用亮氨酰对硝基苯胺测定血清亮氨酰氨基酞酶
作者：王冬环 李大军
单位：(卫生部北京医院普外科 100730)
关键词：
中华医学杂志000317 目前国内仍有一些医院采用经典方法[1，2]测定血清亮氨酰氨基酞酶(LAP)，来作为临床肝、胆、胰疾病的辅助诊断。国外目前广泛采用一种以人工合成的“色素元”——亮氨酰对硝基苯胺为基质的连续监测法[3]。我们以亮氨酰对硝基苯胺为基质, 在405 nm下进行连续监测, 单一试剂直接显色。并与国外方法进行了对比分析，探讨了测定该酶活性的最适条件, 测定了该试验条件下的米氏常数, 建立了适合于临床应用及自动生化分析仪的方法和参考值。
一、对象和方法
1.对象：0.11 mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液, pH=7.2，26 mmol/L的亮氨酰对硝基苯胺(德国产)基质; 胆结石病人及正常人，空腹采血3 ml,离心，取血清备用. Boehringer 4010光电比色计，日立7170自动生化分析仪。
, http://www.100md.com
2.手工测试：L-亮氨酰对硝基苯胺+H2O
L-亮氨酸+对硝基苯胺 对硝基苯胺在405 nm处有一特异吸收峰, 溶液吸光度的变化与亮氨酸氨基酞酶的活性成正比。取波长405 nm,光程1 cm, 温度37℃并将缓冲液先放于水浴中预温, 每次测定取Tris缓冲液1.5 ml, 亮氨酰对硝基苯胺基质液0.05 ml, 血清0.1 ml, 充分混匀后倒入4010比色计的比色杯内。延迟时间取1 min, 每20 s读一次数, 连续监测4～5 min内的吸光度变化。计算每分钟内吸光度值的平均变化, 并计算酶活性。若ΔA/min超过了0.150, 应将0.05 ml血清用0.2 ml 0.9% NaCl盐水稀释后将结果乘以5。
3.计算:LAP酶活性( U/L )= ΔA/min×106×9 900-1×1.65×0.1-1=ΔA/min×1 666 9 900为对硝基苯胺在405 nm的摩尔消光系数。
, 百拇医药
4.自动分析：7170分析仪。 主要参数：标准液浓度S1, 0，S2, 150，样品4 μl, 测试方法速率A法，副/主波长 660/405测定点(30) (50) 试剂T1(缓冲液)200 μl，T2(基质液)50 μl。
二、结果
1.线性范围: 取总胆红素高于70 mg/L的标本, 制成混合高值血清, 配成不同稀释度测定, 相关系数r=0.999 7, 说明在0～150 U/L范围内, 本方法具有很好的线性。
2.精密度: 取一份正常体检血清, 在1 d内重复测定20次, 求得批内精密度。均值
=33.6 μ/L 标准差s=1.18 标准误
=3.5%; 将该标本连续测定5 d, 每天测10次, 求得批间精密度。=33.6 μ/L s=1.95 =5.7%。说明本方法重复性好, 显色稳定, 精密度较高。
, 百拇医药
3.相关性: 取30份血清标本(高, 低值均有), 用本法测定酶活；再用宝灵曼试剂盒测定酶活性, 对所得30对数值求相关, 相关系数r=0.995, 说明本方法与标准方法的结果有较好的相关性, 准确性是可靠的。
4.参考值: 取健康体检血清50例, 按上述方法测LAP活性, 所得范围为36.7 U/L±8.0 U/L与文献报道34.0 U/L±9.9 U/L相接近。
三、讨论
在选择好最适条件之后, 对本方法作了方法学评价, 结果是令人满意的。线性范围较宽, 至少为0～150 U/L; 重复性好, 批内标准误为3.5%, 批间标准误为5.7%, 说明精密度是可靠的, 与宝灵曼试剂盒所测结果相比较, 相关系数r达0.995, 说明准确性较高, 有可信性。
再与以亮氨酰-β奈胺为底物的固定时间法比较, 后者LAP作用释放出β-奈胺后以Bratton-Marshall反应测其浓度, 操作复杂, 所需时间长, 还需除去蛋白, 采用固蓝B显色[1], 操作简单, 但无法进行连续监测。本法采用连续监测法, 可在零级反应期测出酶作用的初速率 , 对酶活性准确性高; 而固定时间法经过了一定时间, 无法判断整个过程是否都是零级反应, 可能存在偏差: 如基质浓度下降, 产物抑制作用, 出现可逆反应, 酶变性作用等, 都可以干扰实验结果的可靠性。
, 百拇医药
LAP广泛分布于人体各组织内。据报道, 肝外胆管堵塞、肝内胆汁淤积、肝癌或其他肝内占位性病变以及肝实质细胞损害时, LAP 活性均增高; 胰头癌时大部分病例LAP活性也明显升高。另据报道, 测红细胞膜LAP活力, 其升高程度随胃粘膜萎缩、肠化、胃癌依次递增。
综上所述, 以亮氨酰对硝基苯胺为底物测LAP 简单快速、精密度高、准确度好、线性范围宽, 适用于各种自动生化分析仪, 便于临床大批标本的测定。
参考文献：
1 杨振华. 血清芳香基酰胺酶的固蓝B 测定法. 中华医学检验杂志, 1981,4:97-99.
2 Goldberg JJ. Colorimetric determination of leucine aminopeptidase in urine and serum of normal subjects and patient with cancer and other disease. Cancer,1985,11:283-287.
3 王冬环，杨振华. 血清氨基酞酶测定法的探讨. 上海医学检验杂志,1989,4:72-75.
