垂体腺瘤侵袭性与p16蛋白表达及Ki－67指数的关系
作者：
单位：刘飞(第四军医大学西京医院神经外科,陕西西安710032)；章翔(第四军医大学西京医院神经外科,陕西西安710032)；曹卫东(第四军医大学西京医院神经外科,陕西西安710032)；刘先珍(第四军医大学西京医院神经外科,陕西西安710032)；易声禹(第四军医大学西京医院神经外科,陕西西安710032)
关键词：垂体腺瘤；蛋白质p16；蛋白质Ki-6；侵袭
癌症000307 刘飞 章翔 曹卫东 刘先珍
摘 要：目的：探讨p16蛋白表达及Ki-67指数(Ki-67LI)与垂体腺瘤增殖与侵袭生物学特性的关系。方法：应用免疫组化染色技术检测57例垂体腺瘤中p16及Ki-67蛋白的表达。结果：垂体腺瘤p16蛋白阳性率为31.6%，侵袭性组p16蛋白阳性率显著低于非侵袭性组(P<0.01)。p16蛋白表达率及Ki67LI均与垂体腺瘤激素分泌功能无明显相关性。结论：检测p16蛋白表达及Ki-67LI对临床评价垂体腺瘤侵袭性有积极意义。
, http://www.100md.com
分类号：R730.264 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)03-0219-03
Correlations between invasion of pituitary adenomas
and expression of p16，Ki-67 index
LIU Fei ZHANG Xiang CAO Wei-dong et al.
(XiJing Hospital , Fourth Military Medical University, Xi'an 710032， P.R. China)
Abstract：Objective： To determine the relationship between the expression of p16 protein,Ki-67 index and proliferation, invasiveness of pituitary adenomas. Methods： The expression of p16 and Ki-67 protein were detected immunohistochemically in 57 cases of pituitary adenomas. Results： Positive staining of p16 protein was found in 31.6% of all the cases. The percentage of p16-positive adenomas in invasive group was significantly lower than that in noninvasive group (P< 0.01) . Meanwhile, the average Ki-67 index ( Ki- 67 LI) of invasive and noninvasive adenomas were 3.53±1.22 and 1.86± 0.63, respectively, which was significantly different (P< 0.01) . The average Ki-67 LI of p16-positive adenomas was significantly lower than those of p16-negative adenomas ( P< 0.01) . The expression of p16 and Ki-67 LI did not significantly correlate with secretive functions of pituitary adenomas. Conclusions： The detections of p16 protein expression and Ki-67 index are useful for clinical evaluation of invasiveness of pituitary adenomas.
, 百拇医药
Key words：Pituitary adenomas; p16; Ki-67; Invasiveness▲
垂体腺瘤是颅内常见的良性肿瘤，但约有1/3的肿瘤具有侵袭性，可向周围正常组织侵犯，呈一定程度的恶性表现，手术难以达到根治效果，因此术后常有复发。研究表明，肿瘤的增殖失控是影响垂体腺瘤侵袭性的重要因素[1]。p16基因是近年来发现的与细胞周期调控密切相关的抑癌基因。p16基因缺失引起的细胞周期失控是肿瘤细胞过度增殖的主要原因。增殖相关抗原Ki-67是一种广泛存在于增殖细胞中的核抗原。检测Ki-67阳性细胞核比率可以反映群体细胞中增殖细胞所占比例[2]。我们通过免疫组化方法检测了57例垂体腺瘤组织p16蛋白表达率及Ki-67指数，研究两者与垂体腺瘤侵袭性的关系，并分析上述两种指标之间的相关性，探讨垂体腺瘤侵袭性发生的可能机制。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 标本
