脂多糖刺激肺血管内巨噬细胞环氧合酶-2表达的意义
作者：伍伟玲 陈正堂 蔡恩齐 罗显荣 李胜亮
单位：伍伟玲(解放军第四五八医院呼吸内科，广州，510602)；陈正堂 蔡恩齐 罗显荣 李胜亮(第三军医大学附属新桥医院全军肿瘤中心 400037 重庆)
关键词：脂多糖类；巨噬细胞，肺血管内；前列腺素；肺损伤，急性
中华创伤杂志000308摘 要：目的 探讨脂多糖(LPS)对肺血管内巨噬细胞(PIM)环氧合酶-2(COX-2)的作用及意义。 方法 改良法分离、培养猪PIM，以LPS(10 μg/ml)刺激，反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测COX-2 mRNA的变化；免疫组化染色法观察COX-2酶蛋白的改变；放射免疫分析法(RIA)测定前列腺素E2(PGE2)变化，以间接显示COX活性的改变。 结果 LPS刺激后，PIM COX-2 mRNA和酶蛋白表达及PGE2浓度急剧增加，显著高于对照组(P<0.01)；COX-2酶蛋白表达与细胞上清PGE2含量呈正相关(r=0.94，P<0.01)。 结论 LPS刺激后，PIM COX-2诱导性表达，导致前列腺素(PGs)大量合成和释放，可能在急性肺损伤 (ALI)的发病中起重要作用。
, 百拇医药
Changes of cyclooxygenase-2 in pulmonary intravascular macrophages stimulated by lipopolysaccharides
WU Weiling CHEN Zhengtang CAI Enqi, et al.
(Cancer Center of PLA, Xingqiao Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400037, China)
Abstract：Objective To study the changes of cyclooxygenase-2 (COX-2) in pulmonary intravascular macrophages (PIMs) stimulated by lipopolysaccharides (LPS). Methods With modification, porcine PIMs were isolated, cultured and stimulated by LPS (10 μg/ml). The changes of COX-2 mRNA was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The changes of enzyme protein of COX-2 were observed with a method of immunohistochemistry stain. The content of prostaglandin E2 (PGE2) in the supernatant of PIMs was measured by radio-immunoassay (RIA) so as to indirectly show activity change of COX. Results With LPS stimulation, the expression of PIMs, COX-2 mRNA, enzyme protein and the levels of PGE2 were increased more rapidly than those in the control group (P<0.01). Positive correlation was found between the expression of COX-2 enzyme protein and the content of PGE2 (r=0.94,P<0.01). Conclusions After stimulation of LPS, the synthesis and release of PGs caused by inducible expression of COX-2 in PIMs might play an important role in development of acute lung injury (ALI).
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Key words：Lipopolysaccharides； Macrophages, pulmonary intravascular； Prostaglandins; Lung injuries, acute▲
肺血管内巨噬细胞(pulmonary intravascular macrophage, PIM)为位于肺泡壁毛细血管腔内的肺内单核/巨噬细胞成员之一[1]，吞噬、分泌功能非常活跃。Bertram等[2]曾发现，PIM可经环氧合酶(cyclooxygenase，COX)代谢花生四烯酸(arcachidonic acid，AA)，释放AA代谢产物(AAM)等炎症介质。Wilbom等[3]报告COX有两型，其中COX-1起生理调节作用； COX-2为诱导型，在脂多糖(LPS)等的刺激下，可大量释放AAM，在机体的炎症反应中起重要作用；并发现肺泡巨噬细胞有COX-2表达。但PIM是否同时存在两型COX，并在急性肺损伤(ALI)等急性炎症性疾病中发挥作用,报道甚少。笔者报告LPS刺激猪PIM后，其COX-2 mRNA和酶蛋白表达量及COX-2活性的改变，进而探讨ALI的发病机制。
