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编号:10228928
癌性胸水p16基因纯合性缺失检测的临床意义
http://www.100md.com 《癌症》 2000年第3期
     作者:桂淑玉 汪渊 刘虎 周青

    单位:桂淑玉(安徽医科大学分子生物学实验室,安徽合肥230032);汪渊(安徽医科大学分子生物学实验室,安徽合肥230032);刘虎(安徽医科大学分子生物学实验室,安徽合肥230032);周青(安徽医科大学分子生物学实验室,安徽合肥230032);桂淑玉(安徽医科大学附属医院呼吸内科,安徽合肥230022)

    关键词:癌性胸水;p16;纯合性缺失;PCR;

    癌症000317

    摘 要:目的:研究癌性胸水p16基因纯合性缺失检测的临床意义。方法:应用PCR技术检测胸水p16基因第一、二外显子纯合性缺失,并结合胸水脱落细胞学检测分析其在临床诊断中的意义。结果:表明所检31例肺癌所致癌性胸水标本中均无出现p16基因第一外显子纯合性缺失,12例有p16基因第二外显子纯合性缺失,阳性率为38.71%(12/31)。16例脱落细胞学检测阳性,阳性率为51.62%(16/31);15例脱落细胞学检测阴性,其中6例存在p16基因第二外显子纯合性缺失;两者联合检测,阳性率提高至70.97%(22/31)。统计学分析表明p16基因第二外显子纯合性缺失和脱落细胞学检测阳性率间无明显差异,而两者联合阳性检出率明显高于单独p16基因第二外显子纯合性缺失(P<0.01)和脱落细胞学检测(P<0.01)。21例结核性胸水中均无胸水p16基因纯合性缺失。结论:本组资料说明胸水p16基因第二外显子纯合性缺失与脱落细胞学联合检测可增加诊断的阳性率,并补充和提高胸水脱落细胞学的诊断价值。<0.01)和脱落细胞学检测(P<0.01)。21例结核性胸水中均无胸水p16基因纯合性缺失。结论:本组资料说明胸水p16基因第二外显子纯合性缺失与脱落细胞学联合检测可增加诊断的阳性率,并补充和提高胸水脱落细胞学的诊断价值。
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    分类号:R734.2 文献标识码:A

    文章编号:1000-467X(2000)03-0253-03

    The clinical significance of deletion of p16 gene homozygous deletion in malignant pleural effusion

    GUI Shu-yu WANG Yuan LIU Hu1 et al.

    (Laboratory of Molecular Biology and Department of Biochemistry, Anhui Medical University, Hefei 230032, P.R.China)

    GUI Shu-yu
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    (Department of Respiratory Medicine, the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230032, P.R.China)

    Abstract:Objective: To investigate the clinical significance of homozygous deletion of p16 gene in malignant pleural effusion. Methods: The homozygous deletion of p16 geneexon1 and exon2 was examined by polymerase chain reaction (PCR) in 31 specimens of pleural effusions from lung cancer patients and compared with the determination of exfoliated cell in same specimens from which the clinical value was analysed in clinical diagnosis. Results: No homozygous deletion of p16 geneexon1 was found in 31 malignant pleural effusion samples. The homozygous deletion of p16 geneexon2 was detected in 12 sampls from 31 pleural effusions, while cytology positivity was found in 16 of all examined pleural effusions. The positive rate in 31 malignant pleural effusion samples by the determination of homozygous deletion of p16 gene and the examination of exfoliated cell was 38.71% (12/31) and 51.62% (16/31), respectively. The positive rate could be enhanced from 51.62(16/31) to 70.97% (22/31) by using both of above methods, There was no significnt difference of positive rate between homozygous deletion of p16 geneexon2 and exfoliated cytology The overall positive rate of both examination was higher than that of only the determination of homozygous deletion of p16 geneexon2 or exfoliated cytology in malignant pleural effusion. No homozygous deletion of p16 gene was found in 21 tuberculosis pleural effusion samples. Conclusions: Our present data suggest that combining examinations of exfoliated cytology and homozygous deletion of p16 geneexon2 in pleural effusion can not only increase the positive rate of diagnosis, but also recruit and enhance the diagnostic value of conventi-onal pleural cytology.
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    Key words:Malignant pleural effusion; p16; Homozygous deletion;Polymerase chain reaction; Cytology; Diagnosis▲

    肺癌是发病率逐年增高的恶性肿瘤之一,且在首次就诊时有15%伴有恶性胸腔积液[1]。胸水癌细胞检查在良、恶性胸水的鉴别诊断中为最可靠的方法,但阳性率仅为40%~60%[2]。因此,必须辅以其他检测提高诊断阳性率。

