RT－PCR检测CEA分泌性肿瘤患者血中的CEAmRNA
作者：李荔霞 王晓怀 郑文岭 王捷 林金容
单位：李荔霞(广州军区广州总医院肿瘤科，广东广州510010)；王晓怀(广州军区广州总医院肿瘤科，广东广州510010)；郑文岭(广州军区广州总医院医学实验科,广东广州510010)；王捷(广州军区广州总医院医学实验科,广东广州510010)；林金容(广州军区广州总医院肿瘤科，广东广州510010)
关键词：RT；PCR；CEA分泌性肿瘤；CEAmRNA；外周血；基因检测
癌症000308
摘 要：目的：建立一种外周血循环中肿瘤微转移检测的方法。方法：20例CEA分泌性肿瘤患者及8例健康对照，用逆转录PCR(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction,简称为RT-PCR)方法检测血中的CEAmRNA，同时用放免法检测血清CEA水平。结果：20例患者CEAmRNA阳性率为55%，而健康对照均为阴性。外周血CEAmRNA的存在与CEA分泌性肿瘤远处转移密切相关，而与CEA水平无明显关系。结论：RT-PCR是肿瘤微循环检测的灵敏方法，血中CEAmRNA阳性提示肿瘤的早期转移。
, http://www.100md.com
分类号：R730.4 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)03-0222-04
Detection of CEA mRNA in peripheral blood from patients
with CEA-secreting-neoplasms
LI Li-xia1 WANG Xiao-huai1 et al.
(Department of Oncology,Guangzhou General Hospital of PLA,Guangzhou 510010,P.R.China)
ZHENG Wen-ling
, 百拇医药
(Department of Medical Research,Guangzhou General Hospital of PLA,Guangzhou 510010,P.R.China)
Abstract：Objective： To establish a method for detecting tumor micrometastasis in peripheral blood. Methods： Reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)was used to detect CEA mRNA in peripheral blood from 20 patients with CEA-secreting-neoplasms and 8 normal healthy volunteers.The serum CEA level was also determined by radioimmunoassay. Results：The CEA mRNA positive rate was 55% the in patients while was not detected in samples from normal healthy volunteers.The presence of CEA mRNA in blood was correlated with the presence of distant metastasis of CEA-secreting neoplasms but not to the level of serum CEA. Conclusion：RT-PCR is a sensitive method for detecting CEA mRNA in peripheral blood which might predict early metastasis of tumor cells.
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Key words：RT-PCR; CEA-secreting neoplasms; CEA mRNA; Peripheral blood; Genic detecting▲
