人实体瘤BUdR离体标记BUdR/DNA双参数FCM测定Tpot的初步研究
作者：黎静 杨伟志 董秀月 侯友贤 王晓怀 殷蔚伯
单位：黎静(广州军区广州总医院放射肿瘤中心，广东广州510010)；杨伟志(中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院放疗科，北京100021)；董秀月(中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院放疗科，北京100021)；侯友贤(广州军区广州总医院放射肿瘤中心，广东广州510010)；王晓怀(广州军区广州总医院放射肿瘤中心，广东广州510010)；殷蔚伯(中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院放疗科，北京100021)
关键词：肿瘤潜在倍增时间；流式细胞仪；BUdR；离体标记
摘 要
摘 要：目的：探索人实体瘤标本BUdR离体标记BUdR/DNA双参数FCM测定Tpot的方法。方法：选用头颈肿瘤活检标本及直肠癌手术标本行离体溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BUdR)标记双参数流式细胞术(flowcytometry,FCM)测定肿瘤潜在倍增时间(Potentialdoublingtime,Tpot)。结果：头颈肿瘤活检标本标记结果为阴性，直肠癌手术标本离体标记结果与文献报道的在体标记的结果有较大的差异。结论：Tpot测定应尽可能采用在体BUdR标记,人实体瘤合适的离体标记方法需进一步摸索。
, 百拇医药
分类号：R7337;R7335 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)03-0245-04
Preliminary studies of determining Tpot in human solid tumor by BUdR incorporation in vitro and BUdR/DNA bivariate FCM
LI Jing et al.
(Department of Radiation Oncology,Liu Hua Qiao Hospital,Guangzhou 510010,P.R.China)
YANG Wei-zhi DONG Xiu-yue
, 百拇医药
(Department of Radiotherapy, Cancer Hospital, Chinese Academy of
Medical Sciences, Paking Union Medical College, Beijing 100021, P.R.China)
Abstract：Objective： To explore the way of determining Tpot in the human solid tumor using the method of BUdR incorporation in vitro and BUdR/DNA bivariate FCM. Methods： The bioptic samples of head and neck cancer and the surgical specimens of rectum cancer were used for Tpot measurement by BUdR incorporation in vitro and BUdR/DNA bivariate FCM. Results： There was no successful labeling in the bioptic samples of head and neck cancer. The labeling value in surgical specimens of rectum cancer was obviously different from the results of the in vivo labeling of other author's report. Conclusions： Tpot measured by in vivo BUdR labeling should be developed, and the more appopriate method of in vitro labeling should be further investigated.
, 百拇医药
Key words：Potential doubling time; Flow cytometry; BUdR; In vitro labeling▲
