术后并发严重感染患者肿瘤坏死因子基因微卫星多态性及其与预后关系的研究
作者：舒强 方向明 Frank Stueber
单位：舒强(浙江大学医学院附属儿童医院 310003 杭州)；方向明(浙江大学医学院附属邵逸夫医院)；Frank Stueber(德国Bonn大学医学院ICU病房)
关键词：感染；肿瘤坏死因子；基因；多态性，限制性片段长度
中华医学杂志000311 摘 要：目的 探讨肿瘤坏死因子( TNF)基因微卫星多态性与术后严重全身感染易感性及其预后的相关性。方法 应用聚合酶链反应( PCR)，经聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染色方法，测定122例术后并发严重全身感染的患者和138名健康献血员(对照组)的 TNFc微卫星多态性。结果 TNFc微卫星多态性含有 2个等位基因(TNFc1和TNFc2)及3种基因型(纯合子1/1、2/2及杂合子1/2)，基因型分布符合 Hardy-Weinberg平衡定律。TNFc1等位基因频率在术后感染组为79%，对照组为71%(P<0.05)，TNFc杂合子1/2基因型频率在死亡的感染患者中为46%，存活的患者中为27%(P<0.05)。结论 TNFc微卫星多态性与术后严重全身感染易感性及预后有关。
, http://www.100md.com
Association of tumor necrosis factor microsatellite polymorphism with incidence and outcome of severe postoperative sepsis
SHU Qiang FANG Xiangming Frank Stueber.
(Department of Surgery, Children's Hospital, Zhejiang University, Hangzhou, 310003, China)
Abstract：Objective To investigate whether tumor necrosis factor (TNF) microsatellite polymorphism within the TNF locus is associated with the incidence and outcome of severe postoperative sepsis. Methods 122 patients with severe postoperative sepsis were included in this study; 138 local ethnically matched healthy individuals served as controls. Microsatellite TNFc polymorphism within the TNF locus was typed using polymerase chain reaction (PCR) followed by polyacrylamide gel electrophoresis with silver staining. Results Microsatellite TNFc polymorphism had two alleles (TNFc1 and TNFc2) and three kinds of genotype (homozygotes TNFc1c1 and TNFc2c2, and heterozygote TNFc1c2). The genotype distribution fit Hardy-Weinberg equilibrium. The frequency of TNFc1 microsatellite allele was significantly higher in patients with severe sepsis (79%) than in healthy individuals (71%) (P<0.05). The frequency of heterozygote TNFc1c2 was significantly higher in non-surviving patients (46%) with severe sepsis than in survivors (27%) (P<0.05). Conclusions TNFc microsatellite polymorphism is significantly associated with the incidence and outcome of severe postoperative sepsis.
, 百拇医药
Key words：Infection; Tumor necrosis factor; Genes; Polymorphism, restriction fragment length
人肿瘤坏死因子(TNF)基因的多态性和TNF信使RNA表达及蛋白质水平相关联，TNF基因多态性在一定程度上决定个体的TNF分泌水平，而血浆TNF水平与个体对严重全身感染易感性及预后密切相关[1，2]。微卫星 TNFc位于TNF基因的第1内含子中，已证实TNFc微卫星多态性与TNF蛋白质水平及免疫炎症性疾病相关联[2，3]。我们对TNFc微卫星多态性与术后严重全身感染易感性及预后进行了相关性研究。
对象和方法
一、对象
122例严重全身感染的外科手术后患者均来自本院，符合1992年美国胸科医师学会(ACCP)和危重医学会(SCCM)联席会议诊断标准[4]。其中男70例，女52例，平均年龄57岁。入加强医疗病房(ICU)24 h内的急性生理和既往健康评分(APACHE Ⅱ)[5]为 22.3±1.4。122例中 63例存活，59例死亡。138名相互间无血缘关系的正常人，来自血库不同时期的献血员。
, 百拇医药
二、方法
1.DNA标本：外周血单核细胞DNA的提取采用标准的酚-氯仿法。
