大黄对烫伤后肝脏内肿瘤坏死因子基因表达的影响
作者：陈德昌 杨兴易 景炳文 李红江
单位：第二军医大学附属长征医院急救科、解放军急救医学中心 200003 上海
关键词：烧伤；肿瘤坏死因子；内毒素；肝；大黄
中华创伤杂志000307摘 要：目的 研究大黄对烫伤后肝脏内肿瘤坏死因子(TNF-α)基因表达的影响。 方法 应用随机、前瞻性研究方法，采用大鼠烫伤模型。烫伤后12 h给予内毒素行“二次打击”，观察大黄对肝脏内TNF-α基因表达的影响，以及对体内TNF-α和门、体静脉血内内毒素的清除作用。
结果 正常对照组和单纯烫伤组肝脏内TNF-α没有明显表达，血浆和肝脏内未测到TNF-α蛋白。“二次打击”后肝内TNF-α基因表达明显增加，且血浆和肝组织内TNF-α浓度显著提高。大黄可明显抑制肝脏内TNF-α基因表达，降低血浆和肝组织内TNF-α含量。烫伤可使肠道内内毒素吸收入血，“二次打击”后门、体静脉血内内毒素浓度更高。大黄治疗后门、体静脉血内内毒素浓度显著下降。 结论 大黄可抑制烫伤和后继“二次打击”后肝脏内TNF-α基因表达，促进体内内毒素清除。
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Effect of rhubarb on gene expression of tumor necrosis factor in liver after scald
CHEN Dechang YANG Xinyi JING Bingwen, et al.
(Emergency center, Changzheng Hospital, The Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
Abstract：Objective To test action of rhubarb on gene expression of tumor necrosis factor-α (TNF-α) after liver scald. Methods The model rats with scald were used. Endotoxin at a dose of 20 mg/kg was continuously infused a “second hit” at 12 hours after scald. Through prospective and random way of experiment, the effect of rbubarb on gene expression of TNF-α in liver was detected. The clearing action of rhubarb on endotoxin in portal and femoral blood was also measured. Results There was little gene expression of TNF-α in normal control and scald group. Furthermore, TNF-α protein was not detected in serum and liver in those two groups. However, the “second hit" could promote gene expression of TNF-α. The concentration of TNF-α in serum and hepatic tissues were increased significantly. Rhubarb obviously inhibited gene expression of TNF-α in liver and lowered the concentration of TNF-α in serum and hepatic tissues. The burn injury damaged the gut barrier and resulted in absorption of endotoxin into the gut. The “second hit" made the concentration of endotoxin in both of the portal and femoral blood increased. Rhubarb could reduce the endotoxin level in both blood. Conclusions Rhubarb can inhibit scald and gene expression of TNF-α in liver following the second hit and promote the clearance of endotoxin.
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Key words：Burns； Tumor necrosis factors； Endotoxins; Liver; Rhubarb▲