Tpot是指导临床设计放疗分割模式的有用指标,是影响头颈部肿瘤的独立预后因素。对增殖快的肿瘤需采用加速分割放疗,而对增殖慢的肿瘤最好采用常规分割放疗[1]。由于目前标记所需的人用BUdR国内很难得到,因此，欲将此项测定指标在我国推广应用，必须探索建立适合我国国情的能够对离体样本进行标记的检测方法。我们用人鼻咽癌裸小鼠移植瘤模型进行了BUdR标记BUdR/DNA双参数FCM测定Tpot的研究,建立了稳定的测定方法[2]，本研究用人活检和手术标本进行BUdR离体标记测定Tpot，以期为临床提供实用的测定方法，现将初步结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 肿瘤来源
, http://www.100md.com
我院门诊头颈肿瘤活检标本及直肠癌手术标本,所有的标本均经病理证实为癌。
1.2 离体标记
将标本置入生理盐水中洗净以去除血块及坏死组织,将肿瘤组织剪成1～2mm3组织块后,在含20%胎牛血清RPMI1640培养基、BUdR终浓度为0.1mmol、37℃、5%CO2、CO2孵箱中开放培养不同时间(即为离体标记时间)后去除培养基,PBS漂洗一次后用70%冷乙醇固定,-20℃冰箱保存。
1.3 盐酸胃蛋白酶法制备单细胞悬液
将经乙醇固定组织块在0.1NHCl0.4mg/ml胃蛋白酶中消化1小时(h),37℃水浴，间断剧烈振荡,过滤收集细胞,制备成单细胞及核悬液。
1.4 标记样品的免疫荧光染色
, 百拇医药
细胞悬液用PBS漂洗后加入2NHCl37℃水浴中变性20分钟,用PBT(PBS+Tween20)漂洗干净(2次)后加入鼠抗BUdR单克隆体(ZYMED公司产品)终浓度1∶50,室温下30分钟间断轻微振荡，PBT漂洗2次后加FITC羊抗鼠IgG(二抗,Sigma公司)终浓度1∶100,室温间断轻微振荡20分钟,漂洗后加PI终浓度10μg/ml,15～30分钟上机测定。
1.5 流式细胞术测定
Coulter公司的EPICS751流式细胞仪,激发波长为488nm,FITC发射波长为530nm,PI发射波长是610nm,用半对数坐标,得到BUdR/DNA含量双参数图。测定前先用荧光小球调整仪器状态,使其变异系数小于2%,每个样本计数10000个细胞。数据分析软件为ELITT。标记细胞其下限的确定取决于阴性对照(未标记BUdR)的非特异性染色水平(在纵坐标上位置),一般取10道以上的细胞为标记阳性细胞。本实验中仅有几个标记阳性细胞归为测定阴性。
, 百拇医药
1.6 细胞周期动力学参数的计算
主要参照BeggAC[3]的方法和公式分三步进行Tpot的计算。
a.计算相对运动(relativemovementRM)：
RM=(Flu-FG1)/(FG2M-FG1)
Flu：标记BUdR未分裂的S期细胞的平均DNA含量
FG1：G1期细胞的平均DNA含量。
FG2M：G2M期细胞的平均DNA含量。
, 百拇医药 b.计算细胞DNA合成持续时间(durationofSphase，Ts)
Ts=0.5t/(RM0.5)t：小时
c.计算Tpot值：
Tpot=λTs/LILI为标记指数λ取0.85
2 结果
2.1 头颈部肿瘤活检标本BUdR离体标记结果
共测定了14例头颈部肿瘤活检标本,其中鼻咽癌10例，舌癌2例，颊粘膜癌1例，硬腭癌1例，标本在0.1mmolBUdR、20%胎牛血清RPMI1640培养基、37℃、5%CO2、CO2孵箱中开放培养不同时间(离体标记时间)，其中标记2h：4例，6h：5例，8h：1例，19～22h：4例，结果均为阴性,头颈部肿瘤活检标本离体标记比较困难。
, 百拇医药
2.2 直肠癌手术标本BUdR离体标记不同时间的结果
实验开始时，共进行了5例直肠癌手术标本的测定，其中每例患者的标本剪碎成组织块后分成3份,分别孵育2h、6h、19～22h,共15份标本(阴性对照除外),12份得到完整的细胞动力学参数,失败的3份标本中,其中2份为技术原因,1份为标本操作时污染。由于前面的实验结果显示离体标记21h的LI相对较高,且在临床工作中此时间点比较方便,因此，又进行了5例直肠癌患者的手术标本离体标记19～22h的测定，获得了完整的细胞动力学参数。除外污染的1份标本，共测定了19份标本,测试成功率89%(17/19),结果见图1及表1。
表1 本实验室直肠癌离体标记结果
及与其它实验室直肠癌在体标记结果比较
(离体标记*)(
±S)
, 百拇医药
p
(在体标记△)
2h
6h
19～22h
1h
n
5
4
9
53
, 百拇医药
LI(%)
0.4±0.29
0.64±0.60
1.2±0.4
<0.05
16.10
(0.2～0.9)
(0.3～1.1)
(0.6～2.0)
(0.90～34.8)
Ts
(h)
, http://www.100md.com
3.0±1.1
8.0±3.3
33.3±16.5
<0.01
17.51
(1.8～4.2)
(5.0～12.5)
(19.7～70.0)
(4.57～57.5)
