荧光定量RT－PCR检测mdr－1基因表达
作者：高劲松 马刚 仝明 陈佩毅 王传华 何蕴韶
单位：高劲松(中山医科大学达安基因诊断中心,广东广州510089)；马刚(中山医科大学肿瘤防治中心胸外科,广东广州510060)；仝明(中山医科大学肿瘤防治中心胸外科,广东广州510060)；陈佩毅(中山医科大学达安基因诊断中心,广东广州510089)；王传华(中山医科大学达安基因诊断中心,广东广州510089)；何蕴韶(中山医科大学达安基因诊断中心,广东广州510089)
关键词：荧光定量检测；RT-PCR；mdr-1基因；基因表达
摘 要
摘 要：目的：建立荧光定量RT-PCR检测肿瘤细胞mdr-1基因表达的方法，了解肺癌组织中mdr-1的表达水平。方法：建立荧光定量RTPCR方法，在PE7700型检测仪上定量检测K562/ADM耐药株和K562不耐药株细胞mdr1基因表达水平，同时检测45例初治肺部肿瘤病人组织标本。结果：荧光定量RT-PCR检测K562/ADM耐药株和K562不耐药株细胞mdr-1基因表达，重复10次实验所得结果平均分别为(6.86±0.65)×107拷贝/μgRNA和(8.49±0.67)×105拷贝/μgRNA，两者相差80.8倍，变异系数分别为9.5%和7.9%。45例肺部肿瘤中，有12例检出有mdr-1基因不同程度的表达。结论：荧光定量RT-PCR检测mdr1基因表达方法，检测结果用绝对拷贝数来表示，定量准确可靠，并有利于标准的统一。有1/4未经化疗的肺癌病人有一定水平mdr-1基因的表达。
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分类号：R730.43 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)03-0200-04
The detection of mdr-1 gene expression using fluorogenic probe quantitative RT-PCR method
GAO Jing-song et al.
(Daan Gene Diagnosis Center of Sun Yat-sen University of Medical Sciences， Guangzhou 510089， P.R.China)
MA Gang TONG Ming
(Cancer Center of Sun Yat-sen University of Medical Sciences， Guangzhou 510060， P.R.China )
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Abstract：Objectives： To establish a fluoregenic probe quantitative RT-PCR(FQ-RT-PCR) method for detecting the expression of mdr-1 gene in tumor cells and comprehend the expression of mdr-1 gene in patients with lung cancer. Method： The fluorogenic quantitative RT-PCR method for detecting the expression of mdr-1 gene was established successfully. K562/ADM， K562 cell line or forty-five tumor tissues from patients with lung cancer， were detected in the PE Applied Biosystems 7700 Sequence Detector. Results： After ten duplicate tests with FQ-RT-PCR method， the average level of the mdr-1 gene expression was( 6.86± 0.65)× 10 7copies/μ g RNA from K562/ADM cells and (8.49± 0.67)× 105 copies/μ g RNA from K562 cells， respectively， the former was 80.8 times greater than the latter，the coefficient variation (CV) was 9.5% and 7.9% ， respectively. Of forty-five patients with lung cancer， 12 cases expressed of mdr-1 gene at various levels. Conclusions： The mdr-1 gene expression detected with the FQ-RT-PCR could be gotten an accurate quantitative result and the gene expression level be judged easily. Moreover， low levels of mdr-1 gene expression were observed in twenty-five percent of the patients with lung cancer.