2.引物：自行设计寡核甘酸序列：(+)5′-AGAGACGTTCAGGTGGTGTCAT-3′和(-)5′-GGGGTT -TCTCTGACTGCATCTT-3′，德国Biosource公司合成。
3.试剂： dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP为瑞典 Pharmacia Biotech公司产品， AmpliTaqDNA多聚酶(附有缓冲剂)为美国 Perkin-Elmer公司产品。
4.PCR反应：总体积为20 μl的反应液，内含引物(20 pmol)、脱氧核糖核苷酸(dNTP，每种200 μmol)、AmpliTaqDNA多聚酶(1单位)、模板DNA(50 ng)及反应缓冲液，于美国 Perkin-Elmer公司 DNA扩增仪2 400上扩增。扩增条件：95℃ 5 min；95℃ 10 s，68℃ 30 s，72℃ 30 s，总共29个循环；然后72℃ 10 min，4℃贮存待鉴定。
, 百拇医药
5.PCR产品鉴定及分析：取5 μl扩增产物加3 μl上样缓冲液，95℃变性5 min后，进行体积分数为8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳条件：1×电泳缓冲液，电压1 700 V，恒定功率70 W，时间2.5 h，保持凝胶温度在45～50℃。以PUC19限制性内切酶MspI为DNA片段长度参考物。电泳结束后，按Sambrook等[6]方法进行改良凝胶银染色，观察并分析结果。
6.统计学处理：差异显著性检验采用χ2检验(四格表确切概率法)。
结果
TNFc微卫星多态性见图1。TNFc微卫星多态性含有2个等位基因片段：TNFc1(179 bp)和TNFc2(181 bp)，3种基因型：纯合子TNFc1c1、TNFc2c2及杂合子TNFc1c2。TNFc微卫星多态性等位基因片段及基因型在术后感染组和对照组中的分布情况见表1。TNFc微卫星多态性在2组中的分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ2值分别为0.24和0.46，P值分别为 0.89和0.79)。TNFc1等位基因频率在术后感染组为0.79，对照组为0.71(χ2值 =5.45，P=0.02)，基因型TNFc1c1纯合子的频率在术后感染组为0.61，对照组为0.49，差异无显著意义(χ2=4.70，P=0.09)。在TNFc微卫星多态性与严重全身感染的预后的相关分析中，因纯合子TNFc 2c2的例数过少，我们仅比较c1c1纯合子与c1c2杂合子的频率在存活和死亡患者中的差异，观察到基因型TNFc1c2的频率在术后并发严重全身感染的患者死亡组中为46%，存活组为27%(χ2=4.79，P=0.03)。TNFc2等位基因频率在死亡组中为26%，存活组为17%，但差异无显著意义(χ2=3.35，P=0.07)。
, 百拇医药
1，2：TNFc2/2纯合子；3，4：TNFc1/2杂合子；5，6：TNFc1/1纯合子；7：DNA片段长度参考物
图1 6个不同个体的肿瘤坏死因子C(TNFc)微卫星多态性
表1 两组对象的肿瘤坏死因子微卫星等位基因分布情况(%) 组别
例数
基因型频率(%)
等位基因频率(%)
1/1
1/2
2/2
1
, 百拇医药
2
对照组
138
0.49
0.44
0.07
0.71
0.29
患者组
122
0.61▲
0.36
0.03
, 百拇医药
0.79*
0.21
死亡组
59
0.51
0.46△△
0.03
0.74
0.26△
存活组
63
0.70
, 百拇医药
0.27
0.03
0.83
0.17
注：与对照组比较χ2=5.45，P<0.02；与对照组比较▲χ2=4.70，P＝0.09；与存活组比较△χ2=3.35，P=0.07；与存活组比较△△χ2=4.79，P=0.03
讨论
严重全身感染是ICU危重患者死亡的主要原因之一，病死率高达30%～50%[7，8]。大量的 TNF产生可促发全身炎症反应综合征( SIRS)、全身感染及后续症的发展，血浆中高的 TNF水平与严重全身感染的预后呈正相关[1]。目前国际上抗TNF单抗在严重全身感染和多器官功能障碍综合征(MODS)患者中的临床治疗效果未能肯定。抗TNF单抗的失败与患者个体TNF表达水平的复杂性相关联。抗TNF单抗的治疗有益于血浆中TNF水平高的严重全身感染患者，但不适于TNF等致炎因子产生不足的患者。
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本研究观察到，术后并发严重全身感染患者中TNFc1等位基因分布频率明显增加，这可能是携带TNFc1等位基因的个体有低水平的TNF分泌倾向性，由于因微生物入侵、局部感染后，低水平的TNF介导的细胞免疫不足以局限炎症反应，故而携带TNFc1等位基因的个体易患严重全身感染。在术后并发严重全身感染的死亡组中，基因型TNFc1c2的频率明显高于TNFc1c1的频率，这可能与TNFc1c2的患者较TNFc1c1的患者有相对高的促炎症连锁放大的遗传性有关，TNF分泌的遗传性可能与严重全身感染的病理过程有关。TNF微卫星多态性在严重全身感染中的作用尚有待进一步阐明。
本研究表明，TNFc微卫星多态性与术后严重全身感染的易感性及预后密切相关。TNFc1等位基因可能是易患严重全身感染的遗传标志之一。基因型TNFc1c2与严重全身感染后的死亡可能密切相关，TNFc微卫星多态性在术后严重全身感染的免疫调节治疗中有一定参考价值。
参考文献：
, http://www.100md.com
1 Stueber F, Petersen M, Bokelmann F, et al. A genomic polymorphism within the tumor necrosis factor locus influences plasma tumor necrosis factor-alpha concentrations and outcome of patients with severe sepsis. Crit Care Med, 1996, 24:381-384.
