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编号:10228930
荧光定量RT-PCR检测mdr-1基因表达
http://www.100md.com 《癌症》 2000年第3期
     作者:高劲松 马刚 仝明 陈佩毅 王传华 何蕴韶

    单位:高劲松(中山医科大学达安基因诊断中心,广东广州510089);马刚(中山医科大学肿瘤防治中心胸外科,广东广州510060);仝明(中山医科大学肿瘤防治中心胸外科,广东广州510060);陈佩毅(中山医科大学达安基因诊断中心,广东广州510089);王传华(中山医科大学达安基因诊断中心,广东广州510089);何蕴韶(中山医科大学达安基因诊断中心,广东广州510089)

    关键词:荧光定量检测;RT-PCR;mdr-1基因;基因表达

    摘 要

    摘 要:目的:建立荧光定量RT-PCR检测肿瘤细胞mdr-1基因表达的方法,了解肺癌组织中mdr-1的表达水平。方法:建立荧光定量RTPCR方法,在PE7700型检测仪上定量检测K562/ADM耐药株和K562不耐药株细胞mdr1基因表达水平,同时检测45例初治肺部肿瘤病人组织标本。结果:荧光定量RT-PCR检测K562/ADM耐药株和K562不耐药株细胞mdr-1基因表达,重复10次实验所得结果平均分别为(6.86±0.65)×107拷贝/μgRNA和(8.49±0.67)×105拷贝/μgRNA,两者相差80.8倍,变异系数分别为9.5%和7.9%。45例肺部肿瘤中,有12例检出有mdr-1基因不同程度的表达。结论:荧光定量RT-PCR检测mdr1基因表达方法,检测结果用绝对拷贝数来表示,定量准确可靠,并有利于标准的统一。有1/4未经化疗的肺癌病人有一定水平mdr-1基因的表达。
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    分类号:R730.43 文献标识码:A

    文章编号:1000-467X(2000)03-0200-04

    The detection of mdr-1 gene expression using fluorogenic probe quantitative RT-PCR method

    GAO Jing-song et al.

    (Daan Gene Diagnosis Center of Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089, P.R.China)

    MA Gang TONG Ming

    (Cancer Center of Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060, P.R.China )
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    Abstract:Objectives: To establish a fluoregenic probe quantitative RT-PCR(FQ-RT-PCR) method for detecting the expression of mdr-1 gene in tumor cells and comprehend the expression of mdr-1 gene in patients with lung cancer. Method: The fluorogenic quantitative RT-PCR method for detecting the expression of mdr-1 gene was established successfully. K562/ADM, K562 cell line or forty-five tumor tissues from patients with lung cancer, were detected in the PE Applied Biosystems 7700 Sequence Detector. Results: After ten duplicate tests with FQ-RT-PCR method, the average level of the mdr-1 gene expression was( 6.86± 0.65)× 10 7copies/μ g RNA from K562/ADM cells and (8.49± 0.67)× 105 copies/μ g RNA from K562 cells, respectively, the former was 80.8 times greater than the latter,the coefficient variation (CV) was 9.5% and 7.9% , respectively. Of forty-five patients with lung cancer, 12 cases expressed of mdr-1 gene at various levels. Conclusions: The mdr-1 gene expression detected with the FQ-RT-PCR could be gotten an accurate quantitative result and the gene expression level be judged easily. Moreover, low levels of mdr-1 gene expression were observed in twenty-five percent of the patients with lung cancer.
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    Key words:Fluorogenic quantitative detecting; RT-PCR; mdr-1 gene; Gene expression▲

    常规检测mdr-1基因表达,多采用竞争RT-PCR法和内源性参比基因RT-PCR定量法[1,2];它们均属于PCR终点检测法,在PCR扩增的指数期和平台期产量相差极大,很难对起始模板数准确定量。此外,常规的RT-PCR方法还存在因产物污染而导致的假阳性、非特异性扩增、扩增后电泳操作造成误差(对同样的标本可有高达3~10倍的差异)及EB染液对人体有害等问题,妨碍了其在临床中的推广应用。