57例垂体腺瘤选自本院病理科1991年1月～1994年12月存档的手术标本，均经病理确诊。其中男性22例，女性35例，年龄16～68岁。根据分泌特征分为：无内分泌功能腺瘤20例，内分泌功能活跃的腺瘤37例(包括泌乳素细胞腺瘤14例，生长激素细胞腺瘤17例，促肾上腺皮质激素细胞腺瘤及促甲状腺激素细胞腺瘤各3例)。正常垂体组织选自同期同年龄组非垂体腺疾病患者尸检标本。组织标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，片厚4μm。
1.2 肿瘤分型
参照Scheithauer[3]的标准：影像学提示肿瘤侵犯海绵窦或有骨质破坏，和/或术中观察肿瘤对海绵窦有侵犯，将肿瘤分为侵袭性(24例)和非侵袭性(33例)。
1.3 试剂
小鼠抗人p16单抗、小鼠抗人Ki-67单抗均为博士德生物公司产品。
, 百拇医药
1.4 免疫组化方法
采用常规SABC法进行免疫组化染色，微波修复抗原10min，3%正常羊血清于室温下孵育20min，加入一抗(1∶100小鼠抗人p16单抗，或1∶50小鼠抗人Ki-67单抗)4℃过夜，生物素标记的二抗37℃、30min，加入SABC复合物1∶100，37℃、40min，DAB显色，苏木素衬染，中性树胶封片。以PBS代替一抗作空白对照。
1.5 结果判断
p16染色结果判断：以胞浆或核染成均一棕黄色为阳性细胞(见图1)，无明显阳性细胞记为(-)，<10%阳性细胞为(+)，10%～50%阳性细胞为(++)，>50%阳性细胞为(+++)。
图1 p16蛋白垂体腺瘤中的阳性表达SABC法免疫组化染色×400
, http://www.100md.com
Ki-67染色结果判断：以胞核染成均一棕黄色，胞浆及胞膜不着色为阳性细胞(见图2)。随机计数5个以上高倍视野1000个细胞，平均每100个细胞中阳性染色细胞核数为Ki-67指数(Ki-67LI)。
图2 Ki-67蛋白垂体腺瘤中的阳性表达SABC法免疫组化染色×400
1.6 统计学处理
采用χ2检验或t检验进行数据分析。
2 结果
p16阳性染色主要弥漫性分布于细胞浆中，细胞核几乎不着色。Ki-67阳性反应均定位于细胞核中，在较小瘤细胞和瘤细胞密集区域Ki-67阳性反应增强。7例正常垂体组织p16蛋白表达均为阳性，其中3例显示较强染色。57例垂体腺瘤p16蛋白表达率为31.6%，侵袭性和非侵袭性腺瘤p16蛋白阳性率分别为16.7%和42.4%，经χ2检验，两者有显著性差异(P<0.01).所选病例平均Ki-67LI为2.56±0.83，其中侵袭性组为3.53±1.22，显著高于非侵袭性组(P<0.01).18例p16蛋白阴性垂体腺瘤平均Ki-67LI显著低于p16蛋白阴性组(P<0.01，表1).不同分泌功能腺瘤组间p16蛋白表达率及Ki-67LI无显著性差异(表2).
, 百拇医药
表1 不同类型垂体腺瘤p16蛋白表达率及Ki-67LI 组别
n
p16蛋白
p16阳性率
%(n/n)
Ki-67LI
(
±s,%)
-
+
～
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正常垂体组织
7
0
4
3
100.0(7/7)
0.03±0.01
分泌功能腺瘤
37
25
8
4
32.4(12/37)
, 百拇医药
2.64±0.96
无分泌功能腺瘤
20
14
4
2
30.0(6/20)
2.42±0.85
侵袭性腺癌
24
19
4
0
, http://www.100md.com
16.7*(4/24)
3.53±1.22*
非侵袭性腺癌
33
20
9
5
42.4(14/33)
1.86±0.63
与非侵袭性腺瘤比,*p<0.01，＃p<0.01表2 垂体腺瘤p16蛋白表达与Ki-67LI的关系 组别
n
, 百拇医药
P值
p16阳性
18
1.81±0.58*
<0.01
p16阴性
39
2.91±0.94
3 讨论
p16是与肿瘤细胞增殖周期调控密切相关的抑癌基因，其编码产物p16蛋白是周期素依赖性激酶(CDKs)的抑制剂，可阻止细胞周期由G1期进入S期，对细胞增殖起负调控作用。p16基因缺失和突变存在于多种肿瘤组织中。Woloschak等[4,5]报道p16基因表达缺失在垂体腺瘤中有较高的发生率，可能是垂体腺瘤发生过程中的早期事件，甲基化是该基因失活的主要方式。本实验结果显示，垂体腺瘤中p16蛋白阳性率为31.6%，提示p16基因表达异常在垂体腺瘤中发生率较高。p16蛋白阳性率在侵袭性和非侵袭性腺瘤组间有显著性差异，p16基因表达缺失与垂体腺瘤侵袭性呈显著相关性，p16基因缺失是垂体腺瘤侵袭性发生过程中的重要事件。