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Key words：Fluorogenic quantitative detecting； RT-PCR； mdr-1 gene； Gene expression▲
常规检测mdr-1基因表达，多采用竞争RT-PCR法和内源性参比基因RT-PCR定量法[1，2]；它们均属于PCR终点检测法，在PCR扩增的指数期和平台期产量相差极大，很难对起始模板数准确定量。此外，常规的RT-PCR方法还存在因产物污染而导致的假阳性、非特异性扩增、扩增后电泳操作造成误差(对同样的标本可有高达3～10倍的差异)及EB染液对人体有害等问题，妨碍了其在临床中的推广应用。
新近出现的荧光定量PCR是PCR技术一个重大突破。该方法是在完全闭管的情况下，对PCR扩增产物进行检测，既彻底杜绝了PCR产物污染造成的假阳性问题，又能够对标本起始模板做到精确定量，已逐步成为PCR更新换代的新技术[3，4]。1997年我们于国内首先建立了荧光定量PCR技术，在此基础上，我们开展了荧光定量RTPCR检测肿瘤mdr1基因表达的研究，现报道如下。
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1 材料与方法
1.1 细胞培养
K562/ADM(阿霉素)耐药细胞株由福建省肿瘤医院沈世人教授惠赠[5]，K562敏感细胞株来自我校肿瘤医院。两细胞株在RPMI-1640(Gibco)加20%小牛血清，并含青链霉素双抗各100u/ml的培养基中，于37℃、饱和湿度、5%CO2孵箱内连续传代培养；K562/ADM耐药细胞株在培养时加入终浓度为3.8μg/ml的阿霉素。
1.2 组织标本
45例初治病人肺部肿瘤标本采自我校肿瘤医院，为1998年5月至1998年9月手术后的肿瘤标本，均作病理检查确诊。其中鳞癌19例、腺癌15例、腺鳞癌4例、细支气管肺泡上皮细胞癌4例、肺部转移癌3例。病人年龄39～71岁(平均54.3岁);男性28人，女性17人。
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1.3 细胞与组织总RNA的提取
将106～107K562/ADM耐药株和K562不耐药株细胞或上述新鲜的肺癌组织0.1～0.2g，分别各加入1mlTrizol(Gibco)试剂，操作按说明进行。提取后的RNA测A260A280吸光值，要求A260/A280比值≥2.0，并计算出RNA含量。
1.4 引物、探针设计、合成、纯化
mdr-1参照文献[1]。上游引物5'-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3'，下游引物5'-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3'，扩增片段长度为167bp。自行设计探针如下：5'-CGCT-ACTGAAGCAATAGAAAACTT-3'，其中在5'端标记上荧光发光基团FAM(6-carboxy-fluore-sceinPE公司产品)，3'端标记上荧光淬灭基团TAMRA(6-carboxy-tetramethylrhodaminePE公司产品)。引物探针合成纯化在我们实验室完成。
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1.5 cDNA合成
在反应体积为10μl的逆转录管中，含2μg提自K562/ADM耐药株及K562不耐药株细胞的总RNA或病人肿瘤标本，50mmol/LTris-Cl(pH8.3)，40mmol/LKCl，7mmol/LMgCl2，1mmol/LDTT，0.01%BSA，1mmol/LdNTPs，20UMMLV逆转录酶(Sangon产品)，10URNA酶抑制剂(华美公司产品)，各15pmol/Lmdr-1下游引物，37℃，60min，95℃5min灭活逆转录酶。合成好的cDNA置-20℃备用。
1.6 定量阳性标准模板的克隆
采用T-A载体克隆方案，参照李新波等[6]介绍的方法进行。将mdr-1167bp扩增片段克隆至pUC18质粒中，抽提、纯化重组质粒，按1010拷贝数/μl浓度存于-20℃备用。
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1.7 荧光定量RT-PCR
荧光定量PCR的原理是：在PCR扩增系统中加入一段与靶基因互补的双荧光素标记探针(5'端荧光素称为报告基团，3’端荧光素称为淬灭基团)，在完整状态下探针5’端报告基团发出的荧光受到了3’端淬灭基团抑制而检测不到荧光；当PCR扩增时，随着引物沿模板的延伸，Taq酶具5’-3’的外切酶活性，可将位于扩增片段内的探针5’端的荧光素切下，切下的报告基团脱离了3’端淬灭基团的淬灭作用而发出荧光，切下的荧光素数量与扩增产物是一对一的关系，用检测仪检测荧光值的变化，即可准确判断扩增产物的量[3，4]。在判定结果时，用循环阈值(cyclethreshold，CT)作为临界点，该点位于PCR产物进入指数增长期的起始点。