肠-肝-肺轴对创伤后系统炎症反应的转归有重要作用。严重创伤后，肠黏膜屏障破坏，肠道内细菌和毒素经门静脉和淋巴引流侵入肝、肺，肝脏内枯否细胞激活，创伤反应首先在肝脏内被“扩增”；富含细胞因子和炎性介质的肝静脉血回流至肺，加之肺还接受胃肠道的淋巴引流，肺组织内巨噬细胞被激活，积极参与系统炎症反应，来自肝、肠的创伤反应的“信息”进一步被肺“放大”，肺又反馈于肝、肠，形成恶性循环，最终导致多器官功能不全综合征(MODS)。如果创伤反应是局部、自限性的，肠-肝-肺轴的作用是缓冲创伤反应；反之，则倍增创伤所致的系统炎症反应。杨建东等[1]和笔者[2]过去的工作证明中药大黄能保护肠黏膜屏障，抑制炎症反应，但其药理作用机制尚未完全阐明。笔者旨在研究大黄对肝脏内细胞因子基因表达的影响，揭示大黄“清热解毒”的药理机制。
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材料与方法
1. 模型制作：雄性SD大鼠(上海西普尔-必凯实验动物中心提供)220～250 g，氯胺酮腹腔内注射麻醉(80 mg/kg)，背部脱毛，右侧股静脉插管。烫伤模型根据Mason方法改良而成。大鼠固定于烫伤架上，将背部浸泡于沸水12 s，烫伤面积为25%，深度为Ⅲ度。大鼠即用平衡盐液按100 ml/kg由股静脉输注复苏，烫伤后24 h收集标本。
2. 实验设计：动物随机分为烫伤组，烫伤加内毒素组，治疗组和对照组。烫伤组大鼠仅给予背部25%面积的Ⅲ度烫伤；烫伤加内毒素组大鼠于烫伤后12 h经静脉持续输注内毒素，剂量为20 mg/kg；治疗组大鼠在烫伤和后继内毒素“二次打击”的基础上给予精制大黄片(上海香山中医医院大黄研究室研制，上海中药制药一厂生产，1 g精制大黄片相当于生药4 g)治疗，将大黄片按50 mg/kg 的剂量研成粉后溶于1 ml等渗盐水经胃管灌入，预实验证明大黄50 mg/kg在其最佳剂量范围；对照组除不予以烫伤外，其他处理同烫伤组。烫伤组、烫伤加内毒素组和对照组经胃管给予等量等渗盐水替代大黄治疗。
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3. 标本收集：烫伤后24 h经股静脉采血2 ml，剖腹经门静脉采血2 ml，4 000 ×g离心10 min，血浆储存于-70℃冰箱待测。从肝右叶切取肝组织3 g，储存于液氮待测。
4. RNA分离：总RNA分离应用德国QIAGEN公司Rneasy mini kit试剂盒。RNA浓度测定应用紫外分光光度计(Shimadzu UV-160，Japan)，质量根据A260/A280比值(>1.8)及应用质量浓度为10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。
5. RT-PCR方法：RNA逆转录和cDNA扩增：根据Sambrook手册改良而成[3]。TNF-α引物序列：上游为5’-GCACAGAAAGCATGATCCGCG-3’，下游为5’-AGTTCTCGGGAACGGGATTCCTGTG-3’(535 bps)。内参照β-Actin引物序列：上游为5’-GAGCACCCTGTGCTGCTCACCCTAGG-3’，下游为5’-TCGCACCGATGTCGAAGTGGTGGTG-3’(310 bps)。 PCR条件：94℃预变性5 min，循环：94℃ 2 min，50℃ 2 min，72℃ 2 min，35个循环。预实验证明35个循环在PCR反应的线性扩增范围内。PCR产物应用质量浓度为20 g/L琼脂糖凝胶电泳分离，扫描仪(EPSON GT-5500 WINS)扫描电泳条带，测定PCR产物和内参照吸光度比。
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6. 肿瘤坏死因子(TNF-α)测定方法:TNF-α测定采用放射免疫法，试剂盒由第二军医大学第3，6，9教研室提供。蛋白质测定采用Bradford比色法。
7. 内毒素检测方法: 内毒素测定采用鲎试剂偶氮显色法[4]，试剂盒由上海医学检验中心鲎试剂室提供。
8. 统计学分析:数据以
±s表示，计量资料应用方差分析和非配对t检验，组内比较应用多组间方差分析，以P<0.05为相差显著。
结 果
1. 大黄对烫伤后肝脏内TNF-α基因表达的影响：对照组和烫伤组肝内无TNF-α基因表达。给予输注内毒素行“二次打击”后，肝脏内TNF-α基因被激活且表达明显增加。大黄治疗后TNF-α基因表达明显减弱，与烫伤加内毒素组相比有显著差异(P<0.005)。见图1。图2为电泳图谱，1～5泳道是大黄治疗组，其中1，4泳道TNF-α基因表达几乎完全受抑，2，3，5泳道TNF-α基因表达明显减弱；6～12泳道为烫伤加内毒素组，TNF-α基因表达的丰度较高。
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图1 大黄对烫伤加内毒素“二次打击”后肝脏内TNF-α基因表达的影响。图中数据是TNF-α PCR产物与内参照吸光度比，与烫伤加内毒素组比较：*P<0.005
图2 大黄对烫伤加内毒素“二次打击”后肝脏内TNF-α基因表达的影响(PCR产物电泳图谱)。图中1～5泳道为大黄治疗组，6～12泳道为烫伤加内毒素组。
2. 大黄对烫伤后血浆和肝脏内TNF-α浓度的影响：对照组和烫伤组大鼠血浆和肝脏内测不到TNF-α，“二次打击”后血浆和肝脏内TNF-α含量大幅提高，分别达(278.37±58.64) μg/L和(12.24±4.86) mg/kg，尤以肝组织内显著。大黄治疗后血浆、肝脏内TNF-α浓度分别下降到(76.59±11.34) μg/L和(4.34±1.59) mg/kg，显著低于烫伤加内毒素组(P<0.01)。