收稿日期：1999-10-18, 百拇医药
单位：(卫生部北京医院普外科 100730)
关键词：
中华医学杂志000317 目前国内仍有一些医院采用经典方法[1，2]测定血清亮氨酰氨基酞酶(LAP)，来作为临床肝、胆、胰疾病的辅助诊断。国外目前广泛采用一种以人工合成的“色素元”——亮氨酰对硝基苯胺为基质的连续监测法[3]。我们以亮氨酰对硝基苯胺为基质, 在405 nm下进行连续监测, 单一试剂直接显色。并与国外方法进行了对比分析，探讨了测定该酶活性的最适条件, 测定了该试验条件下的米氏常数, 建立了适合于临床应用及自动生化分析仪的方法和参考值。
一、对象和方法
1.对象：0.11 mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液, pH=7.2，26 mmol/L的亮氨酰对硝基苯胺(德国产)基质; 胆结石病人及正常人，空腹采血3 ml,离心，取血清备用. Boehringer 4010光电比色计，日立7170自动生化分析仪。
, http://www.100md.com
2.手工测试：L-亮氨酰对硝基苯胺+H2O
L-亮氨酸+对硝基苯胺 对硝基苯胺在405 nm处有一特异吸收峰, 溶液吸光度的变化与亮氨酸氨基酞酶的活性成正比。取波长405 nm,光程1 cm, 温度37℃并将缓冲液先放于水浴中预温, 每次测定取Tris缓冲液1.5 ml, 亮氨酰对硝基苯胺基质液0.05 ml, 血清0.1 ml, 充分混匀后倒入4010比色计的比色杯内。延迟时间取1 min, 每20 s读一次数, 连续监测4～5 min内的吸光度变化。计算每分钟内吸光度值的平均变化, 并计算酶活性。若ΔA/min超过了0.150, 应将0.05 ml血清用0.2 ml 0.9% NaCl盐水稀释后将结果乘以5。3.计算:LAP酶活性( U/L )= ΔA/min×106×9 900-1×1.65×0.1-1=ΔA/min×1 666 9 900为对硝基苯胺在405 nm的摩尔消光系数。
, 百拇医药
4.自动分析：7170分析仪。 主要参数：标准液浓度S1, 0，S2, 150，样品4 μl, 测试方法速率A法，副/主波长 660/405测定点(30) (50) 试剂T1(缓冲液)200 μl，T2(基质液)50 μl。
二、结果
1.线性范围: 取总胆红素高于70 mg/L的标本, 制成混合高值血清, 配成不同稀释度测定, 相关系数r=0.999 7, 说明在0～150 U/L范围内, 本方法具有很好的线性。
2.精密度: 取一份正常体检血清, 在1 d内重复测定20次, 求得批内精密度。均值
=33.6 μ/L 标准差s=1.18 标准误=3.5%; 将该标本连续测定5 d, 每天测10次, 求得批间精密度。=33.6 μ/L s=1.95 =5.7%。说明本方法重复性好, 显色稳定, 精密度较高。, 百拇医药
3.相关性: 取30份血清标本(高, 低值均有), 用本法测定酶活；再用宝灵曼试剂盒测定酶活性, 对所得30对数值求相关, 相关系数r=0.995, 说明本方法与标准方法的结果有较好的相关性, 准确性是可靠的。
4.参考值: 取健康体检血清50例, 按上述方法测LAP活性, 所得范围为36.7 U/L±8.0 U/L与文献报道34.0 U/L±9.9 U/L相接近。
三、讨论
在选择好最适条件之后, 对本方法作了方法学评价, 结果是令人满意的。线性范围较宽, 至少为0～150 U/L; 重复性好, 批内标准误为3.5%, 批间标准误为5.7%, 说明精密度是可靠的, 与宝灵曼试剂盒所测结果相比较, 相关系数r达0.995, 说明准确性较高, 有可信性。
再与以亮氨酰-β奈胺为底物的固定时间法比较, 后者LAP作用释放出β-奈胺后以Bratton-Marshall反应测其浓度, 操作复杂, 所需时间长, 还需除去蛋白, 采用固蓝B显色[1], 操作简单, 但无法进行连续监测。本法采用连续监测法, 可在零级反应期测出酶作用的初速率 , 对酶活性准确性高; 而固定时间法经过了一定时间, 无法判断整个过程是否都是零级反应, 可能存在偏差: 如基质浓度下降, 产物抑制作用, 出现可逆反应, 酶变性作用等, 都可以干扰实验结果的可靠性。
, 百拇医药
LAP广泛分布于人体各组织内。据报道, 肝外胆管堵塞、肝内胆汁淤积、肝癌或其他肝内占位性病变以及肝实质细胞损害时, LAP 活性均增高; 胰头癌时大部分病例LAP活性也明显升高。另据报道, 测红细胞膜LAP活力, 其升高程度随胃粘膜萎缩、肠化、胃癌依次递增。
综上所述, 以亮氨酰对硝基苯胺为底物测LAP 简单快速、精密度高、准确度好、线性范围宽, 适用于各种自动生化分析仪, 便于临床大批标本的测定。
参考文献：
1 杨振华. 血清芳香基酰胺酶的固蓝B 测定法. 中华医学检验杂志, 1981,4:97-99.
2 Goldberg JJ. Colorimetric determination of leucine aminopeptidase in urine and serum of normal subjects and patient with cancer and other disease. Cancer,1985,11:283-287.
3 王冬环，杨振华. 血清氨基酞酶测定法的探讨. 上海医学检验杂志,1989,4:72-75.
收稿日期：1999-10-18, 百拇医药