Tpot
(days)
32.9±28.0
, http://www.100md.com
63.8±46.8
111.3±72.3
<0.05
4.80
(13.4～74.4)
(13.3～110.7)
(44.3～269.8)
(0.90～27.1)
n：标本数,统计学采用方差分析；*本实验室结果，△：PatersonInst[4]
, 百拇医药
图1 直肠癌患者手术标本0.1mmol BUdR离体
标记20hBUdR/DNA双参数FCM测定得到的直方图
(纵坐标为BUdR含量，横坐标为DNA含量)
如图1所示,可在直方图上设置计算区域,确定S期、G1期、G2M期的计算区域,通过计算机处理,得到各期的DNA含量。在体标记的结果可作为离体标记比较的标准，由于国内尚未批准进行在体标记，因此我们把本实验室离体标记的测定结果与国外实验室在体标记的结果作了比较，从表1可见标记时间的长短直接影响到LI,随着标记时间的延长，LI、Ts、Tpot均增高,本实验室离体标记的各项参数与文献报道[4]的在体标记结果比较均有较大的差异。
3 讨论
, 百拇医药 我们对头颈部肿瘤的活检标本进行BUdR离体标记不同时间的结果均为阴性,可见头颈部肿瘤在普通培养条件下的离体标记难度较大,其主要原因可能是头颈部肿瘤在普通培养条件下S期细胞合成能力低下，其次标本活检时挤压比较严重影响细胞活力，因此尚需摸索头颈部肿瘤合适的BUdR离体标记方法。
Tpot测定是在tG2M前提下,RM与t呈线性关系,一般认为人体肿瘤的合适在体标记时间为4～8h,而离体标记的合适时间尚无很多经验。本实验直肠癌手术标本离体标记的结果显示,随着标记时间的延长,虽然LI得以提高,但是Ts随着标记时间的延长而增加,Tpot也明显增大,相对来说,离体标记2～6h的各项参数与在体标记的结果接近。本实验室普通培养条件下培养21～24h,其标记时间已超过Ts+TG2M,测定的Tpot已与临床推测的实际有效培增时间差距较大,已不是真正意义上的Tpot，因此在本实验室培养条件下,离体标记2～6h较为合适。这一结果也证明离体肿瘤细胞在合适的培养条件下S期细胞还具有一定的合成能力，这一结果与chavaudra[5]的结果一致。但国外[6～8]有结果表明离体标记时采用高压(10或3个大气压)、高氧及37℃水浴持续震荡的培养条件下,在体、离体测定的结果有很好的一致性，从理论上来说,在体、离体标记都有赖于血管的分布、组织的灌注以及肿瘤的生物学特性。以上所述的离体标记都是将瘤块剪成(1～2mm3)小组织块,孵化时深部的细胞标记较外周浅表组织细胞差,因此离体标记得到的LI比在体标记低是可以理解的。
, 百拇医药
成功完整的细胞动力学参数测定有赖于标本质量和测定的技术。标本应有较多的肿瘤细胞，离体标记中,必须保证足够数量有活性的肿瘤细胞,同时尽量保持干净无菌，其中测定技术主要包括核悬液的制备、DNA的变性、免疫荧光染色及FCM测定。BUdR或IUdR在体标记和BUdR/DNA双参数FCM测定成功率一般可达到80%～90%,在失败原因中,标本中肿瘤细胞太少占50%，技术原因占50%[9,10]。本实验直肠癌手术标本离体标记成功率达86%(15/19),与文献报道相似,说明我们实验室测定技术可靠和稳定。
由于在体标记得到的Tpot值与临床推测的数值较为一致，也更具有生物学意义，在头颈部鳞癌中，Tpot值5天在一些放疗中心已作为评估肿瘤增殖快慢的分界标准，因此，为了使细胞动力学参数便于与其它实验室结果比较，更好地指导临床,我们认为应尽可能地开展在体BUdR或IUdR标记双参数FCM测定Tpot的工作。离体标记法具有无需体内注射药物、患者容易接受、临床方便取材等优点,因此有一定的应用价值。我们实验室摸索的在普通培养条件下的离体标记方法无需特别的培养条件,易于推广,适合我国国情,但测定结果与在体标记有较大的差异，同时头颈部肿瘤活检标本的离体标记非常困难,因此在这一方法进入临床之前必须摸索更合适的离体培养条件,并进行大量的临床研究以确定出用本方法测定Tpot的分界标准,或做肿瘤患者自身在体、离体测定从而找出两种方法的换算公式。
, 百拇医药
致谢：本实验在流式细胞仪测定中得到了中国协和医科大学、中国医学科学院协和医院检验科王美健医生的大力帮助，特此致谢。
通讯作者：黎静：Tel：86-20-86662205-53478 Fax：86-20-86668019
参考文献：
[1]Corvo R,Giaretti W,Sanguinei G,et al.In vivo cell kinetics in head and neck squamous cell carcinomas predicts local control and help guide radiotherapy regime [J]. J Clin Oncol， 1995, 27： 1165～ 1172.