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3. 大黄对烫伤后血浆内内毒素的清除作用：如表1所示，正常大鼠血浆内几乎不含内毒素，但门静脉血内含有极微量内毒素。烫伤后体静脉血内内毒素含量升高，而门静脉血内升高更显著，与体静脉相比有显著性差异(P<0.05)。“二次打击”后门、体静脉血内内毒素含量显著升高，门静脉血略高于体静脉血，两者与对照组和烫伤组比较，有非常显著性差异(P<0.001)。烫伤加内毒素组大鼠经大黄治疗后门、体静脉血内内毒素含量显著下降,但仍高于对照组(P<0.05)。
表1 大黄对血浆内内毒素清除作用(kU/L，±s) 分组
鼠数
体静脉血
门静脉血
对照组
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5
0.046 ±0.012
0.114±0.042
烫伤组
6
0.108±0.045△
0.238±0.09△△
烫伤加内毒素组
7
0.696±0.127*▲
0.765±0.208*▲
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大黄治疗组
5
0.304±0.109▲▲
0.378±0.118▲▲
与对照组体静脉血比较：△P<0.05； 与烫伤组体静脉血和对照组门静脉血比较：△△P<0.05； 与对照组和烫伤组比较：*P<0.001； 与大黄治疗组比较：▲P<0.01； 与对照组比较：▲▲P<0.05讨 论
TNF-α在系统炎症反应中起重要作用[5]，故本实验中将其选用作为评价大鼠肝脏内炎性反应强弱的指标。如前所述，肝脏在创伤所致的系统炎症反应中起“放大器”的作用。肝脏内多种细胞可参与炎症反应，但最主要的是枯否细胞，其促发系统炎症反应的潜在能力是相当巨大的。由于其分离、培养需要较长时间，所以体外得到的枯否细胞的基因表达情况不能充分反映在体基因表达状况，故本实验中活杀大鼠后即取肝脏标本存于液氮待测，由此测得的结果一方面反映肝脏内炎性细胞表达细胞因子的情况，另一方面没有改变或丢失基因表达的信息。本实验显示烫伤后24 h大鼠肝内TNF-α基因表达没有明显增加，可能原因如下：(1)25%烫伤是中度创伤，不足以激活肝脏内TNF-α基因；(2)本实验中采集标本时间不在TNF-α基因激活期。但这种创伤反应可被后继的“二次打击”所放大，输注内毒素后12 h肝脏内TNF-α基因被激活而表达增加，而大黄能明显抑制TNF-α的基因表达，抑制程度基本达到部分消除了“二次打击”的“放大”效应，但不能达到完全抑制的效果。细胞在多种水平上对蛋白质过程进行调控，故本实验中还监测了血浆和肝组织内TNF-α的浓度。结果表明，对照组和烫伤组血浆和肝脏内基本测不到TNF-α，而烫伤加内毒素组大鼠血浆和肝脏内测得较高浓度的TNF-α，尤其在肝组织内其浓度高出血浆两个数量级。这就可帮助解释为何临床上很多脓毒症患者，虽然其系统炎症反应相当严重，而血浆内TNF-α却测不出或浓度很低，这类患者在组织局部可能含有较高浓度的TNF-α。大黄可明显降低“二次打击”后大鼠血浆和肝脏内TNF-α浓度，但没有降到对照组的水平。此结果与基因水平一致。大黄的这种作用可帮助机体由失控的系统炎症反应向自限性炎症反应转化、肝脏由“倍增”创伤反应向“缓冲”创伤反应转化，部分阻断系统炎症反应的病理环节，协助机体建立一个良性循环。内毒素是激活TNF-α基因的重要生物活性物质，故笔者对门、体静脉血内内毒素的浓度进行了监测。结果显示，正常大鼠体静脉血内几乎不含内毒素，门静脉血内可能含有极微量的内毒素。单纯烫伤后24 h，体静脉血内内毒素含量增高，而门静脉血内增高更明显，说明大鼠烫伤后内毒素血症部分是肠源性的。“二次打击”或输注内毒素后，门、体静脉血内内毒素含量成倍增加，但门、体静脉血浓度差消失。出现这种现象可能由于门静脉血内内毒素含量远远超过肝脏清除能力，肝脏所清除的少量内毒素尚不能形成门、体静脉血间浓度差。另一种可能是由于“二次打击”造成肝脏清除内毒素能力下降。本结果中另一个现象是虽然单纯烫伤组大鼠门静脉血内内毒素含量有轻度增加，但肝脏内TNF-α基因却未被激活，一种可能是大鼠为啮齿类动物，对内毒素不太敏感所致；另一种可能是内毒素被肝脏清除，不足以激活TNF-α基因，烫伤后体静脉血内内毒素浓度明显低于门静脉血是支持后一种假说的依据。大黄治疗组门、体静脉血内内毒素浓度明显下降，但仍高于对照组，这可能是大黄不能完全抑制TNF-α基因表达的原因之一，亦即大黄对TNF-α基因表达的影响可能通过对内毒素的作用而实现。大黄具有多种药理效应，笔者[6]过去的工作表明，大黄能保护肠黏膜屏障，抑制肠道内内毒素吸收。本研究表明，大黄还能促进体内内毒素的清除。大黄对TNF-α基因激活的信号传导通路有无影响，尚待进一步研究。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670688)
参考文献：
[1]杨建东，陈德昌，景炳文，等.大黄抗内毒素性休克大鼠炎性介质作用的实验研究.中国危重病急救医学， 1998，10：469-473.
[2]陈德昌，景炳文，张翔宇，等.大黄对肠黏膜屏障保护作用.中国危重病急救医学， 1994，6：329-332.
[3]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 聚合酶链式反应体外扩增DNA.分子克隆实验指南. 第2版.北京：科学出版社, 1993. 672-692.