2 Pociot F, Briant L, Jongeneel CV, et al. Association of tumor necrosis factor (TNF) and class II major histocompatibility complex alleles with the secretion of TNF-alpha and TNF-beta by human mononuclear cells: a possible link to insulin-dependent diabetes mellitus. Eur J Immunol ,1993, 23:224-231.
, 百拇医药
3 Khoo SH, Pepper L, Snowden N, et al. Tumour necrosis factor c2 microsatellite allele is associated with the rate of HIV disease progression. AIDS, 1997, 11: 423-428.
4 Bone RC, Balk RA, Cerra FB, et al. American college of chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference Committee: American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference.Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. Crit Care Med , 1992 ,20:864-874.
, 百拇医药
5 Knaus WA, Draper EA, Wagner DP, et al. APACHE II: a severity of disease classification system. Crit Care Med, 1985, 13:818-829.
6 Sambrook J, Fritsh EF, Maniatis T. Molecular Cloning. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.1856-1857.
7 Pittet D, Rangel-Frausto S, Li N, et al. Systemic inflammatory response syndrom, Sepsis, severe Sepsis and septic shock: incidence, morbidities and outcomes in surgical ICU patients. Intensive Care Med,1995,21: 302-309.
8 邱海波,杜斌,刘大为,等.全身炎症反应综合征与多器官功能障碍综合征的临床研究.中华外科杂志,1997, 35: 402-405.
收稿日期：1999-04-01, 百拇医药
单位：舒强(浙江大学医学院附属儿童医院 310003 杭州)；方向明(浙江大学医学院附属邵逸夫医院)；Frank Stueber(德国Bonn大学医学院ICU病房)
关键词：感染；肿瘤坏死因子；基因；多态性，限制性片段长度
中华医学杂志000311 摘 要：目的 探讨肿瘤坏死因子( TNF)基因微卫星多态性与术后严重全身感染易感性及其预后的相关性。方法 应用聚合酶链反应( PCR)，经聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染色方法，测定122例术后并发严重全身感染的患者和138名健康献血员(对照组)的 TNFc微卫星多态性。结果 TNFc微卫星多态性含有 2个等位基因(TNFc1和TNFc2)及3种基因型(纯合子1/1、2/2及杂合子1/2)，基因型分布符合 Hardy-Weinberg平衡定律。TNFc1等位基因频率在术后感染组为79%，对照组为71%(P<0.05)，TNFc杂合子1/2基因型频率在死亡的感染患者中为46%，存活的患者中为27%(P<0.05)。结论 TNFc微卫星多态性与术后严重全身感染易感性及预后有关。
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Association of tumor necrosis factor microsatellite polymorphism with incidence and outcome of severe postoperative sepsis
SHU Qiang FANG Xiangming Frank Stueber.
(Department of Surgery, Children's Hospital, Zhejiang University, Hangzhou, 310003, China)
Abstract：Objective To investigate whether tumor necrosis factor (TNF) microsatellite polymorphism within the TNF locus is associated with the incidence and outcome of severe postoperative sepsis. Methods 122 patients with severe postoperative sepsis were included in this study; 138 local ethnically matched healthy individuals served as controls. Microsatellite TNFc polymorphism within the TNF locus was typed using polymerase chain reaction (PCR) followed by polyacrylamide gel electrophoresis with silver staining. Results Microsatellite TNFc polymorphism had two alleles (TNFc1 and TNFc2) and three kinds of genotype (homozygotes TNFc1c1 and TNFc2c2, and heterozygote TNFc1c2). The genotype distribution fit Hardy-Weinberg equilibrium. The frequency of TNFc1 microsatellite allele was significantly higher in patients with severe sepsis (79%) than in healthy individuals (71%) (P<0.05). The frequency of heterozygote TNFc1c2 was significantly higher in non-surviving patients (46%) with severe sepsis than in survivors (27%) (P<0.05). Conclusions TNFc microsatellite polymorphism is significantly associated with the incidence and outcome of severe postoperative sepsis.