50μlPCR反应体积中，含5XPCR反应液[50mmol/LTrisHCl(pH8.3)、10mmol/LMgCl2、250mmol/LKCl、1mg/ml明胶]10μl，mdr-1上下游引物各15pmol/L，荧光探针10pmol/L，Taq酶3U，和不同样本自100ngRNA逆转得到的cDNA，同时将定量模板梯度稀释，作标准曲线，在ABIPRISM7700型实时检测扩增仪上进行扩增，反应条件为93℃预变性3min，93℃40sec，55℃120sec共作40个循环。反应结束后用计算机将样本与标准曲线对比得出mdr-1基因表达的拷贝数。
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2 结果
2.1 定量阳性标准模板
pUC18T载体连接mdr-1PCR片段，经蓝白斑LB平板筛选，含氨苄青霉素80u/mlLB培养基培养，提取质粒后，行PCR扩增，有特异条带出现者，用建立的FQ-RT-PCR法检测，有强烈的荧光值增长，说明mdr1基因已成功克隆，将提取的质粒测OD值，含量为1.31μg/μl，折算为4.35×1011拷贝数/μl，用TE稀释成1010拷贝数/μl备用。
2.2 荧光定量RTPCR结果
PE7700型扩增检测仪在PCR反应进行的同时，每8sec检测一次PCR产物量，做到了实时检测。从图1可见，不同的标准起始模板数(107、106、105、104、103、102、101)在反应后的平台期，产物量相差不成比例，因此，采用终点法进行定量，结果会很不准确。而将检测的临界点定在PCR产物进入指数增长期的起始点即CT值处，由图1可见起始模板数与CT值成比例增长。将不同梯度定量模板数与其CT值关系经对数拟合作图，得到了定量标准曲线，样品与标准曲线比较就能准确反映待检样品的起始核酸量。在最佳反应条件下，1个拷贝起始模板数其CT值约为37～40，100个拷贝CT值约为30.5，因此，反应循环数定为40，可满足最低检测限的要求。
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图1 MDR1基因定量标准模板荧光实时
定量PCR的动力学曲线
荧光定量RT-PCR重复10次检测K562/ADM耐药株和K562不耐药株细胞mdr-1，所得结果为[(6.1，6.2，6.2，6.4，6.5，7.1，7.3，7.4，7.6，7.8)×107]拷贝/μgRNA，和[(7.7，7.8，7.9，8.0，8.2，8.6，8.7，9.2，9.3，9.5)×105]拷贝/μgRNA，平均分别为(6.86±0.65)×107拷贝/μgRNA和(8.49±0.67)×105拷贝/μgRNA，两者之比为80.8，变异系数分别为9.5%和7.9%。所配试剂在20℃保存半年，无明显变化。
在45例肺部肿瘤标本中，有12例检出有mdr-1基因的表达(见表1)，表达强度在4.9×102～3.2×105拷贝/μgRNA之间。其中一例来自大肠癌的肺部转移癌mdr-1基因表达量为3.2×105拷贝/μgRNA，追溯病史，该病人4年前患大肠癌，有化疗的经历。去除该例，则这11例病人mdr-1的平均表达量为3.9×104拷贝/μgRNA。
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表1 45例肺部肿瘤标本中检出12例mdr-1表达阳性结果
编号
性别
年龄(岁)
病理诊断
荧光定量RT-PCR结果
(拷贝/μgRNA)
1
男
56
鳞癌
9.7×103
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2
男
52
鳞癌
3.4×104
3
女
60
鳞癌
8.6×103
4
女
69
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低分化鳞癌
4.9×102
5
男
61
低分化鳞癌
1.5×105
6
男
42
腺癌
1.9×104
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7
男
71
腺癌
1.4×104
8
女
61
腺癌
9.1×104
9
男
64
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腺癌
8.9×104
10
男
47
腺鳞癌
1.0×104
11
女
50
细支气管肺泡细胞癌
3.8×103
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12
男
57
大肠癌肺转移
3.2×105
3 讨论
采用荧光定量RT-PCR方法为制定和统一mdr-1高表达的阈值标准，提供了一个新的思路。与常规PCR相比，荧光定量PCR技术具以下优点：可准确定量待检模板的拷贝数：当荧光信号达到检测点CT值时，PCR反应体系处于最佳的饱和状态，最能反应起始的模板数，克服了常规PCR由于平台效应带来的误差；闭管检测有效防止了因扩增产物污染而导致的假阳性，为该方法用于临床打下坚实基础；引物和探针特异地同目的模板结合，保障了检测的特异性；荧光检测的灵敏度显著高于肉眼观察电泳条带的灵敏度；操作简单、方便、安全、快速，整个过程由电脑控制，从加样到出结果仅需2.5h左右，不存在EB染液或同位素对人体的危害性问题；PE7700型荧光定量PCR仪有96个反应孔，可同时对大量的样品进行检测等[3，4]。荧光定量RT-PCR结果用拷贝数来表示，这种绝对数量显然更准确，易统一标准，这一指标不会因不同的实验室而改变。但采用荧光定量RT-PCR方法判定mdr-1高表达的阈值标准，尚需结合临床耐药标准，对不同的肿瘤进行大量标本的检测后才能得出，而这还需通过多家医院携手合作方可完成。
