 研究运动对链脲佐菌素所致的糖尿病大鼠骨骼肌细胞胰岛素受体,葡萄糖运载体4(glucose transporter,GLUT4)基因表达和蛋白含量的作用,探讨运动训练改善糖尿病大鼠糖代谢的可能作用机理。方法 实验大鼠分3组:糖尿病非运动组,糖尿病运动组、正常对照组。糖尿病运动组大鼠进行6周游泳运动。用Western印迹法检测大鼠骨骼肌细胞GLUT4蛋白含量,用斑点印迹杂交法检测骨骼肌细胞内GLUT4 mRNA含量。结果 糖尿病大鼠血糖水平明显升高,血胰岛素水平明显降低,骨骼肌细胞GLUT4蛋白含量和mRNA含量明显减少,与正常对照组相比分别减少30.7%和54.9%。糖尿病运动组大鼠经过6周运动训练,血糖由18.5 mmol/L±1.9 mmol/L降至14.0 mmol/L±3.3 mmol/L(P<0.01),骨骼肌细胞GLUT4蛋白含量和mRNA含量较糖尿病组大鼠分别增加60.8%和56%;但运动训练并不增加糖尿病大鼠骨骼肌细胞胰岛素受体与胰岛素的结合率。结论 运动训练主要增加糖尿病大鼠骨骼肌细胞GLUT4基因表达和GLUT4蛋白含量,通过胰岛素受体后机制改善糖尿病大鼠外周组织对胰岛素的抵抗,降低血糖。
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    Exercise induces increased CLUT4 gene expression and protein content in diabetic rats

    WU Yi YANG Xiaobing LI Yiming, et al.

    (Department of Sports Medicine, Huashan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200040 China)

    Abstract:Objective To investigate the effects of exercise on insulin receptor, glucose transporter 4 (GLUT4) gene expression and protein content in skeletal muscle cells of streptozotocin-induced diabetic rats. Methods All rats were randomized into three groups: normal, diabetic and diabetic exercise groups. Diabetic exercise rats were swim-trained for 6 weeks. The GLUT4 mRNA of skeletal muscle was determined with dot blot and GLUT4 protein was detected by Western blotting. Results After 6 weeks of exercise training, plasma glucose level of diabetic rats decreased from 18.5 mmol/L±1.9 mmol/L to 14.0 mmol/L±3.3 mmol/L (P<0.01). The dot blot revealed that GLUT4 mRNA decreased by 54.9% in skeletal muscle cells of diabetic rats compared with the normal rats. The Western blotting showed that GLUT4 protein of skeletal muscle cell in diabetic rats decreased by 30.7% compared with the control rats. GLUT4 mRNA and the protein of skeletal muscle in diabetic exercise group increased by 56% and 60.8% respectively as compared with the diabetic rats. However, the maximum binding of insulin receptor of skeletal muscle cells in diabetic exercise group decreased significantly compared with diabetic group. Conclusion The weaker expression of GLUT4 gene and the lower level of GLUT4 protein may be one of the causes of hyperglycemia in diabetic rats. Exercise training may raise the GLUT4 gene expression and the amount of GLUT4 protein in diabetic rats, contributing to the main mechanism of improved post-receptor insulin resistance and decreased hyperglycemia in diabetic rats.
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    Key words:Diabetes; Strepozocin; Gene expression

    为观察糖尿病大鼠骨骼肌细胞胰岛素受体结合力及葡萄糖运载体4(glucose transporter,GLUT4)基因表达和蛋白含量的变化,进一步明确糖尿病发生胰岛素抵抗的机制;同时观察有规律的运动训练对其影响,我们应用分子生物学技术从受体水平及受体后水平探讨运动训练改善糖尿病大鼠糖代谢紊乱的可能机理。

    材料与方法

    一、材料

    1.动物:雄性Sprague-Dawley大鼠(体重180 g~220 g),分为3组:第1组为正常对照组,另2组先制备成糖尿病模型,然后分为糖尿病运动组和糖尿病非运动组,每组6只。糖尿病模型制备方法:大鼠腹腔内注射链脲佐菌素(Sigma公司产品,溶于0.1 mol/L柠檬酸缓冲液,pH 4.2) 55 mg/kg体重。3 d后测尿糖(尿糖试纸)和血糖,尿糖在+++和++++,且血糖在16.7 mmol/L以上者确定为糖尿病;正常对照组大鼠腹腔内注射等体积柠檬酸缓冲剂。
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    2.糖尿病运动组大鼠确定为糖尿病后,进行6周游泳训练。训练的方法见文献[1]:水温保持35℃,水深50 cm,每个大鼠有200 cm2的活动表面积,前2周每天游泳40 min,以后维持每天游泳60 min,每周游泳5 d。大鼠最后一次游泳训练结束后48 h,尾静脉采血,麻醉处死,快速分离双侧后肢股四头肌,用于测试骨骼肌细胞膜胰岛素受体结合力及GLUT4基因表达和蛋白含量。实验前后测3组大鼠尾静脉血糖和血清胰岛素。