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Key words：Infection; Tumor necrosis factor; Genes; Polymorphism, restriction fragment length
人肿瘤坏死因子(TNF)基因的多态性和TNF信使RNA表达及蛋白质水平相关联，TNF基因多态性在一定程度上决定个体的TNF分泌水平，而血浆TNF水平与个体对严重全身感染易感性及预后密切相关[1，2]。微卫星 TNFc位于TNF基因的第1内含子中，已证实TNFc微卫星多态性与TNF蛋白质水平及免疫炎症性疾病相关联[2，3]。我们对TNFc微卫星多态性与术后严重全身感染易感性及预后进行了相关性研究。
对象和方法
一、对象
122例严重全身感染的外科手术后患者均来自本院，符合1992年美国胸科医师学会(ACCP)和危重医学会(SCCM)联席会议诊断标准[4]。其中男70例，女52例，平均年龄57岁。入加强医疗病房(ICU)24 h内的急性生理和既往健康评分(APACHE Ⅱ)[5]为 22.3±1.4。122例中 63例存活，59例死亡。138名相互间无血缘关系的正常人，来自血库不同时期的献血员。
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二、方法
1.DNA标本：外周血单核细胞DNA的提取采用标准的酚-氯仿法。
2.引物：自行设计寡核甘酸序列：(+)5′-AGAGACGTTCAGGTGGTGTCAT-3′和(-)5′-GGGGTT -TCTCTGACTGCATCTT-3′，德国Biosource公司合成。
3.试剂： dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP为瑞典 Pharmacia Biotech公司产品， AmpliTaqDNA多聚酶(附有缓冲剂)为美国 Perkin-Elmer公司产品。
4.PCR反应：总体积为20 μl的反应液，内含引物(20 pmol)、脱氧核糖核苷酸(dNTP，每种200 μmol)、AmpliTaqDNA多聚酶(1单位)、模板DNA(50 ng)及反应缓冲液，于美国 Perkin-Elmer公司 DNA扩增仪2 400上扩增。扩增条件：95℃ 5 min；95℃ 10 s，68℃ 30 s，72℃ 30 s，总共29个循环；然后72℃ 10 min，4℃贮存待鉴定。
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5.PCR产品鉴定及分析：取5 μl扩增产物加3 μl上样缓冲液，95℃变性5 min后，进行体积分数为8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳条件：1×电泳缓冲液，电压1 700 V，恒定功率70 W，时间2.5 h，保持凝胶温度在45～50℃。以PUC19限制性内切酶MspI为DNA片段长度参考物。电泳结束后，按Sambrook等[6]方法进行改良凝胶银染色，观察并分析结果。
6.统计学处理：差异显著性检验采用χ2检验(四格表确切概率法)。
结果
TNFc微卫星多态性见图1。TNFc微卫星多态性含有2个等位基因片段：TNFc1(179 bp)和TNFc2(181 bp)，3种基因型：纯合子TNFc1c1、TNFc2c2及杂合子TNFc1c2。TNFc微卫星多态性等位基因片段及基因型在术后感染组和对照组中的分布情况见表1。TNFc微卫星多态性在2组中的分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ2值分别为0.24和0.46，P值分别为 0.89和0.79)。TNFc1等位基因频率在术后感染组为0.79，对照组为0.71(χ2值 =5.45，P=0.02)，基因型TNFc1c1纯合子的频率在术后感染组为0.61，对照组为0.49，差异无显著意义(χ2=4.70，P=0.09)。在TNFc微卫星多态性与严重全身感染的预后的相关分析中，因纯合子TNFc 2c2的例数过少，我们仅比较c1c1纯合子与c1c2杂合子的频率在存活和死亡患者中的差异，观察到基因型TNFc1c2的频率在术后并发严重全身感染的患者死亡组中为46%，存活组为27%(χ2=4.79，P=0.03)。TNFc2等位基因频率在死亡组中为26%，存活组为17%，但差异无显著意义(χ2=3.35，P=0.07)。
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1，2：TNFc2/2纯合子；3，4：TNFc1/2杂合子；5，6：TNFc1/1纯合子；7：DNA片段长度参考物
图1 6个不同个体的肿瘤坏死因子C(TNFc)微卫星多态性
表1 两组对象的肿瘤坏死因子微卫星等位基因分布情况(%) 组别
例数
基因型频率(%)
等位基因频率(%)
1/1
1/2
2/2
1
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2
对照组
138
0.49
0.44
0.07
0.71
0.29
患者组
122
0.61▲
0.36
0.03
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0.79*
0.21
死亡组
59
0.51
0.46△△
0.03
0.74
0.26△
存活组
63
0.70
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0.27
0.03
0.83
0.17