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对mRNA用RTPCR方法进行定量，还需考虑逆转录效率问题。Debuire等[7]曾将cDNA定量标准在体外用T3聚合酶转录成RNA，定量后再作逆转录，这一过程十分繁复，而且需要大量昂贵的T3聚合酶和其它试剂。Cross等[8]建议，在标准化实验条件后，如果是对某种mRNA进行动态监测，即可直接选用DNA作为定量模板。曹丽萍等[2]也指出用RNA作定量模板，其mdr-1mRNA量很少，系列稀释后更易降解，导致结果不稳定，且逆转录需大量昂贵的RNA酶抑制剂和逆转录酶，而用稳定的cDNA作竞争模板，操作简便，省时，也易于贮存，运输和标准化。本实验采用基因克隆的方法构建mdr-1基因cDNA定量模板，具有纯度高，来源广，定量准，安全易控制等优点，可广泛应用于检测。
在检测的45例肺癌病人中，发现有25%的初治肺癌病人有不同程度的mdr-1基因表达，mdr-1表达情况与肿瘤的病理分期无明显相关，这一结果同Shin的报道[9]相似。这说明一部分肺癌病人中存在着mdr-1的先天性表达。
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致谢：张晓实、林正、程钢、周新宇、李虎、许擎等在实验中提供大量帮助，谨致谢意。
基金项目：本课题受国家技术创新项目(No：1998-345)资助
通讯作者：高劲松：LTel：86-20-87331456 Fax：86-20-87333640 E-mail：gjs216@163.net
参考文献：
[1]Noonan KE， Beck C， Holzmayer TA， et al. Quantitative analysis of mdr 1 (multidrug resistance)gene expression in human tumors by polymerase chain reaction [J]. Proc Natl Acad Si USA， 1990， 87： 7160～ 7164.
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[2]曹丽萍，王斌，郁知非.多药耐药基因QRTPCR检测中内标准DNA和RNA模板的构[J].实验血液学杂志，1997，5(4)：393～398.
[3]Heid CA， Stevens J， Livak KJ， et al. Real time quantitative PCR [J]. Genome Res， 1996， 6(10)： 986～ 994.
[4]Gibson UE， Heid CA， Williams PM. A novel method for real time quantitative RT PCR [J]. Genome Res， 1996， 6(10)： 995～ 1001.
[5]沈世人，苏颖，黄秀清，等.K562/ADM耐药细胞株的建立及其生物学特性的初步观察[J].癌症，1992，11(3)：222～224.
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[6]李新波，赵小松，田德志，等.一种PCR产物克隆的新方法—T-A克隆法[J].生物化学与生物物理进展，1999，26(2)：187～189.
[7]Debuire B， Sol O， Lemoine A， et al. Nonisotopic competitive RT-PCR assay to measure mdr-1 gene expression [J]. Clin Chem， 1995， 41(6)： 819～ 825.
[8]Cross NC， Feng L， Chase A， et al. Competitive polymerase chain reaction to estimate the number of BCR ABL transcripts in chronic myeloid leukemia patients after bone marrow transplantation [J]. Blood， 1993， 82(6)： 1929～ 1936.
[9]Shin HJ， Lee JS， Hong WK， et al. Study of multidrug resistance (mdr1) gene in non small cell lung cancer [J]. Anticancer Res， 1992， 12(2)： 367～ 370.