[4]陈德昌,杨建东，杨兴易，等.大黄对大鼠肠黏膜及肠血管通透性影响.中国危重病急救医学， 1997，9：385.
[5]Vincent JL, Bakker J, Marecaux G, et al. Administration of anti-TNF antibody improves left ventricular function in septic shock patients. Results of a pilot study. Chest, 1992，101:810-815.
[6]陈德昌,景炳文.大黄对出血性休克大鼠肠黏膜通透性影响.中国中医急症， 1994，3：131-132.
收稿日期：1999-03-27, 百拇医药
单位：第二军医大学附属长征医院急救科、解放军急救医学中心 200003 上海
关键词：烧伤；肿瘤坏死因子；内毒素；肝；大黄
中华创伤杂志000307摘 要：目的 研究大黄对烫伤后肝脏内肿瘤坏死因子(TNF-α)基因表达的影响。 方法 应用随机、前瞻性研究方法，采用大鼠烫伤模型。烫伤后12 h给予内毒素行“二次打击”，观察大黄对肝脏内TNF-α基因表达的影响，以及对体内TNF-α和门、体静脉血内内毒素的清除作用。
结果 正常对照组和单纯烫伤组肝脏内TNF-α没有明显表达，血浆和肝脏内未测到TNF-α蛋白。“二次打击”后肝内TNF-α基因表达明显增加，且血浆和肝组织内TNF-α浓度显著提高。大黄可明显抑制肝脏内TNF-α基因表达，降低血浆和肝组织内TNF-α含量。烫伤可使肠道内内毒素吸收入血，“二次打击”后门、体静脉血内内毒素浓度更高。大黄治疗后门、体静脉血内内毒素浓度显著下降。 结论 大黄可抑制烫伤和后继“二次打击”后肝脏内TNF-α基因表达，促进体内内毒素清除。
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Effect of rhubarb on gene expression of tumor necrosis factor in liver after scald
CHEN Dechang YANG Xinyi JING Bingwen, et al.
(Emergency center, Changzheng Hospital, The Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
Abstract：Objective To test action of rhubarb on gene expression of tumor necrosis factor-α (TNF-α) after liver scald. Methods The model rats with scald were used. Endotoxin at a dose of 20 mg/kg was continuously infused a “second hit” at 12 hours after scald. Through prospective and random way of experiment, the effect of rbubarb on gene expression of TNF-α in liver was detected. The clearing action of rhubarb on endotoxin in portal and femoral blood was also measured. Results There was little gene expression of TNF-α in normal control and scald group. Furthermore, TNF-α protein was not detected in serum and liver in those two groups. However, the “second hit" could promote gene expression of TNF-α. The concentration of TNF-α in serum and hepatic tissues were increased significantly. Rhubarb obviously inhibited gene expression of TNF-α in liver and lowered the concentration of TNF-α in serum and hepatic tissues. The burn injury damaged the gut barrier and resulted in absorption of endotoxin into the gut. The “second hit" made the concentration of endotoxin in both of the portal and femoral blood increased. Rhubarb could reduce the endotoxin level in both blood. Conclusions Rhubarb can inhibit scald and gene expression of TNF-α in liver following the second hit and promote the clearance of endotoxin.