, http://www.100md.com
Ki-67是一种增殖相关核抗原，检测其表达能特异性识别增殖的肿瘤或正常细胞。反映细胞增殖活性的Ki-67指数(Ki-67LI)可作为判断肿瘤生长速度的指标[2]。研究发现，传统的反映肿瘤侵袭能力的形态学标志(如核多形性、细胞不典型性和有丝分裂活跃等)，与垂体腺瘤增殖和侵袭性相关性较低。而肿瘤生长速度则被认为是反映垂体腺瘤侵袭性的客观指标[1]。我们应用Ki-67单克隆抗体检测所选病例平均Ki-67LI.为2.56±0.83%，侵袭性垂体腺瘤组平均Ki-67LI显著高于非侵袭性组(P<0.01)。结果提示，增殖活性的高低对评价垂体腺瘤的侵袭性有积极意义。Thapar等[1]发现非侵袭性腺瘤、侵袭性腺瘤和垂体腺癌之间Ki-67LI有显著性差异，他提出以3%作为区分非侵袭性和侵袭性腺瘤的Ki-67LI阈值。本组不同分泌功能组间Ki-67LI无显著性差异，说明具有分泌功能与否与肿瘤增殖能力无明显关系。
本研究中，p16蛋白阳性腺瘤组的平均Ki-67LI显著低于p16蛋白阴性组(P<0.01)，p16基因表达缺失的垂体腺瘤中存在更多具有增殖活力的细胞。Ono等[6]发现，伴有p16/CDKN2基因缺失的恶性星形细胞瘤，其Ki-67LI显著增高。p16基因缺失与肿瘤细胞高增殖有良好相关性。垂体腺瘤侵袭性的发生伴随着多种生物因子的改变，p16蛋白表达及Ki-67LI可作为临床评价垂体腺瘤侵袭性的有用指标。
, 百拇医药
基金项目：本课题受全军“九五”科研基金项目(No.96-M-141)资助
通讯作者：刘飞:Tel：86-29-3375330 E-mail:liufei263@263.net
参考文献:
[1]Thapar K, Kovacs K, Scheithauer BW, et al. Proliferative activity and invasiveness among pituitary adenomas and carcinomas： an analysis using the MIB-1 antibody [J]. Neuro-surgery , 1996,38(1)： 99～ 107.
[2]Gerdes J, Lemke H, Baisch H, et al. Cell cycle analysis of a cell proliferation associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki-67 [J]. J Immunol, 1984,133(4)： 1710～ 1715.
, 百拇医药
[3]Scheithauer BW, Kovacs KT, Laws ER Jr, et al. Pathology of invasive pituitary tumors with special reference to functional classification [J]. J Neurosurg , 1986,65(6)： 733～ 744.
[4]Woloschak M, Yu A, Post KD. Frequent inactivation of the p16 gene in human pituitary tumors by gene methylation [J]. Mol Carcinog, 1997, 19(4)： 221～ 224.
[5]Farrell WE, Simpson DJ, Bicknell JE, et al. Chromosome 9p deletions in invasive and noninvasive nonfunctional pituitary adenomas： the deleted region involves markers outside of the MTS1 and MTS2 genes [J]. Cancer Res， 1997, 57(13)： 2703～ 2709.
[6]Ono Y, Tamiya T, Ichikawa T, et al. Malignant astrocytomas with homozygous CDKN2/p16 gene deletions have higher Ki-67 proliferation indices [J]. J Neuropathol Exp Neurol, 1996, 55(10)： 1026～ 1031.