    新近出现的荧光定量PCR是PCR技术一个重大突破。该方法是在完全闭管的情况下,对PCR扩增产物进行检测,既彻底杜绝了PCR产物污染造成的假阳性问题,又能够对标本起始模板做到精确定量,已逐步成为PCR更新换代的新技术[3,4]。1997年我们于国内首先建立了荧光定量PCR技术,在此基础上,我们开展了荧光定量RTPCR检测肿瘤mdr1基因表达的研究,现报道如下。
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    1 材料与方法

    1.1 细胞培养

    K562/ADM(阿霉素)耐药细胞株由福建省肿瘤医院沈世人教授惠赠[5],K562敏感细胞株来自我校肿瘤医院。两细胞株在RPMI-1640(Gibco)加20%小牛血清,并含青链霉素双抗各100u/ml的培养基中,于37℃、饱和湿度、5%CO2孵箱内连续传代培养;K562/ADM耐药细胞株在培养时加入终浓度为3.8μg/ml的阿霉素。

    1.2 组织标本

    45例初治病人肺部肿瘤标本采自我校肿瘤医院,为1998年5月至1998年9月手术后的肿瘤标本,均作病理检查确诊。其中鳞癌19例、腺癌15例、腺鳞癌4例、细支气管肺泡上皮细胞癌4例、肺部转移癌3例。病人年龄39~71岁(平均54.3岁);男性28人,女性17人。
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    1.3 细胞与组织总RNA的提取

    将106~107K562/ADM耐药株和K562不耐药株细胞或上述新鲜的肺癌组织0.1~0.2g,分别各加入1mlTrizol(Gibco)试剂,操作按说明进行。提取后的RNA测A260A280吸光值,要求A260/A280比值≥2.0,并计算出RNA含量。

    1.4 引物、探针设计、合成、纯化

    mdr-1参照文献[1]。上游引物5'-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3',下游引物5'-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3',扩增片段长度为167bp。自行设计探针如下:5'-CGCT-ACTGAAGCAATAGAAAACTT-3',其中在5'端标记上荧光发光基团FAM(6-carboxy-fluore-sceinPE公司产品),3'端标记上荧光淬灭基团TAMRA(6-carboxy-tetramethylrhodaminePE公司产品)。引物探针合成纯化在我们实验室完成。
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    1.5 cDNA合成

    在反应体积为10μl的逆转录管中,含2μg提自K562/ADM耐药株及K562不耐药株细胞的总RNA或病人肿瘤标本,50mmol/LTris-Cl(pH8.3),40mmol/LKCl,7mmol/LMgCl2,1mmol/LDTT,0.01%BSA,1mmol/LdNTPs,20UMMLV逆转录酶(Sangon产品),10URNA酶抑制剂(华美公司产品),各15pmol/Lmdr-1下游引物,37℃,60min,95℃5min灭活逆转录酶。合成好的cDNA置-20℃备用。

    1.6 定量阳性标准模板的克隆

    采用T-A载体克隆方案,参照李新波等[6]介绍的方法进行。将mdr-1167bp扩增片段克隆至pUC18质粒中,抽提、纯化重组质粒,按1010拷贝数/μl浓度存于-20℃备用。
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    1.7 荧光定量RT-PCR

    荧光定量PCR的原理是:在PCR扩增系统中加入一段与靶基因互补的双荧光素标记探针(5'端荧光素称为报告基团,3’端荧光素称为淬灭基团),在完整状态下探针5’端报告基团发出的荧光受到了3’端淬灭基团抑制而检测不到荧光;当PCR扩增时,随着引物沿模板的延伸,Taq酶具5’-3’的外切酶活性,可将位于扩增片段内的探针5’端的荧光素切下,切下的报告基团脱离了3’端淬灭基团的淬灭作用而发出荧光,切下的荧光素数量与扩增产物是一对一的关系,用检测仪检测荧光值的变化,即可准确判断扩增产物的量[3,4]。在判定结果时,用循环阈值(cyclethreshold,CT)作为临界点,该点位于PCR产物进入指数增长期的起始点。

    50μlPCR反应体积中,含5XPCR反应液[50mmol/LTrisHCl(pH8.3)、10mmol/LMgCl2、250mmol/LKCl、1mg/ml明胶]10μl,mdr-1上下游引物各15pmol/L,荧光探针10pmol/L,Taq酶3U,和不同样本自100ngRNA逆转得到的cDNA,同时将定量模板梯度稀释,作标准曲线,在ABIPRISM7700型实时检测扩增仪上进行扩增,反应条件为93℃预变性3min,93℃40sec,55℃120sec共作40个循环。反应结束后用计算机将样本与标准曲线对比得出mdr-1基因表达的拷贝数。
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    2 结果