收稿日期：1999-12-09
修稿日期：2000-01-12, 百拇医药
单位：高劲松(中山医科大学达安基因诊断中心,广东广州510089)；马刚(中山医科大学肿瘤防治中心胸外科,广东广州510060)；仝明(中山医科大学肿瘤防治中心胸外科,广东广州510060)；陈佩毅(中山医科大学达安基因诊断中心,广东广州510089)；王传华(中山医科大学达安基因诊断中心,广东广州510089)；何蕴韶(中山医科大学达安基因诊断中心,广东广州510089)
关键词：荧光定量检测；RT-PCR；mdr-1基因；基因表达
摘 要
摘 要：目的：建立荧光定量RT-PCR检测肿瘤细胞mdr-1基因表达的方法，了解肺癌组织中mdr-1的表达水平。方法：建立荧光定量RTPCR方法，在PE7700型检测仪上定量检测K562/ADM耐药株和K562不耐药株细胞mdr1基因表达水平，同时检测45例初治肺部肿瘤病人组织标本。结果：荧光定量RT-PCR检测K562/ADM耐药株和K562不耐药株细胞mdr-1基因表达，重复10次实验所得结果平均分别为(6.86±0.65)×107拷贝/μgRNA和(8.49±0.67)×105拷贝/μgRNA，两者相差80.8倍，变异系数分别为9.5%和7.9%。45例肺部肿瘤中，有12例检出有mdr-1基因不同程度的表达。结论：荧光定量RT-PCR检测mdr1基因表达方法，检测结果用绝对拷贝数来表示，定量准确可靠，并有利于标准的统一。有1/4未经化疗的肺癌病人有一定水平mdr-1基因的表达。
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分类号：R730.43 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)03-0200-04
The detection of mdr-1 gene expression using fluorogenic probe quantitative RT-PCR method
GAO Jing-song et al.
(Daan Gene Diagnosis Center of Sun Yat-sen University of Medical Sciences， Guangzhou 510089， P.R.China)
MA Gang TONG Ming
(Cancer Center of Sun Yat-sen University of Medical Sciences， Guangzhou 510060， P.R.China )
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Abstract：Objectives： To establish a fluoregenic probe quantitative RT-PCR(FQ-RT-PCR) method for detecting the expression of mdr-1 gene in tumor cells and comprehend the expression of mdr-1 gene in patients with lung cancer. Method： The fluorogenic quantitative RT-PCR method for detecting the expression of mdr-1 gene was established successfully. K562/ADM， K562 cell line or forty-five tumor tissues from patients with lung cancer， were detected in the PE Applied Biosystems 7700 Sequence Detector. Results： After ten duplicate tests with FQ-RT-PCR method， the average level of the mdr-1 gene expression was( 6.86± 0.65)× 10 7copies/μ g RNA from K562/ADM cells and (8.49± 0.67)× 105 copies/μ g RNA from K562 cells， respectively， the former was 80.8 times greater than the latter，the coefficient variation (CV) was 9.5% and 7.9% ， respectively. Of forty-five patients with lung cancer， 12 cases expressed of mdr-1 gene at various levels. Conclusions： The mdr-1 gene expression detected with the FQ-RT-PCR could be gotten an accurate quantitative result and the gene expression level be judged easily. Moreover， low levels of mdr-1 gene expression were observed in twenty-five percent of the patients with lung cancer.
