Glob－N对胶质瘤细胞株SWO－38生长的体外实验研究
作者：张健 张宗城 张积仁 汪森明
单位：张健(第一军医大学附属珠江医院肿瘤中心，广东广州510282)；张宗城(第一军医大学附属珠江医院肿瘤中心，广东广州510282)；张积仁(第一军医大学附属珠江医院肿瘤中心，广东广州510282)；汪森明(第一军医大学附属珠江医院肿瘤中心，广东广州510282)
关键词：胶质瘤；中性鞘糖脂；抗癌作用；细胞
癌症000305
摘 要：目的：为了探讨正常及肿瘤相关中性鞘糖脂(N-GSLs)对肿瘤细胞生长的调控作用。方法：采用改良的Hakomori方法提取、纯化正常人脑、牛脑、正常人“O"型血红细胞膜的N-GSLs，运用柱层析的方法分离正常人脑、牛脑、红细胞膜的红细胞糖苷脂(Glob-N)及人脑二己糖神经鞘氨醇(CDH)，MTT法检测各种来源的Glob-N及人脑CDH对胶质瘤细胞株SWO-38生长的影响。结果：三种不同来源的Glob-N均能抑制SWO-38细胞的增殖。其中以正常人脑的作用最强，红细胞来源的作用次之，牛脑来源的最弱，而人脑CDH则缺乏抑制作用。结论：Glob-N是一种胶质瘤细胞的生长抑制因子，其抑制作用与其结构相关。
, http://www.100md.com
分类号：R7336 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)03-0212-04
In vitro study of Glob-N on the growth of glioma cell line SWO-38
ZHANG Jian ZHANG Zong-cheng ZHANG Ji-ren et al.
(Oncology Centre, Zhujiang Hospital, First Military
Medical University, Guangzhou 510282, P.R.China.)
Abstract：Objective： To investigate the effect of Glob-N on the growth of glioma cell line SWO-38 in vitro. Methods： Neutral glycosphingolipids(N-GSLs) were extracted and purified separately from normal human brain, membrane of human red blood cell type “ O” and cow brain according to the modified Hakamori method. Glob-N and CDH were further separated by using column chromatography for gradient elution with methanol/chloroform solution. Cytotoxicity effect of Glob-N and CDH on SWO-38 cells was determined by MTT assay in vitro. Results： All the Glob-N of three different sources showed cytotoxicity to SWO-38 cell line with IC50 (24 hours incubation) of 122.4, 182.9 and 481.6 μ g/ml, respectively, while CDH appeared no inhibitory effect. Conclusion： Glob-N exhibites inhibitory effect on glioma cells in vitro, that may relate to its stucture.
, 百拇医药
Key words：Glioma; Neutral glycosphingolipids; Antitumor effect; Cell▲
脑胶质瘤是脑部最常见的原发性肿瘤，其特性是不论其组织学恶性程度如何，它都浸润其周围的正常脑组织，这是治疗的最大障碍。对胶质瘤发生发展机理及其治疗的研究已成为神经外科学、肿瘤学、药理学研究领域的热点。我们在对人脑胶质瘤中性鞘糖脂(Neutral glycosphingolipids,N-GSLs)的研究中已发现正常人脑组织以红细胞糖苷脂(Globoside,Glob-N)表达为主，而二己糖神经鞘氨醇(CDHdihexosylceramide)在胶质瘤组织中表达较强[1]。为了了解正常及肿瘤相关鞘糖脂对肿瘤细胞的生长调控作用，本实验观察了各种来源的Glob-N对胶质瘤细胞株SWO-38生长的影响。
1 材料与方法
1.1 细胞株
, 百拇医药
SWO-38，人脑星形胶质瘤细胞株[2],购自暨南大学医学院病理教研室,本室传代培养。
1.2 脑组织
正常人脑组织(脑灰质)取自因意外事故非疾病死亡之尸体,取标本时间距死亡<1h.牛脑组织(脑灰质)取自广州畜牧场，正常人“0”型血红细胞取自健康献血者，脑胶质瘤组织手术切除标本，经病理证实为星型胶质细胞瘤Ⅲ级.