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材料与方法
1. 猪PIM的分离、培养：按李胜亮等[4]报告的方法，并行下列改良：一是开胸后不取出心肺，行原位肺灌洗；二是含氯化钙的灌洗液临用前才配制，避免沉淀物影响肺血管灌洗。
2. 实验分组及标本收集 ： 吹打下经常规培养2 h后的猪(重庆地区杂种猪)PIM。分为对照组：PIM在无血清的RPMI 1640(Sigma公司，美国)中培养; LPS组：向培养基中加入10 μg/ml 的LPS (escherichia coli serotype 055:B5，Sigma公司，美国)以刺激细胞。检测COX-2 mRNA表达时，收集刺激后0.5,1,2,4,6和8 h 的细胞待测；观察酶蛋白表达和前列腺素E2(PGE2)含量时，则增加12，16，20和24 h 等时相点。
3.COX-2 mRNA检测：用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法。用总RNA提取试剂盒(宝灵曼公司，德国)，一步热酚法提取细胞总RNA。取总RNA 1 μg ，65℃变性5 min，依次加入0.5 μg oligo-dT15(Promega公司，美国)，4 μl 5×RT-PCR合成酶缓冲液(systhese buffer，含Mg2+ 2.5 mmol/L)(Promega公司，美国)，0.125 mmol/L dNTP,10 U反转录酶(AMV),0.01 mmol/L DTT, 40 U RNAase抑制剂，总体积为20 μl。42℃孵育60 min，95℃ 10 min 终止反应,完成cDNA第一链的合成。PCR时， COX-2寡核苷酸引物合成根据Lee等[5]的设计合成。 正义引物：5′-ACTCACTCAGTTTGTTGAGTCATTC-3′。 反义引物：5′-TTTGATTAGTACTGTAGGGTTAATG-3′，用这对引物可特异性扩增出583 bp的COX-2 cDNA序列。为进行质控，每次行RT-PCR时，都对应扩增次黄嘌呤磷酸转移酶(HPRT)作为外对照。HPRT寡核苷酸引物根据Osawa等[6]的设计合成。正义引物：5′-GCTGGTGAAAAGGACCTCTCG-3′， 反义引物：5′-GCAGATGGCCACAGGACTAGA-3′。用这对引物可特异性扩增出258 bp 的HPRT cDNA序列。取1 μl反转录反应液，分别加入5 μl 10×PCR缓冲液 ，1.75 mmol/L Mg2+,0.2 mmol/L dNTP,0.4 μmol/L COX-2或HPRT寡核苷酸引物，5个单位 Taq DNA聚合酶，总反应体积为50 μl，一式三管。PCR反应所需变性、退火和延伸温度分别为94℃，55℃和72℃，反应时间均为1 min，共循环30次。首次94℃下循环需2 min。反应完成后取5 μl PCR反应产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳。以PCR maker为分子量标准，对电泳黑白照片进行密度扫描，测其积分吸光度值。
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4. COX-2酶蛋白的检测：采用链霉抗生素蛋白-过氧化物酶连结法(streptavidin-peroxidase conjugated method )[7]。取刺激后0.5，1，2，4，6，8，12，16，20和24 h的细胞 ，加羊抗鼠COX-2多克隆抗体(一抗，中山公司),4℃过夜；再加生物素标记兔抗山羊IgG(二抗，中山公司)，37℃温育0.5 h,DAB显色5 min。阴性对照时一抗用0.01 mol/L PBS代替。染色后光镜下作定性观察，在图像分析系统上作定量分析。在每帧图像上随机取10个细胞的积分吸光度值代表免疫反应强度。
5. PIM上清PGE2浓度测定：采用放射免疫法。调PIM为5×106/ml，如上施以刺激；离心，PBS洗2次；加入含30 μmol/L AA的新鲜RPMI 1640培养液，培养10 min；离心,留取上清液,用3H标计的PGE2测量试剂盒 (购自解放军第三O一医院) 检测，操作方法按说明书进行。
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6.统计学分析：实验数据以
±s表示，行双因素方差分析和相关分析处理。
结 果
1. LPS刺激前后PIM COX-2 mRNA的变化：两组PIM HPRT mRNA表达恒定,无显著性差异,表明该实验方法可靠，结果具有可比性。正常对照组PIM COX-2 mRNA无表达。LPS刺激后，COX-2 mRNA从刺激后0.5 h起即增加，4 h达峰值，各时相点均显著高于对照组(P<0.01)。见图1，表1。
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图1 LPS组COX-2mRNA表达(特异性COX-2片段为583 bp,表达峰值在LPS刺激后4 h) RT-PCR
表1 LPS刺激后PIM COX-2 mRNA 表达分析(±s) 组别
猪数
LPS刺激后时间(h)
0.5
1
2
4
6
, 百拇医药