[2]黎静,杨伟志,董秀月，等.BUdR标记BUdR/DNA双参数流式细胞仪测定肿瘤潜在倍增时间的方法学研究[J].中华放射肿瘤学杂志，1998,7：17～21.
, 百拇医药
[3]Begg AC, Mcnally NJ, Shrieve DC,et al. A method to measure the duration of the DNA synthesis and potential doubling time from a single sample [J]. Cytometry， 1985,6： 620～ 626.
[4]Wilson MS,West CM,Wilson GD,et al. An assessment of the reliability and reproducibility of potential doubling times (Tpot)in human colorectal cancers [J]. Br J Cancer,1993,67： 754～ 759.
[5]Chavaudra N,Richard JM,Malaise EP.Labelling index of human squamous cell carcinomas comparison of in viro and in vitro labelling methods [J]. Cell Tissue Kinet,1979,12： 145～ 152.
, http://www.100md.com
[6]Sasaki K, Takashi M. Preservation of cell cycle characteristics in solid tumour in vitro [J]. Cancer Res, 1980, 40： 4810～ 4812.
[7]Kamata T, Yonemura Y,Sugiama K, et al. Proliferation activity of early gastric cancer measured by in vitro and in vivo bromodeoxyuridine labelling [J]. Cancer, 1989,64： 1665～ 1668.
[8]Wilson GD, Mcnally NJ, Dunphy E,et al.The labelling index of human and mouse tumours assessed by bromodeoxyuridine staining in vitro and in vivo and flow cytometry [J] .Cytometry,1985,6： 641～ 647.
, http://www.100md.com
[9]Lochrin CA, Wilson GD, Mcnally NJ,et al.Tumor cell kinetics,locol control,and accelerated radiotherapy： a preliminary report [J] . Int J Radiat Oncol Biol Phys,1992,24： 87～ 91.
[10]Dubray B, Maciorowsky Z,Cosset JM et al. Clinical value of the potential doubling time (Tpot)measured by flow cytometry [J]. Bull Cancer,1995,82： 331～ 338.
收稿日期：1999-04-06
修稿日期：1999-07-09, 百拇医药
单位：黎静(广州军区广州总医院放射肿瘤中心，广东广州510010)；杨伟志(中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院放疗科，北京100021)；董秀月(中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院放疗科，北京100021)；侯友贤(广州军区广州总医院放射肿瘤中心，广东广州510010)；王晓怀(广州军区广州总医院放射肿瘤中心，广东广州510010)；殷蔚伯(中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院放疗科，北京100021)
关键词：肿瘤潜在倍增时间；流式细胞仪；BUdR；离体标记
摘 要
摘 要：目的：探索人实体瘤标本BUdR离体标记BUdR/DNA双参数FCM测定Tpot的方法。方法：选用头颈肿瘤活检标本及直肠癌手术标本行离体溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BUdR)标记双参数流式细胞术(flowcytometry,FCM)测定肿瘤潜在倍增时间(Potentialdoublingtime,Tpot)。结果：头颈肿瘤活检标本标记结果为阴性，直肠癌手术标本离体标记结果与文献报道的在体标记的结果有较大的差异。结论：Tpot测定应尽可能采用在体BUdR标记,人实体瘤合适的离体标记方法需进一步摸索。
, 百拇医药
分类号：R7337;R7335 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)03-0245-04
Preliminary studies of determining Tpot in human solid tumor by BUdR incorporation in vitro and BUdR/DNA bivariate FCM
LI Jing et al.