收稿日期：1999-09-17
修稿日期：1999-10-19, 百拇医药
单位：刘飞(第四军医大学西京医院神经外科,陕西西安710032)；章翔(第四军医大学西京医院神经外科,陕西西安710032)；曹卫东(第四军医大学西京医院神经外科,陕西西安710032)；刘先珍(第四军医大学西京医院神经外科,陕西西安710032)；易声禹(第四军医大学西京医院神经外科,陕西西安710032)
关键词：垂体腺瘤；蛋白质p16；蛋白质Ki-6；侵袭
癌症000307 刘飞 章翔 曹卫东 刘先珍
摘 要：目的：探讨p16蛋白表达及Ki-67指数(Ki-67LI)与垂体腺瘤增殖与侵袭生物学特性的关系。方法：应用免疫组化染色技术检测57例垂体腺瘤中p16及Ki-67蛋白的表达。结果：垂体腺瘤p16蛋白阳性率为31.6%，侵袭性组p16蛋白阳性率显著低于非侵袭性组(P<0.01)。p16蛋白表达率及Ki67LI均与垂体腺瘤激素分泌功能无明显相关性。结论：检测p16蛋白表达及Ki-67LI对临床评价垂体腺瘤侵袭性有积极意义。
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分类号：R730.264 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)03-0219-03
Correlations between invasion of pituitary adenomas
and expression of p16，Ki-67 index
LIU Fei ZHANG Xiang CAO Wei-dong et al.
(XiJing Hospital , Fourth Military Medical University, Xi'an 710032， P.R. China)
Abstract：Objective： To determine the relationship between the expression of p16 protein,Ki-67 index and proliferation, invasiveness of pituitary adenomas. Methods： The expression of p16 and Ki-67 protein were detected immunohistochemically in 57 cases of pituitary adenomas. Results： Positive staining of p16 protein was found in 31.6% of all the cases. The percentage of p16-positive adenomas in invasive group was significantly lower than that in noninvasive group (P< 0.01) . Meanwhile, the average Ki-67 index ( Ki- 67 LI) of invasive and noninvasive adenomas were 3.53±1.22 and 1.86± 0.63, respectively, which was significantly different (P< 0.01) . The average Ki-67 LI of p16-positive adenomas was significantly lower than those of p16-negative adenomas ( P< 0.01) . The expression of p16 and Ki-67 LI did not significantly correlate with secretive functions of pituitary adenomas. Conclusions： The detections of p16 protein expression and Ki-67 index are useful for clinical evaluation of invasiveness of pituitary adenomas.
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Key words：Pituitary adenomas; p16; Ki-67; Invasiveness▲
垂体腺瘤是颅内常见的良性肿瘤，但约有1/3的肿瘤具有侵袭性，可向周围正常组织侵犯，呈一定程度的恶性表现，手术难以达到根治效果，因此术后常有复发。研究表明，肿瘤的增殖失控是影响垂体腺瘤侵袭性的重要因素[1]。p16基因是近年来发现的与细胞周期调控密切相关的抑癌基因。p16基因缺失引起的细胞周期失控是肿瘤细胞过度增殖的主要原因。增殖相关抗原Ki-67是一种广泛存在于增殖细胞中的核抗原。检测Ki-67阳性细胞核比率可以反映群体细胞中增殖细胞所占比例[2]。我们通过免疫组化方法检测了57例垂体腺瘤组织p16蛋白表达率及Ki-67指数，研究两者与垂体腺瘤侵袭性的关系，并分析上述两种指标之间的相关性，探讨垂体腺瘤侵袭性发生的可能机制。