    2.1 定量阳性标准模板

    pUC18T载体连接mdr-1PCR片段,经蓝白斑LB平板筛选,含氨苄青霉素80u/mlLB培养基培养,提取质粒后,行PCR扩增,有特异条带出现者,用建立的FQ-RT-PCR法检测,有强烈的荧光值增长,说明mdr1基因已成功克隆,将提取的质粒测OD值,含量为1.31μg/μl,折算为4.35×1011拷贝数/μl,用TE稀释成1010拷贝数/μl备用。

    2.2 荧光定量RTPCR结果

    PE7700型扩增检测仪在PCR反应进行的同时,每8sec检测一次PCR产物量,做到了实时检测。从图1可见,不同的标准起始模板数(107、106、105、104、103、102、101)在反应后的平台期,产物量相差不成比例,因此,采用终点法进行定量,结果会很不准确。而将检测的临界点定在PCR产物进入指数增长期的起始点即CT值处,由图1可见起始模板数与CT值成比例增长。将不同梯度定量模板数与其CT值关系经对数拟合作图,得到了定量标准曲线,样品与标准曲线比较就能准确反映待检样品的起始核酸量。在最佳反应条件下,1个拷贝起始模板数其CT值约为37~40,100个拷贝CT值约为30.5,因此,反应循环数定为40,可满足最低检测限的要求。t20201.gif (10560 字节)
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    图1 MDR1基因定量标准模板荧光实时

    定量PCR的动力学曲线

    荧光定量RT-PCR重复10次检测K562/ADM耐药株和K562不耐药株细胞mdr-1,所得结果为[(6.1,6.2,6.2,6.4,6.5,7.1,7.3,7.4,7.6,7.8)×107]拷贝/μgRNA,和[(7.7,7.8,7.9,8.0,8.2,8.6,8.7,9.2,9.3,9.5)×105]拷贝/μgRNA,平均分别为(6.86±0.65)×107拷贝/μgRNA和(8.49±0.67)×105拷贝/μgRNA,两者之比为80.8,变异系数分别为9.5%和7.9%。所配试剂在20℃保存半年,无明显变化。

    在45例肺部肿瘤标本中,有12例检出有mdr-1基因的表达(见表1),表达强度在4.9×102~3.2×105拷贝/μgRNA之间。其中一例来自大肠癌的肺部转移癌mdr-1基因表达量为3.2×105拷贝/μgRNA,追溯病史,该病人4年前患大肠癌,有化疗的经历。去除该例,则这11例病人mdr-1的平均表达量为3.9×104拷贝/μgRNA。
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    表1 45例肺部肿瘤标本中检出12例mdr-1表达阳性结果

    编号

    性别

    年龄(岁)

    病理诊断

    荧光定量RT-PCR结果

    (拷贝/μgRNA)