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Key words：Burns； Tumor necrosis factors； Endotoxins; Liver; Rhubarb▲
肠-肝-肺轴对创伤后系统炎症反应的转归有重要作用。严重创伤后，肠黏膜屏障破坏，肠道内细菌和毒素经门静脉和淋巴引流侵入肝、肺，肝脏内枯否细胞激活，创伤反应首先在肝脏内被“扩增”；富含细胞因子和炎性介质的肝静脉血回流至肺，加之肺还接受胃肠道的淋巴引流，肺组织内巨噬细胞被激活，积极参与系统炎症反应，来自肝、肠的创伤反应的“信息”进一步被肺“放大”，肺又反馈于肝、肠，形成恶性循环，最终导致多器官功能不全综合征(MODS)。如果创伤反应是局部、自限性的，肠-肝-肺轴的作用是缓冲创伤反应；反之，则倍增创伤所致的系统炎症反应。杨建东等[1]和笔者[2]过去的工作证明中药大黄能保护肠黏膜屏障，抑制炎症反应，但其药理作用机制尚未完全阐明。笔者旨在研究大黄对肝脏内细胞因子基因表达的影响，揭示大黄“清热解毒”的药理机制。
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材料与方法
1. 模型制作：雄性SD大鼠(上海西普尔-必凯实验动物中心提供)220～250 g，氯胺酮腹腔内注射麻醉(80 mg/kg)，背部脱毛，右侧股静脉插管。烫伤模型根据Mason方法改良而成。大鼠固定于烫伤架上，将背部浸泡于沸水12 s，烫伤面积为25%，深度为Ⅲ度。大鼠即用平衡盐液按100 ml/kg由股静脉输注复苏，烫伤后24 h收集标本。
2. 实验设计：动物随机分为烫伤组，烫伤加内毒素组，治疗组和对照组。烫伤组大鼠仅给予背部25%面积的Ⅲ度烫伤；烫伤加内毒素组大鼠于烫伤后12 h经静脉持续输注内毒素，剂量为20 mg/kg；治疗组大鼠在烫伤和后继内毒素“二次打击”的基础上给予精制大黄片(上海香山中医医院大黄研究室研制，上海中药制药一厂生产，1 g精制大黄片相当于生药4 g)治疗，将大黄片按50 mg/kg 的剂量研成粉后溶于1 ml等渗盐水经胃管灌入，预实验证明大黄50 mg/kg在其最佳剂量范围；对照组除不予以烫伤外，其他处理同烫伤组。烫伤组、烫伤加内毒素组和对照组经胃管给予等量等渗盐水替代大黄治疗。
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3. 标本收集：烫伤后24 h经股静脉采血2 ml，剖腹经门静脉采血2 ml，4 000 ×g离心10 min，血浆储存于-70℃冰箱待测。从肝右叶切取肝组织3 g，储存于液氮待测。
4. RNA分离：总RNA分离应用德国QIAGEN公司Rneasy mini kit试剂盒。RNA浓度测定应用紫外分光光度计(Shimadzu UV-160，Japan)，质量根据A260/A280比值(>1.8)及应用质量浓度为10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。
5. RT-PCR方法：RNA逆转录和cDNA扩增：根据Sambrook手册改良而成[3]。TNF-α引物序列：上游为5’-GCACAGAAAGCATGATCCGCG-3’，下游为5’-AGTTCTCGGGAACGGGATTCCTGTG-3’(535 bps)。内参照β-Actin引物序列：上游为5’-GAGCACCCTGTGCTGCTCACCCTAGG-3’，下游为5’-TCGCACCGATGTCGAAGTGGTGGTG-3’(310 bps)。 PCR条件：94℃预变性5 min，循环：94℃ 2 min，50℃ 2 min，72℃ 2 min，35个循环。预实验证明35个循环在PCR反应的线性扩增范围内。PCR产物应用质量浓度为20 g/L琼脂糖凝胶电泳分离，扫描仪(EPSON GT-5500 WINS)扫描电泳条带，测定PCR产物和内参照吸光度比。