1.3 牛脑、正常人脑、红细胞膜Glob-N及人脑CDH的制备
按改良的Hakomori的方法[1]提取、纯化以上各组织N-GSLs。采用柱层析的方法从以上各组织N-GSLs中分离Glob-N及人脑CDH。
1.4 Glob-N、CDH液的准备
, 百拇医药
将一定量的GlobN、CDH加入到少量含2%胎牛血清的RPMI1640培养液中，超声乳化，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，定容后4℃下保存备用。
1.5 Glob-N对SWO38细胞增殖的影响(MTT法[3])
1.5.1 SWO-38细胞培养：用含2%胎牛血清的RPMI1640培养液(pH7.4)，37℃、5%CO2培养箱培养，72小时传代一次。取对数期生长的SWO-38细胞，用0.25%的胰酶消化，0.01mol/LpH7.2的PBS洗两次，以含2%胎牛血清的RPMI1640培养液将细胞稀释成2×104/ml，按每孔180μl接种于96孔培养板，5%CO2、37℃培养24小时；5、12.5、25、50、100μg/ml，设4个复孔。对照加含2%胎牛血清的培养液20μl，继续培养48小时；每孔去除培养液100μl，加入MTT(5mg/ml)各10μl，继续培养4小时。每孔加入MTT裂解液100μl，37℃过夜；酶联免疫检测仪570nm下测定各孔OD值。
, 百拇医药
1.5.2 按以下公式计算实验组各孔抑制率
1.6 各种Glob-N的IC50值
以抑制率对药物浓度的对数作图，从图上求得各种Glob-N的IC50值。
1.7 Glob-N对SWO-38生长曲线的影响
按文献[4]进行，具体方法如下：
1.7.1 制作标准曲线：准备细胞悬液，从2×106细胞/200μl/孔开始在96孔板中倍比稀释至1×102细胞/孔，每个浓度设4个复孔，培养板置37℃培养4小时后细胞贴壁，每孔中加入MTT(5mg/ml)各10μl，继续培养4小时，然后吸出150μl培养液，加入等量DMSO，37℃20分钟，570nm处测定OD值。以OD值为纵坐标，细胞浓度的对数为横坐标，绘出细胞标准浓度曲线。
, 百拇医药
1.7.2 制作生长曲线：调整细胞浓度为2.5×104/ml，按200μl/孔接种在96孔板中，每孔加入1mg/ml各种Glob20μl，对照加同等浓度人脑CDH，并设置不加任何处理因素的空白对照。置37℃培养，每天用MTT比色法测定3个复孔细胞的OD值，在标准曲线上计算出相应的细胞数，绘制细胞生长曲线。
1.8 统计学处理
各组OD值与对照进行方差分析(one-way ANOVA)两两比较；抑制率对药物浓度的对数作直线相关拟合(curve estimation regression)，根据得到的方程求不同来源Glob-N的IC50值。
2 结果
2.1 不同组织来源的Glob及人脑CDH的纯化和高效薄层层析(high performance thin layer chromatography,HPTLC)结果
, 百拇医药
三种组织来源的中性鞘糖脂均由单己糖神经鞘氨醇(monohexosylceramide,CMH)、CDH、三己糖神经鞘氨醇(trihexosylceramide CTH)、Glob-N组成，采用柱层析分离纯化其中的Glob-N和人脑N-GSLs的CDH，展开后呈单一清晰条带，均达到了层析纯(见图1～2)。
图1 图2
图1 人脑GIobN及CHD的纯化和HPTLC图谱
1.人脑N-GSLs;2.人脑CDH；3.人脑Glob-N
图2 不同组织来源的Glob-N的纯化和HPTLC图谱
, 百拇医药
1.正常人“O”型血红细胞膜的N-GSLs；
2.正常人“O”型血红细胞膜Glob-N；
3.牛脑N-GSLs；4.牛脑Glob-N
2.2 不同来源Glob-N对脑胶质瘤细胞株SWO-38生长有抑制作用