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Key words：Fluorogenic quantitative detecting； RT-PCR； mdr-1 gene； Gene expression▲
常规检测mdr-1基因表达，多采用竞争RT-PCR法和内源性参比基因RT-PCR定量法[1，2]；它们均属于PCR终点检测法，在PCR扩增的指数期和平台期产量相差极大，很难对起始模板数准确定量。此外，常规的RT-PCR方法还存在因产物污染而导致的假阳性、非特异性扩增、扩增后电泳操作造成误差(对同样的标本可有高达3～10倍的差异)及EB染液对人体有害等问题，妨碍了其在临床中的推广应用。
新近出现的荧光定量PCR是PCR技术一个重大突破。该方法是在完全闭管的情况下，对PCR扩增产物进行检测，既彻底杜绝了PCR产物污染造成的假阳性问题，又能够对标本起始模板做到精确定量，已逐步成为PCR更新换代的新技术[3，4]。1997年我们于国内首先建立了荧光定量PCR技术，在此基础上，我们开展了荧光定量RTPCR检测肿瘤mdr1基因表达的研究，现报道如下。
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1 材料与方法
1.1 细胞培养
K562/ADM(阿霉素)耐药细胞株由福建省肿瘤医院沈世人教授惠赠[5]，K562敏感细胞株来自我校肿瘤医院。两细胞株在RPMI-1640(Gibco)加20%小牛血清，并含青链霉素双抗各100u/ml的培养基中，于37℃、饱和湿度、5%CO2孵箱内连续传代培养；K562/ADM耐药细胞株在培养时加入终浓度为3.8μg/ml的阿霉素。
1.2 组织标本
45例初治病人肺部肿瘤标本采自我校肿瘤医院，为1998年5月至1998年9月手术后的肿瘤标本，均作病理检查确诊。其中鳞癌19例、腺癌15例、腺鳞癌4例、细支气管肺泡上皮细胞癌4例、肺部转移癌3例。病人年龄39～71岁(平均54.3岁);男性28人，女性17人。
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1.3 细胞与组织总RNA的提取
将106～107K562/ADM耐药株和K562不耐药株细胞或上述新鲜的肺癌组织0.1～0.2g，分别各加入1mlTrizol(Gibco)试剂，操作按说明进行。提取后的RNA测A260A280吸光值，要求A260/A280比值≥2.0，并计算出RNA含量。
1.4 引物、探针设计、合成、纯化
mdr-1参照文献[1]。上游引物5'-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3'，下游引物5'-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3'，扩增片段长度为167bp。自行设计探针如下：5'-CGCT-ACTGAAGCAATAGAAAACTT-3'，其中在5'端标记上荧光发光基团FAM(6-carboxy-fluore-sceinPE公司产品)，3'端标记上荧光淬灭基团TAMRA(6-carboxy-tetramethylrhodaminePE公司产品)。引物探针合成纯化在我们实验室完成。
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1.5 cDNA合成
在反应体积为10μl的逆转录管中，含2μg提自K562/ADM耐药株及K562不耐药株细胞的总RNA或病人肿瘤标本，50mmol/LTris-Cl(pH8.3)，40mmol/LKCl，7mmol/LMgCl2，1mmol/LDTT，0.01%BSA，1mmol/LdNTPs，20UMMLV逆转录酶(Sangon产品)，10URNA酶抑制剂(华美公司产品)，各15pmol/Lmdr-1下游引物，37℃，60min，95℃5min灭活逆转录酶。合成好的cDNA置-20℃备用。
1.6 定量阳性标准模板的克隆
采用T-A载体克隆方案，参照李新波等[6]介绍的方法进行。将mdr-1167bp扩增片段克隆至pUC18质粒中，抽提、纯化重组质粒，按1010拷贝数/μl浓度存于-20℃备用。
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1.7 荧光定量RT-PCR
荧光定量PCR的原理是：在PCR扩增系统中加入一段与靶基因互补的双荧光素标记探针(5'端荧光素称为报告基团，3’端荧光素称为淬灭基团)，在完整状态下探针5’端报告基团发出的荧光受到了3’端淬灭基团抑制而检测不到荧光；当PCR扩增时，随着引物沿模板的延伸，Taq酶具5’-3’的外切酶活性，可将位于扩增片段内的探针5’端的荧光素切下，切下的报告基团脱离了3’端淬灭基团的淬灭作用而发出荧光，切下的荧光素数量与扩增产物是一对一的关系，用检测仪检测荧光值的变化，即可准确判断扩增产物的量[3，4]。在判定结果时，用循环阈值(cyclethreshold，CT)作为临界点，该点位于PCR产物进入指数增长期的起始点。