    二、实验方法

    1.骨骼肌细胞膜制备:按改良的Klip的方法[2],将骨骼肌组织在50 mmol Tris-HCl溶液中剪碎,在匀浆器中匀浆,进行离心、过滤,重复一次,提取膜蛋白。 膜蛋白浓度测定用Lowery方法[3]

    2.胰岛素受体结合力测定:按改良的Nishimura方法[4]进行测定。非专一性结合量为在含有非标记胰岛素存在下的结合计数,专一性结合量为总计数减去非专一性结合计数。
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    3.骨骼肌细胞内GLUT4蛋白质含量的测定:(1)多克隆抗体的制备:采用James法[5]制备GLUT4羧基端12肽的多克隆抗体,具体方法为用Merrifield固相合成法制备GLUT4羧基端12肽(Thr-Glu-Leu-Glu-Tyr-Ile-Gly-Pro-Asp-Glu-Asn-Asp),以灭活的伤寒杆菌菌壳为载体,免疫兔子,4周及7周后各加强一次。随后处死兔子取血清,经饱和硫酸铵沉淀,透析,冷冻干燥,得GLUT4羧基端12肽多克隆抗体干粉。 (2)Western印迹法检测骨骼肌细胞内GLUT4蛋白含量:取3组大鼠骨骼肌细胞膜50 μg在10%聚丙烯酰胺的胶上行SDS凝胶电泳,随后转移至硝酸纤维素(NC)膜上,加入多克隆抗体过夜(4℃)。洗涤后与HRP标记的羊抗兔IgG水浴摇床温育2 h(37℃),充分洗涤后与ECL(增强化学发光剂)反应1 min,即刻与Kodak底片曝光,洗片后进行扫描,定量分析。以正常对照组的GLUT4的量为100,计算其他2组相对含量。

    4.斑点印迹杂交法检测骨骼肌细胞内GLUT4 mRNA含量:质粒DNA的提取和探针的标记:含大鼠全长GLUT4 cDNA的Bluescribe重组质粒(2 086 bp,由美国华盛顿大学Mueckler Mike 教授惠赠),经菌株扩增后,用改良碱裂解法提取和纯化质粒DNA。用琼胶糖凝胶电泳回收GLUT4 cDNA,用随机引物法同位素标记GLUT4 cDNA为探针。
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    5.斑点印迹杂交实验:采用一步快速热酚法抽提骨骼肌细胞总RNA。取15 μg总RNA,经甲醛变性后,点样于处理好的硝酸纤维素滤膜上,然后预杂交、杂交、洗涤及放射自显影。用Vectron计算机图像分析系统对斑点杂交结果进行光密度扫描,以正常对照组为100,其他组计算相对含量。

    6.血糖浓度用快速血糖仪测试(美国强生公司产品,one touch Ⅱ型)检测,血清胰岛素浓度用放免法(中国华西糖尿病科技开发研究所试剂盒)测定。

    三、统计学处理:实验数据用均数±标准差表示,组间显著性差异采用t检验。

    结果

    1.运动训练前后实验大鼠体重、血糖和血清胰岛素变化:糖尿病运动组大鼠运动训练后血糖浓度较运动前明显降低(t=4.64,P<0.01),与糖尿病非运动组大鼠比较,血糖浓度明显降低(t=5.08,P<0.01),但血清胰岛素浓度差异无显著意义,表明运动训练具有降血糖作用(表1)。
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    表1 实验前后大鼠体重和血糖及血胰岛素浓度的比较(±s) 组别

    鼠数

    体重增加(g/d)

    血糖(mmol/L)

    血胰岛素(mU/L)

    开始

    结束

    开始

    结束

    糖尿病非运动组

    6
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    1.40±0.28*

    19.9±2.0*

    20.0±2.0

    3.91±0.25*

    3.81±0.28

    糖尿病运动组

    6

    1.81±0.66*△

    18.5±1.9*

    14.0±3.3▲△
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    4.03±0.26*

    4.02±0.27

    正常对照组

    6

    2.97±0.49

    4.0±0.5

    4.0±0.4

    9.26±0.73

    9.27±0.57

    注:与正常对照组比较,*P<0.01;运动前后比较,P<0.01; 糖尿病运动组与糖尿病非运动组比较,P<0.01
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    2.骨骼肌细胞膜胰岛素受体结合率测定:糖尿病大鼠骨骼肌细胞膜胰岛素受体专一性结合量与总结合量的百分比为87.4%±0.95%,明显高于正常对照组77.8%±0.82%(P<0.01),表明糖尿病大鼠骨骼肌细胞膜胰岛素受体与胰岛素的结合率增加。而糖尿病运动组大鼠骨骼肌细胞膜胰岛素受体专一结合量与总结合量的百分比为80.6%±0.52%,较糖尿病非运动组大鼠明显下降(P<0.05),表明糖尿病运动组大鼠骨骼肌细胞膜胰岛素受体与胰岛素的结合率较糖尿病非运动组大鼠降低。