(Department of Radiation Oncology,Liu Hua Qiao Hospital,Guangzhou 510010,P.R.China)
YANG Wei-zhi DONG Xiu-yue
, 百拇医药
(Department of Radiotherapy, Cancer Hospital, Chinese Academy of
Medical Sciences, Paking Union Medical College, Beijing 100021, P.R.China)
Abstract：Objective： To explore the way of determining Tpot in the human solid tumor using the method of BUdR incorporation in vitro and BUdR/DNA bivariate FCM. Methods： The bioptic samples of head and neck cancer and the surgical specimens of rectum cancer were used for Tpot measurement by BUdR incorporation in vitro and BUdR/DNA bivariate FCM. Results： There was no successful labeling in the bioptic samples of head and neck cancer. The labeling value in surgical specimens of rectum cancer was obviously different from the results of the in vivo labeling of other author's report. Conclusions： Tpot measured by in vivo BUdR labeling should be developed, and the more appopriate method of in vitro labeling should be further investigated.
, 百拇医药
Key words：Potential doubling time; Flow cytometry; BUdR; In vitro labeling▲
Tpot是指导临床设计放疗分割模式的有用指标,是影响头颈部肿瘤的独立预后因素。对增殖快的肿瘤需采用加速分割放疗,而对增殖慢的肿瘤最好采用常规分割放疗[1]。由于目前标记所需的人用BUdR国内很难得到,因此，欲将此项测定指标在我国推广应用，必须探索建立适合我国国情的能够对离体样本进行标记的检测方法。我们用人鼻咽癌裸小鼠移植瘤模型进行了BUdR标记BUdR/DNA双参数FCM测定Tpot的研究,建立了稳定的测定方法[2]，本研究用人活检和手术标本进行BUdR离体标记测定Tpot，以期为临床提供实用的测定方法，现将初步结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 肿瘤来源
, http://www.100md.com
我院门诊头颈肿瘤活检标本及直肠癌手术标本,所有的标本均经病理证实为癌。
1.2 离体标记
将标本置入生理盐水中洗净以去除血块及坏死组织,将肿瘤组织剪成1～2mm3组织块后,在含20%胎牛血清RPMI1640培养基、BUdR终浓度为0.1mmol、37℃、5%CO2、CO2孵箱中开放培养不同时间(即为离体标记时间)后去除培养基,PBS漂洗一次后用70%冷乙醇固定,-20℃冰箱保存。
1.3 盐酸胃蛋白酶法制备单细胞悬液
将经乙醇固定组织块在0.1NHCl0.4mg/ml胃蛋白酶中消化1小时(h),37℃水浴，间断剧烈振荡,过滤收集细胞,制备成单细胞及核悬液。
1.4 标记样品的免疫荧光染色
, 百拇医药
细胞悬液用PBS漂洗后加入2NHCl37℃水浴中变性20分钟,用PBT(PBS+Tween20)漂洗干净(2次)后加入鼠抗BUdR单克隆体(ZYMED公司产品)终浓度1∶50,室温下30分钟间断轻微振荡，PBT漂洗2次后加FITC羊抗鼠IgG(二抗,Sigma公司)终浓度1∶100,室温间断轻微振荡20分钟,漂洗后加PI终浓度10μg/ml,15～30分钟上机测定。
1.5 流式细胞术测定
Coulter公司的EPICS751流式细胞仪,激发波长为488nm,FITC发射波长为530nm,PI发射波长是610nm,用半对数坐标,得到BUdR/DNA含量双参数图。测定前先用荧光小球调整仪器状态,使其变异系数小于2%,每个样本计数10000个细胞。数据分析软件为ELITT。标记细胞其下限的确定取决于阴性对照(未标记BUdR)的非特异性染色水平(在纵坐标上位置),一般取10道以上的细胞为标记阳性细胞。本实验中仅有几个标记阳性细胞归为测定阴性。