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6. 肿瘤坏死因子(TNF-α)测定方法:TNF-α测定采用放射免疫法，试剂盒由第二军医大学第3，6，9教研室提供。蛋白质测定采用Bradford比色法。
7. 内毒素检测方法: 内毒素测定采用鲎试剂偶氮显色法[4]，试剂盒由上海医学检验中心鲎试剂室提供。
8. 统计学分析:数据以
±s表示，计量资料应用方差分析和非配对t检验，组内比较应用多组间方差分析，以P<0.05为相差显著。结 果
1. 大黄对烫伤后肝脏内TNF-α基因表达的影响：对照组和烫伤组肝内无TNF-α基因表达。给予输注内毒素行“二次打击”后，肝脏内TNF-α基因被激活且表达明显增加。大黄治疗后TNF-α基因表达明显减弱，与烫伤加内毒素组相比有显著差异(P<0.005)。见图1。图2为电泳图谱，1～5泳道是大黄治疗组，其中1，4泳道TNF-α基因表达几乎完全受抑，2，3，5泳道TNF-α基因表达明显减弱；6～12泳道为烫伤加内毒素组，TNF-α基因表达的丰度较高。
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图1 大黄对烫伤加内毒素“二次打击”后肝脏内TNF-α基因表达的影响。图中数据是TNF-α PCR产物与内参照吸光度比，与烫伤加内毒素组比较：*P<0.005
图2 大黄对烫伤加内毒素“二次打击”后肝脏内TNF-α基因表达的影响(PCR产物电泳图谱)。图中1～5泳道为大黄治疗组，6～12泳道为烫伤加内毒素组。
2. 大黄对烫伤后血浆和肝脏内TNF-α浓度的影响：对照组和烫伤组大鼠血浆和肝脏内测不到TNF-α，“二次打击”后血浆和肝脏内TNF-α含量大幅提高，分别达(278.37±58.64) μg/L和(12.24±4.86) mg/kg，尤以肝组织内显著。大黄治疗后血浆、肝脏内TNF-α浓度分别下降到(76.59±11.34) μg/L和(4.34±1.59) mg/kg，显著低于烫伤加内毒素组(P<0.01)。
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3. 大黄对烫伤后血浆内内毒素的清除作用：如表1所示，正常大鼠血浆内几乎不含内毒素，但门静脉血内含有极微量内毒素。烫伤后体静脉血内内毒素含量升高，而门静脉血内升高更显著，与体静脉相比有显著性差异(P<0.05)。“二次打击”后门、体静脉血内内毒素含量显著升高，门静脉血略高于体静脉血，两者与对照组和烫伤组比较，有非常显著性差异(P<0.001)。烫伤加内毒素组大鼠经大黄治疗后门、体静脉血内内毒素含量显著下降,但仍高于对照组(P<0.05)。
表1 大黄对血浆内内毒素清除作用(kU/L，
±s) 分组鼠数
体静脉血
门静脉血
对照组
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5
0.046 ±0.012
0.114±0.042
烫伤组
6
0.108±0.045△
0.238±0.09△△
烫伤加内毒素组
7
0.696±0.127*▲
0.765±0.208*▲
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大黄治疗组
5
0.304±0.109▲▲
0.378±0.118▲▲
与对照组体静脉血比较：△P<0.05； 与烫伤组体静脉血和对照组门静脉血比较：△△P<0.05； 与对照组和烫伤组比较：*P<0.001； 与大黄治疗组比较：▲P<0.01； 与对照组比较：▲▲P<0.05讨 论