    1

    男

    56

    鳞癌

    9.7×103
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    2

    男

    52

    鳞癌

    3.4×104

    3

    女

    60

    鳞癌

    8.6×103

    4

    女

    69
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    低分化鳞癌

    4.9×102

    5

    男

    61

    低分化鳞癌

    1.5×105

    6

    男

    42

    腺癌

    1.9×104
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    7

    男

    71

    腺癌

    1.4×104

    8

    女

    61

    腺癌

    9.1×104

    9

    男

    64
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    腺癌

    8.9×104

    10

    男

    47

    腺鳞癌

    1.0×104

    11

    女

    50

    细支气管肺泡细胞癌

    3.8×103
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    12

    男

    57

    大肠癌肺转移

    3.2×105

    3 讨论

    采用荧光定量RT-PCR方法为制定和统一mdr-1高表达的阈值标准,提供了一个新的思路。与常规PCR相比,荧光定量PCR技术具以下优点:可准确定量待检模板的拷贝数:当荧光信号达到检测点CT值时,PCR反应体系处于最佳的饱和状态,最能反应起始的模板数,克服了常规PCR由于平台效应带来的误差;闭管检测有效防止了因扩增产物污染而导致的假阳性,为该方法用于临床打下坚实基础;引物和探针特异地同目的模板结合,保障了检测的特异性;荧光检测的灵敏度显著高于肉眼观察电泳条带的灵敏度;操作简单、方便、安全、快速,整个过程由电脑控制,从加样到出结果仅需2.5h左右,不存在EB染液或同位素对人体的危害性问题;PE7700型荧光定量PCR仪有96个反应孔,可同时对大量的样品进行检测等[3,4]。荧光定量RT-PCR结果用拷贝数来表示,这种绝对数量显然更准确,易统一标准,这一指标不会因不同的实验室而改变。但采用荧光定量RT-PCR方法判定mdr-1高表达的阈值标准,尚需结合临床耐药标准,对不同的肿瘤进行大量标本的检测后才能得出,而这还需通过多家医院携手合作方可完成。
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    对mRNA用RTPCR方法进行定量,还需考虑逆转录效率问题。Debuire等[7]曾将cDNA定量标准在体外用T3聚合酶转录成RNA,定量后再作逆转录,这一过程十分繁复,而且需要大量昂贵的T3聚合酶和其它试剂。Cross等[8]建议,在标准化实验条件后,如果是对某种mRNA进行动态监测,即可直接选用DNA作为定量模板。曹丽萍等[2]也指出用RNA作定量模板,其mdr-1mRNA量很少,系列稀释后更易降解,导致结果不稳定,且逆转录需大量昂贵的RNA酶抑制剂和逆转录酶,而用稳定的cDNA作竞争模板,操作简便,省时,也易于贮存,运输和标准化。本实验采用基因克隆的方法构建mdr-1基因cDNA定量模板,具有纯度高,来源广,定量准,安全易控制等优点,可广泛应用于检测。

    在检测的45例肺癌病人中,发现有25%的初治肺癌病人有不同程度的mdr-1基因表达,mdr-1表达情况与肿瘤的病理分期无明显相关,这一结果同Shin的报道[9]相似。这说明一部分肺癌病人中存在着mdr-1的先天性表达。
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    致谢:张晓实、林正、程钢、周新宇、李虎、许擎等在实验中提供大量帮助,谨致谢意。

    基金项目:本课题受国家技术创新项目(No:1998-345)资助

    通讯作者:高劲松:LTel:86-20-87331456 Fax:86-20-87333640 E-mail:gjs216@163.net

    参考文献:

    [1]Noonan KE, Beck C, Holzmayer TA, et al. Quantitative analysis of mdr 1 (multidrug resistance)gene expression in human tumors by polymerase chain reaction [J]. Proc Natl Acad Si USA, 1990, 87: 7160~ 7164.
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    [2]曹丽萍,王斌,郁知非.多药耐药基因QRTPCR检测中内标准DNA和RNA模板的构[J].实验血液学杂志,1997,5(4):393~398.

    [3]Heid CA, Stevens J, Livak KJ, et al. Real time quantitative PCR [J]. Genome Res, 1996, 6(10): 986~ 994.

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    [5]沈世人,苏颖,黄秀清,等.K562/ADM耐药细胞株的建立及其生物学特性的初步观察[J].癌症,1992,11(3):222~224.
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    [6]李新波,赵小松,田德志,等.一种PCR产物克隆的新方法—T-A克隆法[J].生物化学与生物物理进展,1999,26(2):187~189.

    [7]Debuire B, Sol O, Lemoine A, et al. Nonisotopic competitive RT-PCR assay to measure mdr-1 gene expression [J]. Clin Chem, 1995, 41(6): 819~ 825.

    [8]Cross NC, Feng L, Chase A, et al. Competitive polymerase chain reaction to estimate the number of BCR ABL transcripts in chronic myeloid leukemia patients after bone marrow transplantation [J]. Blood, 1993, 82(6): 1929~ 1936.

    [9]Shin HJ, Lee JS, Hong WK, et al. Study of multidrug resistance (mdr1) gene in non small cell lung cancer [J]. Anticancer Res, 1992, 12(2): 367~ 370.

    收稿日期:1999-12-09

    修稿日期:2000-01-12, 百拇医药