50μlPCR反应体积中，含5XPCR反应液[50mmol/LTrisHCl(pH8.3)、10mmol/LMgCl2、250mmol/LKCl、1mg/ml明胶]10μl，mdr-1上下游引物各15pmol/L，荧光探针10pmol/L，Taq酶3U，和不同样本自100ngRNA逆转得到的cDNA，同时将定量模板梯度稀释，作标准曲线，在ABIPRISM7700型实时检测扩增仪上进行扩增，反应条件为93℃预变性3min，93℃40sec，55℃120sec共作40个循环。反应结束后用计算机将样本与标准曲线对比得出mdr-1基因表达的拷贝数。
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2 结果
2.1 定量阳性标准模板
pUC18T载体连接mdr-1PCR片段，经蓝白斑LB平板筛选，含氨苄青霉素80u/mlLB培养基培养，提取质粒后，行PCR扩增，有特异条带出现者，用建立的FQ-RT-PCR法检测，有强烈的荧光值增长，说明mdr1基因已成功克隆，将提取的质粒测OD值，含量为1.31μg/μl，折算为4.35×1011拷贝数/μl，用TE稀释成1010拷贝数/μl备用。
2.2 荧光定量RTPCR结果
PE7700型扩增检测仪在PCR反应进行的同时，每8sec检测一次PCR产物量，做到了实时检测。从图1可见，不同的标准起始模板数(107、106、105、104、103、102、101)在反应后的平台期，产物量相差不成比例，因此，采用终点法进行定量，结果会很不准确。而将检测的临界点定在PCR产物进入指数增长期的起始点即CT值处，由图1可见起始模板数与CT值成比例增长。将不同梯度定量模板数与其CT值关系经对数拟合作图，得到了定量标准曲线，样品与标准曲线比较就能准确反映待检样品的起始核酸量。在最佳反应条件下，1个拷贝起始模板数其CT值约为37～40，100个拷贝CT值约为30.5，因此，反应循环数定为40，可满足最低检测限的要求。
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图1 MDR1基因定量标准模板荧光实时
定量PCR的动力学曲线
荧光定量RT-PCR重复10次检测K562/ADM耐药株和K562不耐药株细胞mdr-1，所得结果为[(6.1，6.2，6.2，6.4，6.5，7.1，7.3，7.4，7.6，7.8)×107]拷贝/μgRNA，和[(7.7，7.8，7.9，8.0，8.2，8.6，8.7，9.2，9.3，9.5)×105]拷贝/μgRNA，平均分别为(6.86±0.65)×107拷贝/μgRNA和(8.49±0.67)×105拷贝/μgRNA，两者之比为80.8，变异系数分别为9.5%和7.9%。所配试剂在20℃保存半年，无明显变化。
在45例肺部肿瘤标本中，有12例检出有mdr-1基因的表达(见表1)，表达强度在4.9×102～3.2×105拷贝/μgRNA之间。其中一例来自大肠癌的肺部转移癌mdr-1基因表达量为3.2×105拷贝/μgRNA，追溯病史，该病人4年前患大肠癌，有化疗的经历。去除该例，则这11例病人mdr-1的平均表达量为3.9×104拷贝/μgRNA。
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表1 45例肺部肿瘤标本中检出12例mdr-1表达阳性结果
编号
性别
年龄(岁)
病理诊断
荧光定量RT-PCR结果
(拷贝/μgRNA)
1
男
56
鳞癌
9.7×103
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2
男
52
鳞癌
3.4×104
3
女
60
鳞癌
8.6×103
4
女
69
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低分化鳞癌
4.9×102
5
男
61
低分化鳞癌
1.5×105
6
男
42
腺癌
1.9×104
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7
男
71
腺癌
1.4×104
8
女
61
腺癌
9.1×104
9
男
64
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腺癌
8.9×104
10
男
47
腺鳞癌
1.0×104
11
女
50
细支气管肺泡细胞癌
3.8×103
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12
男
57
大肠癌肺转移
3.2×105
3 讨论
采用荧光定量RT-PCR方法为制定和统一mdr-1高表达的阈值标准，提供了一个新的思路。与常规PCR相比，荧光定量PCR技术具以下优点：可准确定量待检模板的拷贝数：当荧光信号达到检测点CT值时，PCR反应体系处于最佳的饱和状态，最能反应起始的模板数，克服了常规PCR由于平台效应带来的误差；闭管检测有效防止了因扩增产物污染而导致的假阳性，为该方法用于临床打下坚实基础；引物和探针特异地同目的模板结合，保障了检测的特异性；荧光检测的灵敏度显著高于肉眼观察电泳条带的灵敏度；操作简单、方便、安全、快速，整个过程由电脑控制，从加样到出结果仅需2.5h左右，不存在EB染液或同位素对人体的危害性问题；PE7700型荧光定量PCR仪有96个反应孔，可同时对大量的样品进行检测等[3，4]。荧光定量RT-PCR结果用拷贝数来表示，这种绝对数量显然更准确，易统一标准，这一指标不会因不同的实验室而改变。但采用荧光定量RT-PCR方法判定mdr-1高表达的阈值标准，尚需结合临床耐药标准，对不同的肿瘤进行大量标本的检测后才能得出，而这还需通过多家医院携手合作方可完成。