1 材料和方法
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1.1 标本
57例垂体腺瘤选自本院病理科1991年1月～1994年12月存档的手术标本，均经病理确诊。其中男性22例，女性35例，年龄16～68岁。根据分泌特征分为：无内分泌功能腺瘤20例，内分泌功能活跃的腺瘤37例(包括泌乳素细胞腺瘤14例，生长激素细胞腺瘤17例，促肾上腺皮质激素细胞腺瘤及促甲状腺激素细胞腺瘤各3例)。正常垂体组织选自同期同年龄组非垂体腺疾病患者尸检标本。组织标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，片厚4μm。
1.2 肿瘤分型
参照Scheithauer[3]的标准：影像学提示肿瘤侵犯海绵窦或有骨质破坏，和/或术中观察肿瘤对海绵窦有侵犯，将肿瘤分为侵袭性(24例)和非侵袭性(33例)。
1.3 试剂
小鼠抗人p16单抗、小鼠抗人Ki-67单抗均为博士德生物公司产品。
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1.4 免疫组化方法
采用常规SABC法进行免疫组化染色，微波修复抗原10min，3%正常羊血清于室温下孵育20min，加入一抗(1∶100小鼠抗人p16单抗，或1∶50小鼠抗人Ki-67单抗)4℃过夜，生物素标记的二抗37℃、30min，加入SABC复合物1∶100，37℃、40min，DAB显色，苏木素衬染，中性树胶封片。以PBS代替一抗作空白对照。
1.5 结果判断
p16染色结果判断：以胞浆或核染成均一棕黄色为阳性细胞(见图1)，无明显阳性细胞记为(-)，<10%阳性细胞为(+)，10%～50%阳性细胞为(++)，>50%阳性细胞为(+++)。
图1 p16蛋白垂体腺瘤中的阳性表达SABC法免疫组化染色×400
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Ki-67染色结果判断：以胞核染成均一棕黄色，胞浆及胞膜不着色为阳性细胞(见图2)。随机计数5个以上高倍视野1000个细胞，平均每100个细胞中阳性染色细胞核数为Ki-67指数(Ki-67LI)。
图2 Ki-67蛋白垂体腺瘤中的阳性表达SABC法免疫组化染色×400
1.6 统计学处理
采用χ2检验或t检验进行数据分析。
2 结果
p16阳性染色主要弥漫性分布于细胞浆中，细胞核几乎不着色。Ki-67阳性反应均定位于细胞核中，在较小瘤细胞和瘤细胞密集区域Ki-67阳性反应增强。7例正常垂体组织p16蛋白表达均为阳性，其中3例显示较强染色。57例垂体腺瘤p16蛋白表达率为31.6%，侵袭性和非侵袭性腺瘤p16蛋白阳性率分别为16.7%和42.4%，经χ2检验，两者有显著性差异(P<0.01).所选病例平均Ki-67LI为2.56±0.83，其中侵袭性组为3.53±1.22，显著高于非侵袭性组(P<0.01).18例p16蛋白阴性垂体腺瘤平均Ki-67LI显著低于p16蛋白阴性组(P<0.01，表1).不同分泌功能腺瘤组间p16蛋白表达率及Ki-67LI无显著性差异(表2).
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表1 不同类型垂体腺瘤p16蛋白表达率及Ki-67LI 组别
n
p16蛋白
p16阳性率
%(n/n)
Ki-67LI
(
±s,%)-
+
～, http://www.100md.com
正常垂体组织
7
0
4
3
100.0(7/7)
0.03±0.01
分泌功能腺瘤
37
25
8
4
32.4(12/37)
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2.64±0.96
无分泌功能腺瘤
20
14
4
2
30.0(6/20)
2.42±0.85
侵袭性腺癌
24
19
4
0
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16.7*(4/24)
3.53±1.22*
非侵袭性腺癌
33
20
9
5
42.4(14/33)
1.86±0.63
与非侵袭性腺瘤比,*p<0.01，＃p<0.01表2 垂体腺瘤p16蛋白表达与Ki-67LI的关系 组别
n
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P值
p16阳性
18
1.81±0.58*
<0.01
p16阴性
39
2.91±0.94
3 讨论
p16是与肿瘤细胞增殖周期调控密切相关的抑癌基因，其编码产物p16蛋白是周期素依赖性激酶(CDKs)的抑制剂，可阻止细胞周期由G1期进入S期，对细胞增殖起负调控作用。p16基因缺失和突变存在于多种肿瘤组织中。Woloschak等[4,5]报道p16基因表达缺失在垂体腺瘤中有较高的发生率，可能是垂体腺瘤发生过程中的早期事件，甲基化是该基因失活的主要方式。本实验结果显示，垂体腺瘤中p16蛋白阳性率为31.6%，提示p16基因表达异常在垂体腺瘤中发生率较高。p16蛋白阳性率在侵袭性和非侵袭性腺瘤组间有显著性差异，p16基因表达缺失与垂体腺瘤侵袭性呈显著相关性，p16基因缺失是垂体腺瘤侵袭性发生过程中的重要事件。