    3.骨骼肌细胞内GLUT4蛋白含量的比较:Western检测显示,在相对分子质量43 000处可见GLUT4蛋白条带,糖尿病大鼠骨骼肌细胞GLUT4的蛋白含量明显低于正常大鼠,经光密度扫描定量分析,仅为正常大鼠的69.3%,而糖尿病运动组大鼠与糖尿病非运动组相比,骨骼肌细胞内GLUT4的蛋白含量明显增加,定量分析增加60.8%。

    4.骨骼肌细胞内GLUT4 mRNA含量的比较:糖尿病大鼠与正常对照组大鼠比较,骨骼肌细胞内GLUT4 基因表达减弱,GLUT4 mRNA含量测定仅为正常大鼠的45.1%。糖尿病运动组大鼠与糖尿病非运动组大鼠比较,骨骼肌细胞内GLUT4基因表达明显提高,GLUT4 mRNA含量测定增加56%(图1)。
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    图1 各组实验大鼠GLUT4蛋白的相对含量比较

    讨论

    本实验结果显示,链脲佐菌素所致糖尿病大鼠血清胰岛素浓度明显降低,血糖浓度显著升高(表1),表明产生了明显的糖代谢紊乱。通过对3组实验大鼠骨骼肌细胞膜胰岛素受体与胰岛素结合率测试发现,糖尿病大鼠骨骼肌细胞膜胰岛素受体与胰岛素的结合率增加,表明胰岛素受体与胰岛素的结合力增加。Nishimura等[5]研究发现,糖尿病大鼠细胞膜胰岛素受体结合力增加主要是由于细胞膜上的胰岛素受体数量增加。对胰岛素受体研究表明,细胞膜胰岛素受体数量是受血中胰岛素浓度的影响。大多数情况下,血胰岛素浓度对胰岛素受体量呈负向调节(或称“上升调节”),即胰岛素浓度升高,受体数降低,反之则受体数升高。因此,本实验中糖尿病大鼠骨骼肌细胞膜胰岛素受体结合力增加,可能与血中胰岛素浓度下降引起的胰岛素受体数量增加有关。虽然糖尿病时细胞膜胰岛素受体数量增加,受体结合力增加,但骨骼肌细胞对葡萄糖摄取和利用却减少,这表明胰岛素效应不全,存在细胞内限速反应,即胰岛素受体后的抵抗。本实验结果表明,糖尿病大鼠骨骼肌细胞内GLUT4 mRNA含量明显低于正常大鼠, 骨骼肌细胞内GLUT4蛋白含量也明显减少,说明在糖尿病高血糖状况下,骨骼肌细胞内GLUT4基因表达受到抑制,转录能力降低,使GLUT4蛋白合成减少,导致骨骼肌细胞转运和摄取葡萄糖的能力降低,这可能是糖尿病大鼠发生胰岛素受体后抵抗的主要原因之一。
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    本实验发现,糖尿病大鼠经过6周有规律的运动训练后,可使血糖水平降低,而血胰岛素水平无明显变化,说明运动后尽管胰岛素保持在较低的水平,但骨骼肌细胞对葡萄糖的利用仍增加。对骨骼肌细胞膜胰岛素受体与胰岛素结合率测试发现,糖尿病运动组大鼠骨骼肌细胞胰岛素受体与胰岛素的结合率低于糖尿病组大鼠,表明运动训练并不增加糖尿病大鼠骨骼肌细胞胰岛素受体与胰岛素的结合力,运动训练对糖尿病大鼠降血糖作用并不在胰岛素受体水平。对骨骼肌细胞GLUT4 mRNA测定表明,糖尿病运动组大鼠骨骼肌细胞内GLUT4 mRNA含量明显高于糖尿病非运动组大鼠,表明运动可使骨骼肌细胞内GLUT4基因转录增加,使GLUT4蛋白含量增加,其结果是骨骼肌细胞转运和利用葡萄糖的能力增加。这可能是运动训练改善糖尿病大鼠外周组织对胰岛素的敏感性,促进外周组织细胞对葡萄糖的摄取和利用,纠正糖代谢紊乱的作用机理之一。

    基金项目:国家自然科学基金资助项目 (39400162)

    参考文献:
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    1 Ploug T, Stallknecht BN, Pedersen D, et al. Effect of endurance training on glucose transport capacity and glucose transporter expression in rat skeletal muscle. Am J Physiol, 1990, 259:E778-E786.

    2 Klip A, Ramlal T, Young AJ, et al. Insulin-induced translocation of glucose transporters in rat hindlimb muscles. FEBS Lett,1987, 244:224-230.

    3 Lowery OH, Rosebrough HJ, Farr AL, et al. Protein measurement with the folinphenol reagent. J Biol Chem, 1951,193:265-275.
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    4 Nishimura H, Lambert AE, Stanffacher W, et al. Postreceptor defect in insulin action in streptozotocin-induced diabetic rat. Am J Physiol, 1989, 256E:624-631.

    5 James D, Strube M, Mueckler M, et al. Molecular cloning and characterization of an insulin-regulatable glucose transporter. Nature, 1989, 338: 83-87.

    收稿日期:1999-05-10, 百拇医药