, 百拇医药
1.6 细胞周期动力学参数的计算
主要参照BeggAC[3]的方法和公式分三步进行Tpot的计算。
a.计算相对运动(relativemovementRM)：
RM=(Flu-FG1)/(FG2M-FG1)
Flu：标记BUdR未分裂的S期细胞的平均DNA含量
FG1：G1期细胞的平均DNA含量。
FG2M：G2M期细胞的平均DNA含量。
, 百拇医药 b.计算细胞DNA合成持续时间(durationofSphase，Ts)
Ts=0.5t/(RM0.5)t：小时
c.计算Tpot值：
Tpot=λTs/LILI为标记指数λ取0.85
2 结果
2.1 头颈部肿瘤活检标本BUdR离体标记结果
共测定了14例头颈部肿瘤活检标本,其中鼻咽癌10例，舌癌2例，颊粘膜癌1例，硬腭癌1例，标本在0.1mmolBUdR、20%胎牛血清RPMI1640培养基、37℃、5%CO2、CO2孵箱中开放培养不同时间(离体标记时间)，其中标记2h：4例，6h：5例，8h：1例，19～22h：4例，结果均为阴性,头颈部肿瘤活检标本离体标记比较困难。
, 百拇医药
2.2 直肠癌手术标本BUdR离体标记不同时间的结果
实验开始时，共进行了5例直肠癌手术标本的测定，其中每例患者的标本剪碎成组织块后分成3份,分别孵育2h、6h、19～22h,共15份标本(阴性对照除外),12份得到完整的细胞动力学参数,失败的3份标本中,其中2份为技术原因,1份为标本操作时污染。由于前面的实验结果显示离体标记21h的LI相对较高,且在临床工作中此时间点比较方便,因此，又进行了5例直肠癌患者的手术标本离体标记19～22h的测定，获得了完整的细胞动力学参数。除外污染的1份标本，共测定了19份标本,测试成功率89%(17/19),结果见图1及表1。
表1 本实验室直肠癌离体标记结果
及与其它实验室直肠癌在体标记结果比较
(离体标记*)(
±S), 百拇医药
p
(在体标记△)
2h
6h
19～22h
1h
n
5
4
9
53
, 百拇医药
LI(%)
0.4±0.29
0.64±0.60
1.2±0.4
<0.05
16.10
(0.2～0.9)
(0.3～1.1)
(0.6～2.0)
(0.90～34.8)
Ts
(h)
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3.0±1.1
8.0±3.3
33.3±16.5
<0.01
17.51
(1.8～4.2)
(5.0～12.5)
(19.7～70.0)
(4.57～57.5)
Tpot
(days)
32.9±28.0
, http://www.100md.com
63.8±46.8
111.3±72.3
<0.05
4.80
(13.4～74.4)
(13.3～110.7)
(44.3～269.8)
(0.90～27.1)
n：标本数,统计学采用方差分析；*本实验室结果，△：PatersonInst[4]
, 百拇医药
图1 直肠癌患者手术标本0.1mmol BUdR离体
标记20hBUdR/DNA双参数FCM测定得到的直方图
(纵坐标为BUdR含量，横坐标为DNA含量)
如图1所示,可在直方图上设置计算区域,确定S期、G1期、G2M期的计算区域,通过计算机处理,得到各期的DNA含量。在体标记的结果可作为离体标记比较的标准，由于国内尚未批准进行在体标记，因此我们把本实验室离体标记的测定结果与国外实验室在体标记的结果作了比较，从表1可见标记时间的长短直接影响到LI,随着标记时间的延长，LI、Ts、Tpot均增高,本实验室离体标记的各项参数与文献报道[4]的在体标记结果比较均有较大的差异。
3 讨论
, 百拇医药 我们对头颈部肿瘤的活检标本进行BUdR离体标记不同时间的结果均为阴性,可见头颈部肿瘤在普通培养条件下的离体标记难度较大,其主要原因可能是头颈部肿瘤在普通培养条件下S期细胞合成能力低下，其次标本活检时挤压比较严重影响细胞活力，因此尚需摸索头颈部肿瘤合适的BUdR离体标记方法。
Tpot测定是在t
, 百拇医药
成功完整的细胞动力学参数测定有赖于标本质量和测定的技术。标本应有较多的肿瘤细胞，离体标记中,必须保证足够数量有活性的肿瘤细胞,同时尽量保持干净无菌，其中测定技术主要包括核悬液的制备、DNA的变性、免疫荧光染色及FCM测定。BUdR或IUdR在体标记和BUdR/DNA双参数FCM测定成功率一般可达到80%～90%,在失败原因中,标本中肿瘤细胞太少占50%，技术原因占50%[9,10]。本实验直肠癌手术标本离体标记成功率达86%(15/19),与文献报道相似,说明我们实验室测定技术可靠和稳定。