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Ki-67是一种增殖相关核抗原，检测其表达能特异性识别增殖的肿瘤或正常细胞。反映细胞增殖活性的Ki-67指数(Ki-67LI)可作为判断肿瘤生长速度的指标[2]。研究发现，传统的反映肿瘤侵袭能力的形态学标志(如核多形性、细胞不典型性和有丝分裂活跃等)，与垂体腺瘤增殖和侵袭性相关性较低。而肿瘤生长速度则被认为是反映垂体腺瘤侵袭性的客观指标[1]。我们应用Ki-67单克隆抗体检测所选病例平均Ki-67LI.为2.56±0.83%，侵袭性垂体腺瘤组平均Ki-67LI显著高于非侵袭性组(P<0.01)。结果提示，增殖活性的高低对评价垂体腺瘤的侵袭性有积极意义。Thapar等[1]发现非侵袭性腺瘤、侵袭性腺瘤和垂体腺癌之间Ki-67LI有显著性差异，他提出以3%作为区分非侵袭性和侵袭性腺瘤的Ki-67LI阈值。本组不同分泌功能组间Ki-67LI无显著性差异，说明具有分泌功能与否与肿瘤增殖能力无明显关系。
本研究中，p16蛋白阳性腺瘤组的平均Ki-67LI显著低于p16蛋白阴性组(P<0.01)，p16基因表达缺失的垂体腺瘤中存在更多具有增殖活力的细胞。Ono等[6]发现，伴有p16/CDKN2基因缺失的恶性星形细胞瘤，其Ki-67LI显著增高。p16基因缺失与肿瘤细胞高增殖有良好相关性。垂体腺瘤侵袭性的发生伴随着多种生物因子的改变，p16蛋白表达及Ki-67LI可作为临床评价垂体腺瘤侵袭性的有用指标。
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基金项目：本课题受全军“九五”科研基金项目(No.96-M-141)资助
通讯作者：刘飞:Tel：86-29-3375330 E-mail:liufei263@263.net
参考文献:
[1]Thapar K, Kovacs K, Scheithauer BW, et al. Proliferative activity and invasiveness among pituitary adenomas and carcinomas： an analysis using the MIB-1 antibody [J]. Neuro-surgery , 1996,38(1)： 99～ 107.
[2]Gerdes J, Lemke H, Baisch H, et al. Cell cycle analysis of a cell proliferation associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki-67 [J]. J Immunol, 1984,133(4)： 1710～ 1715.
, 百拇医药
[3]Scheithauer BW, Kovacs KT, Laws ER Jr, et al. Pathology of invasive pituitary tumors with special reference to functional classification [J]. J Neurosurg , 1986,65(6)： 733～ 744.
[4]Woloschak M, Yu A, Post KD. Frequent inactivation of the p16 gene in human pituitary tumors by gene methylation [J]. Mol Carcinog, 1997, 19(4)： 221～ 224.
[5]Farrell WE, Simpson DJ, Bicknell JE, et al. Chromosome 9p deletions in invasive and noninvasive nonfunctional pituitary adenomas： the deleted region involves markers outside of the MTS1 and MTS2 genes [J]. Cancer Res， 1997, 57(13)： 2703～ 2709.
[6]Ono Y, Tamiya T, Ichikawa T, et al. Malignant astrocytomas with homozygous CDKN2/p16 gene deletions have higher Ki-67 proliferation indices [J]. J Neuropathol Exp Neurol, 1996, 55(10)： 1026～ 1031.
收稿日期：1999-09-17
修稿日期：1999-10-19, 百拇医药
参见：首页 > 医疗版 > 疾病专题 > 内分泌科 > 下丘脑-垂体疾病 > 垂体腺瘤