在肿瘤的临床治疗中，肿瘤复发和转移是个常见而棘手的问题。自1984年以来，检测肿瘤微转移已被众多学者所关注[1]。既往的形态学、免疫组化等方法无法检测出存在于血液、骨髓及淋巴结等处的肿瘤微转移灶。RT-PCR技术可望解决这个问题。本文采用巢式RT-PCR检测CEA分泌性肿瘤特异的CEAmRNA在外周血有核细胞成分中的表达，探讨其在检测肿瘤微转移中的意义。
1 材料及方法
1.1 检测对象
结、直肠癌患者共20例，其中结肠癌5例，直肠癌15例,均为1999年3月至1999年6月我院住院病人。患者入院后常规行血清CEA放免检测。正常对照8例均为我院医务人员。
, 百拇医药
1.2 细胞的收集及总RNA的抽提
抽取新鲜肝素抗凝血5ml，用淋巴细胞分离液进行有核细胞的分离。采用Trizol试剂(Gibco公司)进行细胞总RNA的抽提。
1.3 RNA鉴定
用紫外分光光度计测定OD值，并行1%琼脂糖凝胶电泳观察。
1.4 逆转录反应合成cDNA
取1～2μg细胞总RNA，用PrimerB(1.0μmol/L，序列及来源见后)进行逆转录。反应体系中还有MMLV逆转录酶和5×Buffer(Amersham公司)、10×dNTP(Promega公司)、Rnasin(华美公司)。反应条件：37℃水浴1h，95℃灭活逆转录酶5min。
1.5 巢式PCR
, 百拇医药
参考文献[2]设计3个引物，由上海生物工程研究中心合成。引物序列如下：PrimerA5′-TCTGGAACTTCTCCTGGTCTCTCAGCTGG;PrimerB5′-TGTAGCTGTTGCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC和PrimerC5′-GGGCCACTGTCGGCATCATGATTGG。
取逆转录反应产物2μl行第一轮PCR。反应体系中引物为Primer A和Primer B(各0.2μmol/L)，另有10×PCR Buffer,10×dNTP等。反应条件：97℃变性5min,冰浴冷却，加入Taq酶(0.5U)。95℃变性1min、72℃退火及延伸2min,循环30次，72℃延伸10min。取第一轮PCR反应产物2μl行第二轮PCR,引物为PrimerC和PrimerB(各0.2μmol/L),反应条件：97℃变性5min,冰浴冷却，加入Taq酶(0.5U)。95℃变性1min、69℃退火1min、72℃延伸1min,循环30次，72℃延伸10min后终止反应。
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1.6 结果分析
PCR终产物行5%聚丙烯酰胺凝胶电泳，CEAmRNA阳性者可见131bp条带,以肉眼能明确判定有此电泳扩增带为阳性标准。收集PCR阳性产物作DNA序列分析。统计分析：采用χ2检测，分析组间差异。
2 结果
2.1 RNA鉴定
病人外周血有核细胞组分抽提的细胞总RNA经测定其OD260/280比值在1.5～1.8之间。细胞总RNA做1%琼脂糖凝胶电泳分析：28S、18S条带清晰可见。
2.2 PCR产物鉴定
2.2.15%聚丙烯酰胺凝胶电泳结果：取病人及正常人血细胞PCR产物、质粒pCMV-CEAPCR产物、胃癌803细胞株PCR产物进行电泳。CEAmRNA阳性病人与质粒CEA、胃癌细胞株均在131bp处出现一条带，正常人及阴性对照则无此条带，如图1所示。
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图1 外周血CEAmRNAPCR阳性产物
1,8.Marker:pGEM7zf(+)HaeⅢ；2.质粒pCMVCEAPCR产物；
3.胃癌803细胞株PCR产物；4，5.病人外周血PCR产物；
6.正常人外周血PCR产物；7.阴性对照
2.2.2 CEAmRNA PCR产物DNA测序结果：用末端终止法在Model310型DNA测序仪上对PCR阳性产物进行DNA序列分析，其结果见图2。序列结果与文献报道的CEAcDNA序列第2057-2159位100%相符[3]，证明了扩增产物的特异性。
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图2 CEAmRNAPCR产物DNA测序结果
2.3 外周血CEAmRNA与临床参数的关系
20例病人中，有远处转移者5例，CEAmRNA均阳性。而15例临床无明显转移征兆的病人中，CEAmRNA阳性有6例。经统计学分析，有远处转移组外周血CEAmRNA阳性率显著高于无远处转移组(P<0.05)，如表1所示.11例CEA mRNA 阳性的病人血清CEA水平有4例高于正常值，9例CEA mRNA阴性者有2例高于正常值，阳性与阴性组间血清CEA浓度无显著性差异(P<0.05)，见表2。