    自1994年美国盐湖城Kamb和Kolnick报道肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene,TS1或p16基因)[3]以来,p16基因已成为当今肿瘤分子生物学、分子遗传学、临床诊断和治疗学等领域的研究热点。近年研究表明p16基因在近20%~50%的肺癌细胞系存在纯合性缺失,12%~30%非小细胞肺癌实体瘤标本可观察到缺失或突变[3-5],尚未见有关胸水p16基因纯合性缺失检测的报道。为提高癌性胸水的诊断阳性率,我们在建立人p16基因PCR检测其缺失的基础上,分析了31例癌性胸水的p16基因纯合性缺失,试图探索胸水p16基因纯合性缺失检测在癌性胸水辅助诊断中的作用和意义。
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    1 材料与方法

    1.1 病例选择

    31例肺癌患者均为我科住院病人,男性18例,女性13例,年龄27~82岁,平均为55.2岁,其中腺癌19例,鳞癌3例,未定型9例,均经病理学和/或细胞学诊断证实。21例结核性胸膜炎作为无p16缺失阴性对照。

    1.2 主要试剂和仪器

    引物由美国生物技术公司合成;TaqDNA聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR缓冲液等购自华美生物工程公司;其他试剂均为国产分析纯。地高辛标记和检测试剂盒购自Boehringer Mannheim公司;p16cDNA克隆由美国冷泉港实验室David Beach博士惠赠。Hema480基因扩增仪为珠海黑马医学仪器有限公司产品。

    1.3 胸水DNA的制备
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    常规留取最后一管胸水10ml、3000r/min离心10分钟,取沉淀物再悬浮于0.5ml生理盐水中,加入0.5mlDNA提取液(200mmol/LNaCl,2mmol/LEDTA,1%SDS,100mmol/LTris.HCl,pH8.0)和50μl蛋白酶K(2g/L),37°C温育4~6h,95°C灭活蛋白酶K,酚/氯仿抽提,乙醇沉淀DNA,-80℃保存待测。

    1.4 p16基因第一、二外显子PCR分析

    根据已发表的p16基因序列,参考Kamb[3]等报道设计引物,MTS1第一外显子:3′端引物(GW-Ⅳ-1T):5′GCG CTA CCT GAT TCC AAT TC,5′端引物(GW-Ⅳ-1S):5′GAA GAA AGA GGA GGG GCT G;MTS1第二外显子:3′端引物(GW-Ⅳ-1I):5′AGC TTT GGA AGC TCT CAG,5′端引物(GW-Ⅳ-1G):5′TGG CTC TGA CCA TTC TGT;并以CDK4作为参照,3′端引物(GW-Ⅳ-1K):5′GGA GGT CGG TAC CAG AGT G,5′端引物(GW-Ⅳ-J):5′CAT GTA GAC CAG GAC AGG。在50ng标本DNA模板中分别加入PCR反应液(10mmol/LTris,50mmol/LKCl,2mmol/LMgCl2,0.001%Gelatin,200mmol/LdNTPs,5%DMSO和0.5mmol/L引物),Hema480PCR自动循环仪中,97℃预变性5min,冰上淬冷,加入用1×PCR缓冲液溶解的Taq酶3u,95℃1分钟,60℃1分钟,72℃1分钟,共35个循环,72℃5分钟,4℃保温。取8μlPCR产物进行2%琼脂糖电泳,以CDK4出现特异条带且未出现特异性MTS1第一、二外显子条带为相应的纯合性缺失。
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    1.5 MTS1cDNA探针的制作和PCR产物的鉴定

    挑选阳性克隆,LB/Amp培养基中培养,用QIAGEN微柱法提取质粒、定量、EcoRI/SalI酶切、电洗脱法分离、纯化插入片段;取15μl总量为1μg的插入片段按试剂盒说明书进行地高辛标记。PCR产物进行2%琼脂糖电泳,转移至硝酸纤维素薄膜上,进行预杂交、杂交和显色并分析。

    1.6 统计学分析

    用χ2检验。

    2 结果

    2.1 p16基因纯合性缺失的分析

    以50ng胸水DNA为模板进行PCR分析,结果表明31份癌性胸水标本均无出现p16基因第一外显子纯合性缺失,有12例p16基因第二外显子缺失,缺失阳性率为38.71%;而21例结核性胸水标本均可见p16基因特异性PCR扩增条带,经以p16cDNA为探针作Southern Blot证实本实验所获PCR产物为p16基因特异,见图1。
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    图1 pCR分析p16基因纯合性缺失的电泳图上图:

    琼脂糖电泳EB染色图:M:为DNA分子量标记(100bp DNA ladder),A:p16第二外显子PCR产物B:为CDK4 PCR产物下图:

    p16第二外显子PCR产物Southern Blot图

    2.2 p16基因第二外显子纯合性缺失和其他确诊方法

    31例癌性胸膜炎患者中淋巴结穿刺确诊8例、胸水细胞学阳性16例、纤支镜检查证实7例。全部标本中12例出现p16基因第二外显子纯合性缺失,其中6例为胸水多次细胞学检查阴性。仅p16基因第二外显子纯合性缺失,阳性率为38.71%(12/31);胸水脱落细胞学检测阳性率为51.62%(16/31);两者联合检测,阳性率提高至70.96%(22/31);统计学分析表明胸水p16基因第二外显子纯合性缺失和脱落细胞学检测阳性率间无明显差异,而两者联合阳性检出率明显高于单独p16基因第二外显子纯合性缺失(P<0.01)和脱落细胞学检测(P<0.01),见图2。所检12例p16基因第二外显子纯合性缺失患者有9例已发生一处以上的肺外转移;其中一例曾误诊为结核性胸膜炎8月余,胸水细胞学检测10余次均阴性,而检测其胸水显示p16基因第二外显子纯合性缺失,9个月后出现右锁骨上和右腋下淋巴结肿大,穿刺细胞学证实为转移性腺癌;另一例患者住院3个月,由于年轻、胸水多次细胞学检查均为阴性,按结核性胸膜炎处理,直至右锁骨上淋巴结肿大、穿刺才明确诊断为腺癌,而胸水检测则显示p16基因第二外显子纯合性缺失。
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    图2 各种检查方法对比分析

    1:p16基因第二外显子纯合性缺失 2:胸水细胞学检测

    3:纤维支气管镜 4:淋巴结穿刺

    5:p16基因第二外显子纯合性缺失+胸水细胞学检测

    3 讨论

    p16基因定位于人第九号染色体短臂上(9p21),其外显子编码的蛋白质直接调控细胞的增殖与分化。业已证实,p16基因的失活与多种肿瘤的发生、发展关系密切[5,6]。p16基因最易发生纯合性缺失,而杂合性缺失和突变较少见。国内、外已有大量的研究分析了肿瘤标本和肿瘤细胞株p16基因的变化,但尚未见胸水p16基因检测的研究报道。有研究提示p16基因与肿瘤转移有一种内在的联系[7],可能由于p16基因的失活,使肿瘤细胞增殖和分化失控促进肿瘤恶性进展并易于转移。本文的研究一方面建立了胸水p16基因纯合性缺失的检测方法,另一方面也表明在癌性胸水中有p16基因第二外显子的缺失,尽管其缺失率仅为38.71%(12/31),但其可提高和补充胸水脱落细胞学的诊断价值,同时也是一种准确的检测手段。因此,p16基因缺失的检测可作为一种判断预后的指标。
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    根据本文资料,我们认为临床上高度怀疑癌性胸水而胸水细胞学及其他检查均不能确诊者,进行胸水p16基因纯合性缺失的检测不失为一有效的辅助诊断方法。然而,未出现p16缺失的癌性胸水标本是否存在p16基因的突变、甲基化等以及与临床诊断的关系还有待进一步研究。

    基金项目:安徽省教委自然科学研究基金(96-JL077)和安徽医科大学附属医院科研基金资助

    通讯作者:汪渊:Tel:86-551-2843963 E-mail:wangyuan@mail.hf.ah.cn

    参考文献:

    [1]钟南山,府军,朱元珏.现代呼吸病进展[M].第一版.北京:人民卫生出版社,1994:431.

    [2]李静,梅昆.胸水癌胚抗原与铁蛋白检测对恶性胸水的参考价值[J].中华结核和呼吸杂志,1994,17:183.
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    [3]Kamb A, Gruis NA,Weaver-Feldhaus J, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types [J]. Science, 1994, 264: 436~ 440.

    [4]Washimi O, Nagatake M, Osada H, et al. In vivo occurrence of p16 (MTS1) and p15(MTS2) alterations preferentially in non-small cell lung cancers [J]. Cancer Res,1995, 55: 514~ 517.

    [5]Okamoto A, Hussain SP, Hagiwara K, et al. Mutations in the p16 INK4/MTS1 MTS1/CDKN2, p15 INK4B/MTS2, and p18 genes in primary and metastatic cancer [J]. Cancer Res, 1995, 55: 1448~ 1451.
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    [6]Dreyling MH, Bohlander Sk, Adeyanju MO, et al. Detection of CDKN2 delations in tumor cell lines and primary glioma by interphase fluorescence in situ hybridization [J]. Cancer Res,1995, 55: 984~ 988.

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    收稿日期:1999-10-07

    修稿日期:1999-10-26, 百拇医药