不同来源Glob-N对SWO-38生长的抑制作用见表1，其中人脑Glob-N的作用最强，红细胞Glob-N作用次之，牛脑Glob-N最弱，而人脑CDH对SWO-38的生长没有影响。在6.25～100μg/ml之间，Glob-N的抑制作用呈浓度依赖性，所以选择其最适浓度为100μg/ml(图3)。
表1 Glob-N对SWO-38细胞增殖的影响(
±s) 剂量(μg/ml)
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吸光值
人脑Glob
红细胞Glob
牛脑Glob
人脑CDH
对照
6025
0.630±0.029
0.627±0.034
0.688±0.048
0.570±0.084*
0.693±0.054
, 百拇医药
1205
0.548±0.061*
0.568±0.022*
0.655±0.040
0.535±0.017*
25
0.575±0.013*
0.546±0.019*
0.628±0.025
0.628±0.041
, 百拇医药 50
0.418±0.127*
0.503±0.017*
0.503±0.082*
0.568±0.035*
100
0.360±0.102*
0.357±0.017*
0.478±0.017*
0.570±0.034*
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*P<0.05vs对照组
图3 Glob-N 对SWO-38细胞生长的量效曲线
2.3 各种来源的Glob-N对SWO-38细胞的半数抑制浓度(IC50值)
以lgc为横坐标，抑制率为纵坐标，从图4求出各种Glob-N的IC50值。正常人脑Glob-N的IC50值为122.4μg/ml；牛脑Glob-N的IC50值为481.6μg/ml；正常人O型血红细胞膜Glob-N的IC50值为182.9μg/ml。可见人脑IC50值最小，说明其抑制作用最强。而人脑CDH无抑制作用(经统计学分析直线回归系数R2=0.025，无线性相关)(见图4)
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图4 各种来源的Glob-N对SWO-38细胞的半抑制浓度
1.牛脑Glob-N；2.“O”型血红细胞膜Glob-N；
3.正常人脑Glob-N
2.4 各种来源的Glob-N对SWO-38细胞生长曲线的影响
2.4.1 SWO细胞的标准曲线：SWO细胞浓度的标准曲线呈“S"形，即浓度过高或过低时，其吸光值差别均不大，而细胞浓度在2×103～2×105时，吸光值差别较为显著。因此，我们将96孔板接种细胞的数量定为5×103个/孔(图5)。
图5 SWO-38细胞的标准生长曲线
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2.4.2 各种Glob作用后SWO细胞的生长曲线：不同来源Glob-N均影响SWO-38生长曲线(图6)。其中人脑来源的Glob作用最强，红细胞的次之，牛脑来源的最弱。
图6 各种来源的Glob-N 100μg/ml对胶质瘤
细胞株SWO-38生长曲线的影响
3 讨论
目前国内外对肿瘤相关鞘糖脂的研究主要集中在含唾液酸的鞘糖脂即神经节苷脂方面[5～7]，探讨鞘糖脂与肿瘤发生、发展的关系，而对中性鞘糖脂结构与功能关系的研究较少，尚未见中性鞘糖脂作用于肿瘤细胞的报道。
我们既往的研究已发现正常人脑组织以Glob-N表达为主,而CDH、CTH在胶质瘤组织中表达较强,这在胶质瘤恶性增殖中有何意义呢?本实验研究了人脑Glob-N、红细胞膜Glob-N、牛脑Glob-N对胶质瘤细胞SWO-38生长的影响，选择人脑CDH作为实验对照。