8
对照组
8
0.50±0.05
0.56±0.04
0.63±0.09
0.55±0.07
0.55±0.01
0.54±0.01
LPS组
8
25.03±1.68*
, 百拇医药
49.35±12.87*
60.94±10.5*
87.93±1.61*
64.05±2.07*
34.96±2.24*
与对照组比较：*P<0.01 2. LPS刺激前后PIM COX-2 酶蛋白的变化：对照组几乎无表达。LPS刺激后， COX-2酶蛋白从0.5 h起增加，峰值在刺激后12 h，各时相点显著高于对照组(P<0.01)。见图2，表2。
表2 LPS刺激后PIM COX-2免疫组化分析(±s) 组别
, 百拇医药
猪数
LPS刺激后的时间(h)
0.5
1
2
4
6
8
12
16
20
24
对照组
, 百拇医药 8
3.29±
4.56±
5.15±
5.8±
5.79±
5.14±
4.28±
5.69±
6.30±
6.67±
2.34
3.26
, 百拇医药
3.33
3.34
2.53
2.46
2.54
3.61
2.24
4.22
LPS组
8
26.50±
28.64±
35.22±
, 百拇医药
38.83±
60.63±
87.12±
101.73±
82.73±
61.68±
47.59±
9.63*
8.61*
6.70*
10.68*
, http://www.100md.com 14.24*
16.49*
17.31*
17.13*
10.32*
17.00*
与对照组比较：*P<0.01
图2 LPS刺激后12 h PIM COX-2酶蛋白免疫组化(核周、胞浆、胞膜上呈棕褐色阳性着色 ×200)
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3. LPS刺激前后PIM上清PGE2浓度的变化：对照组无变化(P<0.05)。LPS刺激后，各时相点PGE2均显著高于对照组(P<0.01)，且其变化与COX-2 酶蛋白的变化趋势一致，两者呈显著性正相关(r=0.94, P<0.01)。见表3。
表3 LPS刺激后PIM PGE2放射免疫法测定结果(ng/ml，±s) 组别
猪数
LPS刺激后的时间(h)
0.5
1
, http://www.100md.com
2
4
6
8
12
16
20
24
对照组
8
1.47±
1.40±
1.45±
1.42±
, 百拇医药
1.39±
1.41±
1.36±
1.33±
1.35±
1.40±
0.09
0.03
0.06
0.04
0.04
0.06
0.04
, 百拇医药
0.01
0.01
0.06
LPS组
8
2.74±
3.49±
4.71±
4.99±
6.34±
6.76±
8.85±
6.41±
, 百拇医药
5.73±
4.95±
0.08*
0.24*
0.02*
0.58*
1.76*
0.75*
0.10*
0.18*
1.22*
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1.17*
与对照组比较：*P<0.01讨 论
PIMs是肺巨噬细胞亚型之一，经黏附斑块黏附于毛细血管内皮细胞表面，与血流有广泛的接触面积。PIM通过吞噬和消化肺循环中的细菌等微生物,形成肺的第一道防线，同时其本身亦被激活。李胜亮等[8]报告，在LPS的刺激下，PIM可释放多种细胞因子或炎症介质如白介素-1，6，8和TNF-α等。提示在严重的血源性感染的情况下，PIM可能参与ALI和全身炎症反应综合征(SIRS)的发病；而且，由于其处在首先被激活的特殊部位，可能在ALI的始动环节中起重要作用。
在本实验中观察到，在未刺激的正常状态下，PIM的COX-2 mRNA及酶蛋白无表达，其主要代谢产物PGE2的水平低且恒定；而LPS(10 μg/ml)刺激后，PIM COX-2 mRNA、酶蛋白表达及其培养上清液中PGE2 含量大量增加。结合Bertram等[2]的实验结果(即PIM可在无刺激的情况下，经COX代谢产生AAM)表明，PIM同时存在COX-1和COX-2 ；而COX-2酶蛋白的表达与PGE2 浓度变化趋势一致，且呈显著正相关(r=0.94, P<0.01)，表明LPS刺激PIM所致的PGE2增加主要是由COX-2表达增加所致,可能与COX-1关系不大。Lee等[5]用LPS刺激肺泡巨噬细胞，发现刺激前后COX-1无显著性变化，而COX-2则大量诱导性表达 ，更进一步证明了这一点。COX是AA代谢通路中的第一限速酶。COX-2的大量表达，导致TXA2 、TXB2和PGE2 等代谢产物大量合成释放，在整体情况下，导致AAM间的失衡，引起白细胞活化、血管通透性增加等一系列病理生理改变，诱导或加重失控性炎症反应。因此，本实验结果提示，在LPS等致病因子的作用下，PIM通过COX-2的诱导性表达，在ALI等机体的急性炎症性疾病的发病中起重要作用；选择性抑制COX-2的表达及活性，可能有助于改善机体的炎症反应，给ALI的治疗带来新的途径。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670311)
参考文献：
[1]Warner AE, Brajn JD. The cell biology and pathogenic role of pulmonary intravascular macrophage. Am J Physiol, 1990, 258:L1-L2.