表1 外周血CEAmRNA与远处转移的关系
远处转移
n
CEAmRNA阳性数
, http://www.100md.com
阳性率(%)
有
5
5
100
无
15
6
40
*χ2=5.45,0.01
表2 CEA mRNA与血清CEA阳性率的关系
CEAmRNA
, http://www.100md.com
n
CEA<15μg/L
CEA>15μg/L
阳性
11
7
4
阴性
9
7
2
*χ2=0.47,0.25
3 讨论
CEA分泌性肿瘤是临床最常见的一类恶性肿瘤，它包括几乎所有的结肠、直肠癌，40%以上的胃、胰腺、乳腺等肿瘤[2]。除了提高手术水平，早期诊断、及时治疗是提高疗效的重要措施。在检测肿瘤微转移方面，分子生物学的方法已越来越受重视。逆转录PCR技术是在PCR基础上发展起来的基因诊断方法,能快速扩增肿瘤细胞内特异基因或DNA片段,其灵敏度可达(2～5)×107。在RT-PCR技术的运用过程中，标志基因的选择显得非常重要。以肿瘤特异性表达基因作为靶向，可使肿瘤检测的特异性大大增加。但多数常见实体瘤缺乏特异性基因，故实际多选择组织特异性或肿瘤相关性靶基因进行检测，如PSA mRNA[4]、AFP mRNA[5]、CK mRNA[6]等。CEA mRNA几乎能在所有的上皮细胞包括癌细胞中被检测出，而在非上皮细胞中检测不出。如果在血中检测出CEA mRNA，则意味着异位的存在，由此推断表达CEA的肿瘤细胞有存在的可能[7]。CEA mRNA虽然不是肿瘤特异性抗原，但它已成为CEA分泌性肿瘤的标志基因。
, 百拇医药
选择CEA mRNA作为肿瘤标志物进行检测开始于Gerhard等人对骨髓的研究。他采用巢式RT-PCR技术，在21例腹部肿瘤和乳腺癌患者的骨髓中，发现CEA基因表达阳性者14例，提示骨髓微转移的存在，而56份对照组均为阴性[2]。在此基础上，其他学者又分别从外周血、淋巴结及腹水[8,9,10]等多途径进行CEA mRNA检测，均获得DNA扩增的成功。国内尚未见有关报道。
本文采用敏感的巢式RT-PCR，20例结、直肠癌患者检出CEAmRNA有11例，阳性率为55%,而正常人血中均未检出,提示11例阳性是由脱落到循环中的肿瘤细胞产生,也意味着外周微转移的存在。我们发现，有远处转移组外周血CEAmRNA的阳性率显著高于无远处转移组,说明CEAmRNA阳性率与肿瘤远处转移密切相关。本实验中有远处转移的病例,CEA mRNA均为阳性。这表明肿瘤的早期转移。临床无明显转移征象的15例患者有6例检出CEA mRNA阳性。经3～6个月的随访，该6例患者中有1例出现转移征象。这表明CEAmRNA在肿瘤转移早期诊断方面具有重要的意义。从表2可知，CEA mRNA阳性率与血清CEA是否升高无显著相关性。血清CEA的浓度高低只能提供肿瘤原发灶的信息，而不能反映肿瘤的转移。
, http://www.100md.com
以上研究提示应用巢式RT-PCR在CEA分泌性肿瘤外周血检出CEA mRNA很可能与循环中存在转移的癌细胞有关，它不仅是反映CEA分泌性肿瘤血源性播散的灵敏指标，而且对指导选择治疗方案和判断预后都有重要意义。RT-PCR技术的高度敏感性和特异性，使肿瘤微转移的早期诊断成为可能，为判断病情、指导治疗提供了更可靠的依据。
基金项目：本课题受广东省自然科学基金(编号960667)及广东省卫生厅“五个一”工程重点课题基金资助
通讯作者：王晓怀：Tel：86-20-8662205-53479 E-mal：llxfj@163.ent
参考文献：
[1]Redding WH, Coombes RC,Monaghan P, et al. Detection of micrometastates in patients with primary breast cancer [J]. Lancet,1983， 3： 1271～ 1274.
, 百拇医药
[2]Gerhard M, Juhl H, Kalthoff H, et al. Specific detection of carcinoembryonic antigen expressing tumor cells in bone marrow aspirates by polymerase chain reaction [J]. J Clin Oncol,1994， 12(4)： 725～ 729.