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本实验初步发现三种不同来源的Glob均能抑制胶质瘤细胞SWO-38的增殖。其中以正常人脑的作用最强，红细胞来源的作用次之，牛脑来源的最弱，而人脑CDH则缺乏抑制作用。说明尽管来源不同，但可能因为三种Glob结构上的共同点，使得它们具有一些共同的活性。而糖基数量较少的CDH不具有上述活性。
我们对三种不同来源的Glob-N的核磁共振、飞行时间质谱结构鉴定已表明人脑Glob中的神经酰胺(ceramide,Cer)部分含有的碳原子数量最多，红细胞膜的次之,牛脑Glob中含有的碳原子数量最少。三种Glob-N对胶质瘤细胞增殖的抑制活性也以人脑Glob最强；而牛脑Glob抑制活性最弱。说明Cer的结构与生物活性有一定的关联。Ladisch[8]于1994年曾报道GD2的免疫抑制活性受Cer的影响，短脂酰链GD2活性远远高于长脂酰链者，而单纯Cer却不具有上述生物活性。故认为神经节苷脂免疫抑制活性需要完整分子的参与，Cer决定活性的强弱。我们初步的实验结果与此类似，三种来源的Glob均能抑制胶质瘤细胞增殖，但活性有所不同，并与Cer中含有的碳原子数量存在联系，其中的详细机理还有待进一步实验证实。
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Glob-N抑制SWO-38细胞增殖的机理推测与下列因素有关：(1)通过与胶质瘤细胞表面鞘糖脂相互作用，影响细胞增殖信号传递。如Otsuji[9]研究发现，外源性GM3、Gg3Cer脂质体能抑制B16黑色素瘤的转移，原因是通过抑制GM3-Gg3Cer或GM3-LacCer相互作用，抑制肿瘤细胞粘附于内皮细胞。(2)抑制胶质瘤细胞表面信号蛋白，影响增殖。由于鞘糖脂在细胞膜上的特殊位置，使其非常容易与跨膜蛋白作用，而外源性鞘糖脂又极易与细胞表面糖萼结合。(3)细胞表面可能存在鞘糖脂受体，这样外源性鞘糖脂就可以和受体结合，影响细胞增殖。已有研究[10]认为Glob-N可作为膜受体，起着信号传递作用。Glob-N作用于胶质瘤的分子机理还有待继续深入研究。
Glob-N抑制胶质瘤细胞增殖生长的意义在于：脑胶质瘤具有浸润特性和术后易复发的特点，病人预后欠佳，近20余年的研究尚未取得突破性进展，寻找和发现新的脑胶质瘤生长抑制因子是近年来国内外研究的热点。对Glob-N的深入研究不仅有可能发现一种新的脑胶质瘤生长抑制因子，为胶质瘤细胞恶性增殖机理的研究探索一个新的方向，还为中性鞘糖脂的研究拓宽了领域。
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基金项目：本课题由国家自然科学基金(No.39700143)资助
通讯作者：张健:Tel：86-20-85143484 Fax：86-20-85143487 E-mail：gzzhjr@public.guangzhou.gd.cn
参考文献：
[1]张世忠，张健，张积仁.脑胶质瘤中性鞘糖脂抗原的初步研究[J].中华神经外科杂志，1998,14(1)：34～36.
[2]司徒锐，王惠华，王锦环，等.人脑恶性胶质瘤体外细胞系SWO38的建立和生物学特性[J].癌症，1987，6(4)：235～237.
[3]李杰，刘玉琴.MTT法在肿瘤研究中的改良及应用进展[J].中国肿瘤临床，1998，25(4)：312～313.
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[4]郝新保，张利朝，殷缨，等.MTT比色法测定细胞生长曲线[J].第四军医大学学报，1997，18(4)：190～191.
[5]Hakomori S, Igarashi Y. Functional role of glycosphingolipids in cell recognition and signaling [J]. J Biochem, 1995, 118： 1091～ 1103.