由于在体标记得到的Tpot值与临床推测的数值较为一致，也更具有生物学意义，在头颈部鳞癌中，Tpot值5天在一些放疗中心已作为评估肿瘤增殖快慢的分界标准，因此，为了使细胞动力学参数便于与其它实验室结果比较，更好地指导临床,我们认为应尽可能地开展在体BUdR或IUdR标记双参数FCM测定Tpot的工作。离体标记法具有无需体内注射药物、患者容易接受、临床方便取材等优点,因此有一定的应用价值。我们实验室摸索的在普通培养条件下的离体标记方法无需特别的培养条件,易于推广,适合我国国情,但测定结果与在体标记有较大的差异，同时头颈部肿瘤活检标本的离体标记非常困难,因此在这一方法进入临床之前必须摸索更合适的离体培养条件,并进行大量的临床研究以确定出用本方法测定Tpot的分界标准,或做肿瘤患者自身在体、离体测定从而找出两种方法的换算公式。
, 百拇医药
致谢：本实验在流式细胞仪测定中得到了中国协和医科大学、中国医学科学院协和医院检验科王美健医生的大力帮助，特此致谢。
通讯作者：黎静：Tel：86-20-86662205-53478 Fax：86-20-86668019
参考文献：
[1]Corvo R,Giaretti W,Sanguinei G,et al.In vivo cell kinetics in head and neck squamous cell carcinomas predicts local control and help guide radiotherapy regime [J]. J Clin Oncol， 1995, 27： 1165～ 1172.
[2]黎静,杨伟志,董秀月，等.BUdR标记BUdR/DNA双参数流式细胞仪测定肿瘤潜在倍增时间的方法学研究[J].中华放射肿瘤学杂志，1998,7：17～21.
, 百拇医药
[3]Begg AC, Mcnally NJ, Shrieve DC,et al. A method to measure the duration of the DNA synthesis and potential doubling time from a single sample [J]. Cytometry， 1985,6： 620～ 626.
[4]Wilson MS,West CM,Wilson GD,et al. An assessment of the reliability and reproducibility of potential doubling times (Tpot)in human colorectal cancers [J]. Br J Cancer,1993,67： 754～ 759.
[5]Chavaudra N,Richard JM,Malaise EP.Labelling index of human squamous cell carcinomas comparison of in viro and in vitro labelling methods [J]. Cell Tissue Kinet,1979,12： 145～ 152.
, http://www.100md.com
[6]Sasaki K, Takashi M. Preservation of cell cycle characteristics in solid tumour in vitro [J]. Cancer Res, 1980, 40： 4810～ 4812.
[7]Kamata T, Yonemura Y,Sugiama K, et al. Proliferation activity of early gastric cancer measured by in vitro and in vivo bromodeoxyuridine labelling [J]. Cancer, 1989,64： 1665～ 1668.
[8]Wilson GD, Mcnally NJ, Dunphy E,et al.The labelling index of human and mouse tumours assessed by bromodeoxyuridine staining in vitro and in vivo and flow cytometry [J] .Cytometry,1985,6： 641～ 647.
, http://www.100md.com
[9]Lochrin CA, Wilson GD, Mcnally NJ,et al.Tumor cell kinetics,locol control,and accelerated radiotherapy： a preliminary report [J] . Int J Radiat Oncol Biol Phys,1992,24： 87～ 91.
[10]Dubray B, Maciorowsky Z,Cosset JM et al. Clinical value of the potential doubling time (Tpot)measured by flow cytometry [J]. Bull Cancer,1995,82： 331～ 338.
收稿日期：1999-04-06
修稿日期：1999-07-09, 百拇医药