[3]Beauchemin N, Benchimol S, Cournoyer D, et al. Isolation and characterization of full-length functional cDNA clones for human carcinoembryonic antigen [J]. Mol Cell Biol,1987， 7(9)： 3221～ 3230.
[4]Moreno JG, Croce CM,Fischer R,et al.Detection of hematogenous micrometastasis in patients with prostate cancer [J]. Cancer Res,1992,52： 6110～ 6112.
, 百拇医药
[5]Hillaire S, Barbu V,Boucher E,et al.Albumin messeger RNA as a marker of circulating hepatocytes in hepatocellular carcinoma[J]. Gastroenterology, 1994， 106(1)： 239～ 242.
[6]Burchill SA,Bradburg MF, Pittman K,et al.Detection of epithelial cancer cells in peripheral blood by reverse transcriptase-polymerase chain reaction [J]. BR J Cancer 1995， 71(3)： 278～ 281.
[7]Mori M, Mimori K, Ueo H, et al. Molecular detection of circulating solid carcinoma cells in the peripheral blood： The concept of early systemic disease [J]. Int J Cancer,1996， 68： 739～ 743.
, 百拇医药
[8]Jonas S, Windeatt S, O-Boateng A, et al. Identification of carcinoembryonic antigen producing cells circulating in the blood of patients with colorectal carcinoma by reverse transcriptase polymerase chain reaction [J]. Gut,1996， 39： 717～ 721.
[9]Mori M, Mimori K, Inoue H, et al. Detection of cancer micrometastases in lymph nodes by reverse transcriptase-polymerase chain reaction [J]. Cancer Research, 1995， 55： 3417～ 3420.
[10]Nakanishi H, Kodera Y, Torii A, et al. Detection of carcinoembryonic antigen expressing free tumor cells in peritoneal washs from patients with gastric carcinoma by polymerase chain reaction [J]. Jpn J Cancer Res,1997， 88(7)： 687～ 692.
收稿日期：1999-08-06
修稿日期：1999-09-24, 百拇医药
单位：李荔霞(广州军区广州总医院肿瘤科，广东广州510010)；王晓怀(广州军区广州总医院肿瘤科，广东广州510010)；郑文岭(广州军区广州总医院医学实验科,广东广州510010)；王捷(广州军区广州总医院医学实验科,广东广州510010)；林金容(广州军区广州总医院肿瘤科，广东广州510010)
关键词：RT；PCR；CEA分泌性肿瘤；CEAmRNA；外周血；基因检测
癌症000308
摘 要：目的：建立一种外周血循环中肿瘤微转移检测的方法。方法：20例CEA分泌性肿瘤患者及8例健康对照，用逆转录PCR(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction,简称为RT-PCR)方法检测血中的CEAmRNA，同时用放免法检测血清CEA水平。结果：20例患者CEAmRNA阳性率为55%，而健康对照均为阴性。外周血CEAmRNA的存在与CEA分泌性肿瘤远处转移密切相关，而与CEA水平无明显关系。结论：RT-PCR是肿瘤微循环检测的灵敏方法，血中CEAmRNA阳性提示肿瘤的早期转移。
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分类号：R730.4 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)03-0222-04
Detection of CEA mRNA in peripheral blood from patients
with CEA-secreting-neoplasms
LI Li-xia1 WANG Xiao-huai1 et al.
(Department of Oncology,Guangzhou General Hospital of PLA,Guangzhou 510010,P.R.China)
ZHENG Wen-ling
, 百拇医药
(Department of Medical Research,Guangzhou General Hospital of PLA,Guangzhou 510010,P.R.China)
Abstract：Objective： To establish a method for detecting tumor micrometastasis in peripheral blood. Methods： Reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)was used to detect CEA mRNA in peripheral blood from 20 patients with CEA-secreting-neoplasms and 8 normal healthy volunteers.The serum CEA level was also determined by radioimmunoassay. Results：The CEA mRNA positive rate was 55% the in patients while was not detected in samples from normal healthy volunteers.The presence of CEA mRNA in blood was correlated with the presence of distant metastasis of CEA-secreting neoplasms but not to the level of serum CEA. Conclusion：RT-PCR is a sensitive method for detecting CEA mRNA in peripheral blood which might predict early metastasis of tumor cells.