[2]Bertram TA, Overby LH, Danitowicz R, et al. Pulmonary intravascular macrophages metabolize arachidonic acid. Am Rev Respir Dis， 1988, 138:936-940.
[3]Wilborn J,Dewitt DL,Peters-Golden M. Expression and role of cyclooxygenase isoforms in alveolar and peritoneal macrophage. Am Physiol, 1995, 268:294-301.
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[4]李胜亮，陈正堂，金敬顺.肺血管内巨噬细胞的分离、培养及鉴定.中华病理学杂志， 1998， 27：66-67.
[5]Lee SH, Soyoola E, Chanmugam D, et al. Selective expression of Mitogen-inducible cyclooxygenase in macrophages stimulated with Lipopolysaccharide. J Biol Chem, 1992, 267:25934-25938.
[6]Osawa M, Hamada HI, Hamade H, et al. Long term lymphopematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science， 1996, 273:242-245.
[7]蔡文琴，王伯沄，主编.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术.第1版.成都：四川科学技术出版社, 1994. 91-94.
[8]李胜亮，陈正堂，金敬顺.脂多糖致肺血管内巨噬细胞形态和功能的改变.中华结核和呼吸杂志, 1998， 3：167-169.
收稿日期：1998-11-08, 百拇医药
单位：伍伟玲(解放军第四五八医院呼吸内科，广州，510602)；陈正堂 蔡恩齐 罗显荣 李胜亮(第三军医大学附属新桥医院全军肿瘤中心 400037 重庆)
关键词：脂多糖类；巨噬细胞，肺血管内；前列腺素；肺损伤，急性
中华创伤杂志000308摘 要：目的 探讨脂多糖(LPS)对肺血管内巨噬细胞(PIM)环氧合酶-2(COX-2)的作用及意义。 方法 改良法分离、培养猪PIM，以LPS(10 μg/ml)刺激，反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测COX-2 mRNA的变化；免疫组化染色法观察COX-2酶蛋白的改变；放射免疫分析法(RIA)测定前列腺素E2(PGE2)变化，以间接显示COX活性的改变。 结果 LPS刺激后，PIM COX-2 mRNA和酶蛋白表达及PGE2浓度急剧增加，显著高于对照组(P<0.01)；COX-2酶蛋白表达与细胞上清PGE2含量呈正相关(r=0.94，P<0.01)。 结论 LPS刺激后，PIM COX-2诱导性表达，导致前列腺素(PGs)大量合成和释放，可能在急性肺损伤 (ALI)的发病中起重要作用。
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Changes of cyclooxygenase-2 in pulmonary intravascular macrophages stimulated by lipopolysaccharides
WU Weiling CHEN Zhengtang CAI Enqi, et al.