注：与对照组比较χ2=5.45，P<0.02；与对照组比较▲χ2=4.70，P＝0.09；与存活组比较△χ2=3.35，P=0.07；与存活组比较△△χ2=4.79，P=0.03
讨论
严重全身感染是ICU危重患者死亡的主要原因之一，病死率高达30%～50%[7，8]。大量的 TNF产生可促发全身炎症反应综合征( SIRS)、全身感染及后续症的发展，血浆中高的 TNF水平与严重全身感染的预后呈正相关[1]。目前国际上抗TNF单抗在严重全身感染和多器官功能障碍综合征(MODS)患者中的临床治疗效果未能肯定。抗TNF单抗的失败与患者个体TNF表达水平的复杂性相关联。抗TNF单抗的治疗有益于血浆中TNF水平高的严重全身感染患者，但不适于TNF等致炎因子产生不足的患者。
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本研究观察到，术后并发严重全身感染患者中TNFc1等位基因分布频率明显增加，这可能是携带TNFc1等位基因的个体有低水平的TNF分泌倾向性，由于因微生物入侵、局部感染后，低水平的TNF介导的细胞免疫不足以局限炎症反应，故而携带TNFc1等位基因的个体易患严重全身感染。在术后并发严重全身感染的死亡组中，基因型TNFc1c2的频率明显高于TNFc1c1的频率，这可能与TNFc1c2的患者较TNFc1c1的患者有相对高的促炎症连锁放大的遗传性有关，TNF分泌的遗传性可能与严重全身感染的病理过程有关。TNF微卫星多态性在严重全身感染中的作用尚有待进一步阐明。
本研究表明，TNFc微卫星多态性与术后严重全身感染的易感性及预后密切相关。TNFc1等位基因可能是易患严重全身感染的遗传标志之一。基因型TNFc1c2与严重全身感染后的死亡可能密切相关，TNFc微卫星多态性在术后严重全身感染的免疫调节治疗中有一定参考价值。
参考文献：
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1 Stueber F, Petersen M, Bokelmann F, et al. A genomic polymorphism within the tumor necrosis factor locus influences plasma tumor necrosis factor-alpha concentrations and outcome of patients with severe sepsis. Crit Care Med, 1996, 24:381-384.
2 Pociot F, Briant L, Jongeneel CV, et al. Association of tumor necrosis factor (TNF) and class II major histocompatibility complex alleles with the secretion of TNF-alpha and TNF-beta by human mononuclear cells: a possible link to insulin-dependent diabetes mellitus. Eur J Immunol ,1993, 23:224-231.
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3 Khoo SH, Pepper L, Snowden N, et al. Tumour necrosis factor c2 microsatellite allele is associated with the rate of HIV disease progression. AIDS, 1997, 11: 423-428.
4 Bone RC, Balk RA, Cerra FB, et al. American college of chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference Committee: American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference.Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. Crit Care Med , 1992 ,20:864-874.
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5 Knaus WA, Draper EA, Wagner DP, et al. APACHE II: a severity of disease classification system. Crit Care Med, 1985, 13:818-829.
6 Sambrook J, Fritsh EF, Maniatis T. Molecular Cloning. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.1856-1857.
7 Pittet D, Rangel-Frausto S, Li N, et al. Systemic inflammatory response syndrom, Sepsis, severe Sepsis and septic shock: incidence, morbidities and outcomes in surgical ICU patients. Intensive Care Med,1995,21: 302-309.
8 邱海波,杜斌,刘大为,等.全身炎症反应综合征与多器官功能障碍综合征的临床研究.中华外科杂志,1997, 35: 402-405.
收稿日期：1999-04-01, 百拇医药