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对mRNA用RTPCR方法进行定量，还需考虑逆转录效率问题。Debuire等[7]曾将cDNA定量标准在体外用T3聚合酶转录成RNA，定量后再作逆转录，这一过程十分繁复，而且需要大量昂贵的T3聚合酶和其它试剂。Cross等[8]建议，在标准化实验条件后，如果是对某种mRNA进行动态监测，即可直接选用DNA作为定量模板。曹丽萍等[2]也指出用RNA作定量模板，其mdr-1mRNA量很少，系列稀释后更易降解，导致结果不稳定，且逆转录需大量昂贵的RNA酶抑制剂和逆转录酶，而用稳定的cDNA作竞争模板，操作简便，省时，也易于贮存，运输和标准化。本实验采用基因克隆的方法构建mdr-1基因cDNA定量模板，具有纯度高，来源广，定量准，安全易控制等优点，可广泛应用于检测。
在检测的45例肺癌病人中，发现有25%的初治肺癌病人有不同程度的mdr-1基因表达，mdr-1表达情况与肿瘤的病理分期无明显相关，这一结果同Shin的报道[9]相似。这说明一部分肺癌病人中存在着mdr-1的先天性表达。
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致谢：张晓实、林正、程钢、周新宇、李虎、许擎等在实验中提供大量帮助，谨致谢意。
基金项目：本课题受国家技术创新项目(No：1998-345)资助
通讯作者：高劲松：LTel：86-20-87331456 Fax：86-20-87333640 E-mail：gjs216@163.net
参考文献：
[1]Noonan KE， Beck C， Holzmayer TA， et al. Quantitative analysis of mdr 1 (multidrug resistance)gene expression in human tumors by polymerase chain reaction [J]. Proc Natl Acad Si USA， 1990， 87： 7160～ 7164.
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[2]曹丽萍，王斌，郁知非.多药耐药基因QRTPCR检测中内标准DNA和RNA模板的构[J].实验血液学杂志，1997，5(4)：393～398.
[3]Heid CA， Stevens J， Livak KJ， et al. Real time quantitative PCR [J]. Genome Res， 1996， 6(10)： 986～ 994.
[4]Gibson UE， Heid CA， Williams PM. A novel method for real time quantitative RT PCR [J]. Genome Res， 1996， 6(10)： 995～ 1001.
[5]沈世人，苏颖，黄秀清，等.K562/ADM耐药细胞株的建立及其生物学特性的初步观察[J].癌症，1992，11(3)：222～224.
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[6]李新波，赵小松，田德志，等.一种PCR产物克隆的新方法—T-A克隆法[J].生物化学与生物物理进展，1999，26(2)：187～189.
[7]Debuire B， Sol O， Lemoine A， et al. Nonisotopic competitive RT-PCR assay to measure mdr-1 gene expression [J]. Clin Chem， 1995， 41(6)： 819～ 825.
[8]Cross NC， Feng L， Chase A， et al. Competitive polymerase chain reaction to estimate the number of BCR ABL transcripts in chronic myeloid leukemia patients after bone marrow transplantation [J]. Blood， 1993， 82(6)： 1929～ 1936.
[9]Shin HJ， Lee JS， Hong WK， et al. Study of multidrug resistance (mdr1) gene in non small cell lung cancer [J]. Anticancer Res， 1992， 12(2)： 367～ 370.
收稿日期：1999-12-09
修稿日期：2000-01-12, 百拇医药