(Cancer Center of PLA, Xingqiao Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400037, China)
Abstract：Objective To study the changes of cyclooxygenase-2 (COX-2) in pulmonary intravascular macrophages (PIMs) stimulated by lipopolysaccharides (LPS). Methods With modification, porcine PIMs were isolated, cultured and stimulated by LPS (10 μg/ml). The changes of COX-2 mRNA was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The changes of enzyme protein of COX-2 were observed with a method of immunohistochemistry stain. The content of prostaglandin E2 (PGE2) in the supernatant of PIMs was measured by radio-immunoassay (RIA) so as to indirectly show activity change of COX. Results With LPS stimulation, the expression of PIMs, COX-2 mRNA, enzyme protein and the levels of PGE2 were increased more rapidly than those in the control group (P<0.01). Positive correlation was found between the expression of COX-2 enzyme protein and the content of PGE2 (r=0.94,P<0.01). Conclusions After stimulation of LPS, the synthesis and release of PGs caused by inducible expression of COX-2 in PIMs might play an important role in development of acute lung injury (ALI).
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Key words：Lipopolysaccharides； Macrophages, pulmonary intravascular； Prostaglandins; Lung injuries, acute▲
肺血管内巨噬细胞(pulmonary intravascular macrophage, PIM)为位于肺泡壁毛细血管腔内的肺内单核/巨噬细胞成员之一[1]，吞噬、分泌功能非常活跃。Bertram等[2]曾发现，PIM可经环氧合酶(cyclooxygenase，COX)代谢花生四烯酸(arcachidonic acid，AA)，释放AA代谢产物(AAM)等炎症介质。Wilbom等[3]报告COX有两型，其中COX-1起生理调节作用； COX-2为诱导型，在脂多糖(LPS)等的刺激下，可大量释放AAM，在机体的炎症反应中起重要作用；并发现肺泡巨噬细胞有COX-2表达。但PIM是否同时存在两型COX，并在急性肺损伤(ALI)等急性炎症性疾病中发挥作用,报道甚少。笔者报告LPS刺激猪PIM后，其COX-2 mRNA和酶蛋白表达量及COX-2活性的改变，进而探讨ALI的发病机制。
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材料与方法
1. 猪PIM的分离、培养：按李胜亮等[4]报告的方法，并行下列改良：一是开胸后不取出心肺，行原位肺灌洗；二是含氯化钙的灌洗液临用前才配制，避免沉淀物影响肺血管灌洗。
2. 实验分组及标本收集 ： 吹打下经常规培养2 h后的猪(重庆地区杂种猪)PIM。分为对照组：PIM在无血清的RPMI 1640(Sigma公司，美国)中培养; LPS组：向培养基中加入10 μg/ml 的LPS (escherichia coli serotype 055:B5，Sigma公司，美国)以刺激细胞。检测COX-2 mRNA表达时，收集刺激后0.5,1,2,4,6和8 h 的细胞待测；观察酶蛋白表达和前列腺素E2(PGE2)含量时，则增加12，16，20和24 h 等时相点。