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Key words：RT-PCR; CEA-secreting neoplasms; CEA mRNA; Peripheral blood; Genic detecting▲
在肿瘤的临床治疗中，肿瘤复发和转移是个常见而棘手的问题。自1984年以来，检测肿瘤微转移已被众多学者所关注[1]。既往的形态学、免疫组化等方法无法检测出存在于血液、骨髓及淋巴结等处的肿瘤微转移灶。RT-PCR技术可望解决这个问题。本文采用巢式RT-PCR检测CEA分泌性肿瘤特异的CEAmRNA在外周血有核细胞成分中的表达，探讨其在检测肿瘤微转移中的意义。
1 材料及方法
1.1 检测对象
结、直肠癌患者共20例，其中结肠癌5例，直肠癌15例,均为1999年3月至1999年6月我院住院病人。患者入院后常规行血清CEA放免检测。正常对照8例均为我院医务人员。
, 百拇医药
1.2 细胞的收集及总RNA的抽提
抽取新鲜肝素抗凝血5ml，用淋巴细胞分离液进行有核细胞的分离。采用Trizol试剂(Gibco公司)进行细胞总RNA的抽提。
1.3 RNA鉴定
用紫外分光光度计测定OD值，并行1%琼脂糖凝胶电泳观察。
1.4 逆转录反应合成cDNA
取1～2μg细胞总RNA，用PrimerB(1.0μmol/L，序列及来源见后)进行逆转录。反应体系中还有MMLV逆转录酶和5×Buffer(Amersham公司)、10×dNTP(Promega公司)、Rnasin(华美公司)。反应条件：37℃水浴1h，95℃灭活逆转录酶5min。
1.5 巢式PCR
, 百拇医药
参考文献[2]设计3个引物，由上海生物工程研究中心合成。引物序列如下：PrimerA5′-TCTGGAACTTCTCCTGGTCTCTCAGCTGG;PrimerB5′-TGTAGCTGTTGCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC和PrimerC5′-GGGCCACTGTCGGCATCATGATTGG。
取逆转录反应产物2μl行第一轮PCR。反应体系中引物为Primer A和Primer B(各0.2μmol/L)，另有10×PCR Buffer,10×dNTP等。反应条件：97℃变性5min,冰浴冷却，加入Taq酶(0.5U)。95℃变性1min、72℃退火及延伸2min,循环30次，72℃延伸10min。取第一轮PCR反应产物2μl行第二轮PCR,引物为PrimerC和PrimerB(各0.2μmol/L),反应条件：97℃变性5min,冰浴冷却，加入Taq酶(0.5U)。95℃变性1min、69℃退火1min、72℃延伸1min,循环30次，72℃延伸10min后终止反应。
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1.6 结果分析
PCR终产物行5%聚丙烯酰胺凝胶电泳，CEAmRNA阳性者可见131bp条带,以肉眼能明确判定有此电泳扩增带为阳性标准。收集PCR阳性产物作DNA序列分析。统计分析：采用χ2检测，分析组间差异。
2 结果
2.1 RNA鉴定
病人外周血有核细胞组分抽提的细胞总RNA经测定其OD260/280比值在1.5～1.8之间。细胞总RNA做1%琼脂糖凝胶电泳分析：28S、18S条带清晰可见。
2.2 PCR产物鉴定
2.2.15%聚丙烯酰胺凝胶电泳结果：取病人及正常人血细胞PCR产物、质粒pCMV-CEAPCR产物、胃癌803细胞株PCR产物进行电泳。CEAmRNA阳性病人与质粒CEA、胃癌细胞株均在131bp处出现一条带，正常人及阴性对照则无此条带，如图1所示。
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图1 外周血CEAmRNAPCR阳性产物
1,8.Marker:pGEM7zf(+)HaeⅢ；2.质粒pCMVCEAPCR产物；
3.胃癌803细胞株PCR产物；4，5.病人外周血PCR产物；
6.正常人外周血PCR产物；7.阴性对照
2.2.2 CEAmRNA PCR产物DNA测序结果：用末端终止法在Model310型DNA测序仪上对PCR阳性产物进行DNA序列分析，其结果见图2。序列结果与文献报道的CEAcDNA序列第2057-2159位100%相符[3]，证明了扩增产物的特异性。