TNF-α在系统炎症反应中起重要作用[5]，故本实验中将其选用作为评价大鼠肝脏内炎性反应强弱的指标。如前所述，肝脏在创伤所致的系统炎症反应中起“放大器”的作用。肝脏内多种细胞可参与炎症反应，但最主要的是枯否细胞，其促发系统炎症反应的潜在能力是相当巨大的。由于其分离、培养需要较长时间，所以体外得到的枯否细胞的基因表达情况不能充分反映在体基因表达状况，故本实验中活杀大鼠后即取肝脏标本存于液氮待测，由此测得的结果一方面反映肝脏内炎性细胞表达细胞因子的情况，另一方面没有改变或丢失基因表达的信息。本实验显示烫伤后24 h大鼠肝内TNF-α基因表达没有明显增加，可能原因如下：(1)25%烫伤是中度创伤，不足以激活肝脏内TNF-α基因；(2)本实验中采集标本时间不在TNF-α基因激活期。但这种创伤反应可被后继的“二次打击”所放大，输注内毒素后12 h肝脏内TNF-α基因被激活而表达增加，而大黄能明显抑制TNF-α的基因表达，抑制程度基本达到部分消除了“二次打击”的“放大”效应，但不能达到完全抑制的效果。细胞在多种水平上对蛋白质过程进行调控，故本实验中还监测了血浆和肝组织内TNF-α的浓度。结果表明，对照组和烫伤组血浆和肝脏内基本测不到TNF-α，而烫伤加内毒素组大鼠血浆和肝脏内测得较高浓度的TNF-α，尤其在肝组织内其浓度高出血浆两个数量级。这就可帮助解释为何临床上很多脓毒症患者，虽然其系统炎症反应相当严重，而血浆内TNF-α却测不出或浓度很低，这类患者在组织局部可能含有较高浓度的TNF-α。大黄可明显降低“二次打击”后大鼠血浆和肝脏内TNF-α浓度，但没有降到对照组的水平。此结果与基因水平一致。大黄的这种作用可帮助机体由失控的系统炎症反应向自限性炎症反应转化、肝脏由“倍增”创伤反应向“缓冲”创伤反应转化，部分阻断系统炎症反应的病理环节，协助机体建立一个良性循环。内毒素是激活TNF-α基因的重要生物活性物质，故笔者对门、体静脉血内内毒素的浓度进行了监测。结果显示，正常大鼠体静脉血内几乎不含内毒素，门静脉血内可能含有极微量的内毒素。单纯烫伤后24 h，体静脉血内内毒素含量增高，而门静脉血内增高更明显，说明大鼠烫伤后内毒素血症部分是肠源性的。“二次打击”或输注内毒素后，门、体静脉血内内毒素含量成倍增加，但门、体静脉血浓度差消失。出现这种现象可能由于门静脉血内内毒素含量远远超过肝脏清除能力，肝脏所清除的少量内毒素尚不能形成门、体静脉血间浓度差。另一种可能是由于“二次打击”造成肝脏清除内毒素能力下降。本结果中另一个现象是虽然单纯烫伤组大鼠门静脉血内内毒素含量有轻度增加，但肝脏内TNF-α基因却未被激活，一种可能是大鼠为啮齿类动物，对内毒素不太敏感所致；另一种可能是内毒素被肝脏清除，不足以激活TNF-α基因，烫伤后体静脉血内内毒素浓度明显低于门静脉血是支持后一种假说的依据。大黄治疗组门、体静脉血内内毒素浓度明显下降，但仍高于对照组，这可能是大黄不能完全抑制TNF-α基因表达的原因之一，亦即大黄对TNF-α基因表达的影响可能通过对内毒素的作用而实现。大黄具有多种药理效应，笔者[6]过去的工作表明，大黄能保护肠黏膜屏障，抑制肠道内内毒素吸收。本研究表明，大黄还能促进体内内毒素的清除。大黄对TNF-α基因激活的信号传导通路有无影响，尚待进一步研究。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670688)
参考文献：
[1]杨建东，陈德昌，景炳文，等.大黄抗内毒素性休克大鼠炎性介质作用的实验研究.中国危重病急救医学， 1998，10：469-473.
[2]陈德昌，景炳文，张翔宇，等.大黄对肠黏膜屏障保护作用.中国危重病急救医学， 1994，6：329-332.
[3]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 聚合酶链式反应体外扩增DNA.分子克隆实验指南. 第2版.北京：科学出版社, 1993. 672-692.
[4]陈德昌,杨建东，杨兴易，等.大黄对大鼠肠黏膜及肠血管通透性影响.中国危重病急救医学， 1997，9：385.
[5]Vincent JL, Bakker J, Marecaux G, et al. Administration of anti-TNF antibody improves left ventricular function in septic shock patients. Results of a pilot study. Chest, 1992，101:810-815.
[6]陈德昌,景炳文.大黄对出血性休克大鼠肠黏膜通透性影响.中国中医急症， 1994，3：131-132.
收稿日期：1999-03-27, 百拇医药