3.COX-2 mRNA检测：用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法。用总RNA提取试剂盒(宝灵曼公司，德国)，一步热酚法提取细胞总RNA。取总RNA 1 μg ，65℃变性5 min，依次加入0.5 μg oligo-dT15(Promega公司，美国)，4 μl 5×RT-PCR合成酶缓冲液(systhese buffer，含Mg2+ 2.5 mmol/L)(Promega公司，美国)，0.125 mmol/L dNTP,10 U反转录酶(AMV),0.01 mmol/L DTT, 40 U RNAase抑制剂，总体积为20 μl。42℃孵育60 min，95℃ 10 min 终止反应,完成cDNA第一链的合成。PCR时， COX-2寡核苷酸引物合成根据Lee等[5]的设计合成。 正义引物：5′-ACTCACTCAGTTTGTTGAGTCATTC-3′。 反义引物：5′-TTTGATTAGTACTGTAGGGTTAATG-3′，用这对引物可特异性扩增出583 bp的COX-2 cDNA序列。为进行质控，每次行RT-PCR时，都对应扩增次黄嘌呤磷酸转移酶(HPRT)作为外对照。HPRT寡核苷酸引物根据Osawa等[6]的设计合成。正义引物：5′-GCTGGTGAAAAGGACCTCTCG-3′， 反义引物：5′-GCAGATGGCCACAGGACTAGA-3′。用这对引物可特异性扩增出258 bp 的HPRT cDNA序列。取1 μl反转录反应液，分别加入5 μl 10×PCR缓冲液 ，1.75 mmol/L Mg2+,0.2 mmol/L dNTP,0.4 μmol/L COX-2或HPRT寡核苷酸引物，5个单位 Taq DNA聚合酶，总反应体积为50 μl，一式三管。PCR反应所需变性、退火和延伸温度分别为94℃，55℃和72℃，反应时间均为1 min，共循环30次。首次94℃下循环需2 min。反应完成后取5 μl PCR反应产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳。以PCR maker为分子量标准，对电泳黑白照片进行密度扫描，测其积分吸光度值。
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4. COX-2酶蛋白的检测：采用链霉抗生素蛋白-过氧化物酶连结法(streptavidin-peroxidase conjugated method )[7]。取刺激后0.5，1，2，4，6，8，12，16，20和24 h的细胞 ，加羊抗鼠COX-2多克隆抗体(一抗，中山公司),4℃过夜；再加生物素标记兔抗山羊IgG(二抗，中山公司)，37℃温育0.5 h,DAB显色5 min。阴性对照时一抗用0.01 mol/L PBS代替。染色后光镜下作定性观察，在图像分析系统上作定量分析。在每帧图像上随机取10个细胞的积分吸光度值代表免疫反应强度。
5. PIM上清PGE2浓度测定：采用放射免疫法。调PIM为5×106/ml，如上施以刺激；离心，PBS洗2次；加入含30 μmol/L AA的新鲜RPMI 1640培养液，培养10 min；离心,留取上清液,用3H标计的PGE2测量试剂盒 (购自解放军第三O一医院) 检测，操作方法按说明书进行。
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6.统计学分析：实验数据以
±s表示，行双因素方差分析和相关分析处理。结 果
1. LPS刺激前后PIM COX-2 mRNA的变化：两组PIM HPRT mRNA表达恒定,无显著性差异,表明该实验方法可靠，结果具有可比性。正常对照组PIM COX-2 mRNA无表达。LPS刺激后，COX-2 mRNA从刺激后0.5 h起即增加，4 h达峰值，各时相点均显著高于对照组(P<0.01)。见图1，表1。
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图1 LPS组COX-2mRNA表达(特异性COX-2片段为583 bp,表达峰值在LPS刺激后4 h) RT-PCR
表1 LPS刺激后PIM COX-2 mRNA 表达分析(
±s) 组别猪数
LPS刺激后时间(h)
0.5
1
2
4
6
, 百拇医药
8
对照组
8
0.50±0.05
0.56±0.04
0.63±0.09
0.55±0.07
0.55±0.01
0.54±0.01
LPS组
8
25.03±1.68*
, 百拇医药
49.35±12.87*
60.94±10.5*
87.93±1.61*
64.05±2.07*
34.96±2.24*
与对照组比较：*P<0.01 2. LPS刺激前后PIM COX-2 酶蛋白的变化：对照组几乎无表达。LPS刺激后， COX-2酶蛋白从0.5 h起增加，峰值在刺激后12 h，各时相点显著高于对照组(P<0.01)。见图2，表2。
表2 LPS刺激后PIM COX-2免疫组化分析(
±s) 组别, 百拇医药
猪数
LPS刺激后的时间(h)
0.5
1
2
4
6
8
12
16
20
24
对照组
, 百拇医药 8
3.29±
4.56±
5.15±
5.8±
5.79±
5.14±
4.28±
5.69±
6.30±
6.67±
2.34
3.26
, 百拇医药
3.33
3.34
2.53
2.46
2.54
3.61
2.24
4.22
LPS组
8
26.50±
28.64±
35.22±
, 百拇医药
38.83±
60.63±
87.12±
101.73±
82.73±
61.68±
47.59±
9.63*
8.61*
6.70*
10.68*
, http://www.100md.com 14.24*
16.49*
17.31*
17.13*
10.32*
17.00*
与对照组比较：*P<0.01