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图2 CEAmRNAPCR产物DNA测序结果
2.3 外周血CEAmRNA与临床参数的关系
20例病人中，有远处转移者5例，CEAmRNA均阳性。而15例临床无明显转移征兆的病人中，CEAmRNA阳性有6例。经统计学分析，有远处转移组外周血CEAmRNA阳性率显著高于无远处转移组(P<0.05)，如表1所示.11例CEA mRNA 阳性的病人血清CEA水平有4例高于正常值，9例CEA mRNA阴性者有2例高于正常值，阳性与阴性组间血清CEA浓度无显著性差异(P<0.05)，见表2。
表1 外周血CEAmRNA与远处转移的关系
远处转移
n
CEAmRNA阳性数
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阳性率(%)
有
5
5
100
无
15
6
40
*χ2=5.45,0.01
表2 CEA mRNA与血清CEA阳性率的关系
CEAmRNA
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n
CEA<15μg/L
CEA>15μg/L
阳性
11
7
4
阴性
9
7
2
*χ2=0.47,0.25
3 讨论
CEA分泌性肿瘤是临床最常见的一类恶性肿瘤，它包括几乎所有的结肠、直肠癌，40%以上的胃、胰腺、乳腺等肿瘤[2]。除了提高手术水平，早期诊断、及时治疗是提高疗效的重要措施。在检测肿瘤微转移方面，分子生物学的方法已越来越受重视。逆转录PCR技术是在PCR基础上发展起来的基因诊断方法,能快速扩增肿瘤细胞内特异基因或DNA片段,其灵敏度可达(2～5)×107。在RT-PCR技术的运用过程中，标志基因的选择显得非常重要。以肿瘤特异性表达基因作为靶向，可使肿瘤检测的特异性大大增加。但多数常见实体瘤缺乏特异性基因，故实际多选择组织特异性或肿瘤相关性靶基因进行检测，如PSA mRNA[4]、AFP mRNA[5]、CK mRNA[6]等。CEA mRNA几乎能在所有的上皮细胞包括癌细胞中被检测出，而在非上皮细胞中检测不出。如果在血中检测出CEA mRNA，则意味着异位的存在，由此推断表达CEA的肿瘤细胞有存在的可能[7]。CEA mRNA虽然不是肿瘤特异性抗原，但它已成为CEA分泌性肿瘤的标志基因。
, 百拇医药
选择CEA mRNA作为肿瘤标志物进行检测开始于Gerhard等人对骨髓的研究。他采用巢式RT-PCR技术，在21例腹部肿瘤和乳腺癌患者的骨髓中，发现CEA基因表达阳性者14例，提示骨髓微转移的存在，而56份对照组均为阴性[2]。在此基础上，其他学者又分别从外周血、淋巴结及腹水[8,9,10]等多途径进行CEA mRNA检测，均获得DNA扩增的成功。国内尚未见有关报道。
本文采用敏感的巢式RT-PCR，20例结、直肠癌患者检出CEAmRNA有11例，阳性率为55%,而正常人血中均未检出,提示11例阳性是由脱落到循环中的肿瘤细胞产生,也意味着外周微转移的存在。我们发现，有远处转移组外周血CEAmRNA的阳性率显著高于无远处转移组,说明CEAmRNA阳性率与肿瘤远处转移密切相关。本实验中有远处转移的病例,CEA mRNA均为阳性。这表明肿瘤的早期转移。临床无明显转移征象的15例患者有6例检出CEA mRNA阳性。经3～6个月的随访，该6例患者中有1例出现转移征象。这表明CEAmRNA在肿瘤转移早期诊断方面具有重要的意义。从表2可知，CEA mRNA阳性率与血清CEA是否升高无显著相关性。血清CEA的浓度高低只能提供肿瘤原发灶的信息，而不能反映肿瘤的转移。
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以上研究提示应用巢式RT-PCR在CEA分泌性肿瘤外周血检出CEA mRNA很可能与循环中存在转移的癌细胞有关，它不仅是反映CEA分泌性肿瘤血源性播散的灵敏指标，而且对指导选择治疗方案和判断预后都有重要意义。RT-PCR技术的高度敏感性和特异性，使肿瘤微转移的早期诊断成为可能，为判断病情、指导治疗提供了更可靠的依据。
基金项目：本课题受广东省自然科学基金(编号960667)及广东省卫生厅“五个一”工程重点课题基金资助
通讯作者：王晓怀：Tel：86-20-8662205-53479 E-mal：llxfj@163.ent
参考文献：
[1]Redding WH, Coombes RC,Monaghan P, et al. Detection of micrometastates in patients with primary breast cancer [J]. Lancet,1983， 3： 1271～ 1274.
, 百拇医药
[2]Gerhard M, Juhl H, Kalthoff H, et al. Specific detection of carcinoembryonic antigen expressing tumor cells in bone marrow aspirates by polymerase chain reaction [J]. J Clin Oncol,1994， 12(4)： 725～ 729.
[3]Beauchemin N, Benchimol S, Cournoyer D, et al. Isolation and characterization of full-length functional cDNA clones for human carcinoembryonic antigen [J]. Mol Cell Biol,1987， 7(9)： 3221～ 3230.
[4]Moreno JG, Croce CM,Fischer R,et al.Detection of hematogenous micrometastasis in patients with prostate cancer [J]. Cancer Res,1992,52： 6110～ 6112.
, 百拇医药
[5]Hillaire S, Barbu V,Boucher E,et al.Albumin messeger RNA as a marker of circulating hepatocytes in hepatocellular carcinoma[J]. Gastroenterology, 1994， 106(1)： 239～ 242.
[6]Burchill SA,Bradburg MF, Pittman K,et al.Detection of epithelial cancer cells in peripheral blood by reverse transcriptase-polymerase chain reaction [J]. BR J Cancer 1995， 71(3)： 278～ 281.
[7]Mori M, Mimori K, Ueo H, et al. Molecular detection of circulating solid carcinoma cells in the peripheral blood： The concept of early systemic disease [J]. Int J Cancer,1996， 68： 739～ 743.
, 百拇医药
[8]Jonas S, Windeatt S, O-Boateng A, et al. Identification of carcinoembryonic antigen producing cells circulating in the blood of patients with colorectal carcinoma by reverse transcriptase polymerase chain reaction [J]. Gut,1996， 39： 717～ 721.
[9]Mori M, Mimori K, Inoue H, et al. Detection of cancer micrometastases in lymph nodes by reverse transcriptase-polymerase chain reaction [J]. Cancer Research, 1995， 55： 3417～ 3420.
[10]Nakanishi H, Kodera Y, Torii A, et al. Detection of carcinoembryonic antigen expressing free tumor cells in peritoneal washs from patients with gastric carcinoma by polymerase chain reaction [J]. Jpn J Cancer Res,1997， 88(7)： 687～ 692.
收稿日期：1999-08-06
修稿日期：1999-09-24, 百拇医药