图2 LPS刺激后12 h PIM COX-2酶蛋白免疫组化(核周、胞浆、胞膜上呈棕褐色阳性着色 ×200)
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3. LPS刺激前后PIM上清PGE2浓度的变化：对照组无变化(P<0.05)。LPS刺激后，各时相点PGE2均显著高于对照组(P<0.01)，且其变化与COX-2 酶蛋白的变化趋势一致，两者呈显著性正相关(r=0.94, P<0.01)。见表3。
表3 LPS刺激后PIM PGE2放射免疫法测定结果(ng/ml，
±s) 组别猪数
LPS刺激后的时间(h)
0.5
1
, http://www.100md.com
2
4
6
8
12
16
20
24
对照组
8
1.47±
1.40±
1.45±
1.42±
, 百拇医药
1.39±
1.41±
1.36±
1.33±
1.35±
1.40±
0.09
0.03
0.06
0.04
0.04
0.06
0.04
, 百拇医药
0.01
0.01
0.06
LPS组
8
2.74±
3.49±
4.71±
4.99±
6.34±
6.76±
8.85±
6.41±
, 百拇医药
5.73±
4.95±
0.08*
0.24*
0.02*
0.58*
1.76*
0.75*
0.10*
0.18*
1.22*
, http://www.100md.com
1.17*
与对照组比较：*P<0.01讨 论
PIMs是肺巨噬细胞亚型之一，经黏附斑块黏附于毛细血管内皮细胞表面，与血流有广泛的接触面积。PIM通过吞噬和消化肺循环中的细菌等微生物,形成肺的第一道防线，同时其本身亦被激活。李胜亮等[8]报告，在LPS的刺激下，PIM可释放多种细胞因子或炎症介质如白介素-1，6，8和TNF-α等。提示在严重的血源性感染的情况下，PIM可能参与ALI和全身炎症反应综合征(SIRS)的发病；而且，由于其处在首先被激活的特殊部位，可能在ALI的始动环节中起重要作用。
在本实验中观察到，在未刺激的正常状态下，PIM的COX-2 mRNA及酶蛋白无表达，其主要代谢产物PGE2的水平低且恒定；而LPS(10 μg/ml)刺激后，PIM COX-2 mRNA、酶蛋白表达及其培养上清液中PGE2 含量大量增加。结合Bertram等[2]的实验结果(即PIM可在无刺激的情况下，经COX代谢产生AAM)表明，PIM同时存在COX-1和COX-2 ；而COX-2酶蛋白的表达与PGE2 浓度变化趋势一致，且呈显著正相关(r=0.94, P<0.01)，表明LPS刺激PIM所致的PGE2增加主要是由COX-2表达增加所致,可能与COX-1关系不大。Lee等[5]用LPS刺激肺泡巨噬细胞，发现刺激前后COX-1无显著性变化，而COX-2则大量诱导性表达 ，更进一步证明了这一点。COX是AA代谢通路中的第一限速酶。COX-2的大量表达，导致TXA2 、TXB2和PGE2 等代谢产物大量合成释放，在整体情况下，导致AAM间的失衡，引起白细胞活化、血管通透性增加等一系列病理生理改变，诱导或加重失控性炎症反应。因此，本实验结果提示，在LPS等致病因子的作用下，PIM通过COX-2的诱导性表达，在ALI等机体的急性炎症性疾病的发病中起重要作用；选择性抑制COX-2的表达及活性，可能有助于改善机体的炎症反应，给ALI的治疗带来新的途径。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670311)
参考文献：
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[2]Bertram TA, Overby LH, Danitowicz R, et al. Pulmonary intravascular macrophages metabolize arachidonic acid. Am Rev Respir Dis， 1988, 138:936-940.
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[4]李胜亮，陈正堂，金敬顺.肺血管内巨噬细胞的分离、培养及鉴定.中华病理学杂志， 1998， 27：66-67.
[5]Lee SH, Soyoola E, Chanmugam D, et al. Selective expression of Mitogen-inducible cyclooxygenase in macrophages stimulated with Lipopolysaccharide. J Biol Chem, 1992, 267:25934-25938.
[6]Osawa M, Hamada HI, Hamade H, et al. Long term lymphopematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science， 1996, 273:242-245.
[7]蔡文琴，王伯沄，主编.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术.第1版.成都：四川科学技术出版社, 1994. 91-94.
[8]李胜亮，陈正堂，金敬顺.脂多糖致肺血管内巨噬细胞形态和功能的改变.中华结核和呼吸杂志, 1998， 3：167-169.
收稿日期：1998-11-08, 百拇医药