[6]Hakomori S. Cancer associated glycosphingolipid antigens： their structure, organization, and function [J]. Acta Anat (Basel), 1998, 161： 79～ 90.
[7]Ladisch S, Becker H, Ulsh L, et al. Immunosuppression by human gangliosides： Ⅰ. Relationship of carbohydrate structure to the inhibition of T cell responses [J]. Biochim Biophys Acta, 1992, 1125(2)： 180～ 188.
, 百拇医药
[8]Ladisch S, Li R, Olson E, et al. Ceramide structure predicts tumor ganglioside immunosuppressive activity [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91： 1974～ 1978.
[9]Otsuji E, Park Y S, Tashiro K, et al. Inhibition of B16 melanoma metastasis by administration of GM3 or Gg3 liposomes： blocking adhesion of melanoma cells to endothelial cells(anti adhesion therapy) via inhibition of GM3-Gg3Cer or GM3 LacCer interaction [J]. Int J Oncol,1995,6： 319～ 327.
[10]Jones DH, Lingwood CA, Barber KR, et al. Globoside as a membrane receptor： a consideration of oligosaccharide communication with the hydrophobic domain [J]. Biochemistry, 1997, 36(28)： 8539～ 8547.
收稿日期：1999-10-06
修稿日期：1999-10-28, 百拇医药
单位：张健(第一军医大学附属珠江医院肿瘤中心，广东广州510282)；张宗城(第一军医大学附属珠江医院肿瘤中心，广东广州510282)；张积仁(第一军医大学附属珠江医院肿瘤中心，广东广州510282)；汪森明(第一军医大学附属珠江医院肿瘤中心，广东广州510282)
关键词：胶质瘤；中性鞘糖脂；抗癌作用；细胞
癌症000305
摘 要：目的：为了探讨正常及肿瘤相关中性鞘糖脂(N-GSLs)对肿瘤细胞生长的调控作用。方法：采用改良的Hakomori方法提取、纯化正常人脑、牛脑、正常人“O"型血红细胞膜的N-GSLs，运用柱层析的方法分离正常人脑、牛脑、红细胞膜的红细胞糖苷脂(Glob-N)及人脑二己糖神经鞘氨醇(CDH)，MTT法检测各种来源的Glob-N及人脑CDH对胶质瘤细胞株SWO-38生长的影响。结果：三种不同来源的Glob-N均能抑制SWO-38细胞的增殖。其中以正常人脑的作用最强，红细胞来源的作用次之，牛脑来源的最弱，而人脑CDH则缺乏抑制作用。结论：Glob-N是一种胶质瘤细胞的生长抑制因子，其抑制作用与其结构相关。
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分类号：R7336 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)03-0212-04
In vitro study of Glob-N on the growth of glioma cell line SWO-38
ZHANG Jian ZHANG Zong-cheng ZHANG Ji-ren et al.
(Oncology Centre, Zhujiang Hospital, First Military
Medical University, Guangzhou 510282, P.R.China.)
Abstract：Objective： To investigate the effect of Glob-N on the growth of glioma cell line SWO-38 in vitro. Methods： Neutral glycosphingolipids(N-GSLs) were extracted and purified separately from normal human brain, membrane of human red blood cell type “ O” and cow brain according to the modified Hakamori method. Glob-N and CDH were further separated by using column chromatography for gradient elution with methanol/chloroform solution. Cytotoxicity effect of Glob-N and CDH on SWO-38 cells was determined by MTT assay in vitro. Results： All the Glob-N of three different sources showed cytotoxicity to SWO-38 cell line with IC50 (24 hours incubation) of 122.4, 182.9 and 481.6 μ g/ml, respectively, while CDH appeared no inhibitory effect. Conclusion： Glob-N exhibites inhibitory effect on glioma cells in vitro, that may relate to its stucture.
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Key words：Glioma; Neutral glycosphingolipids; Antitumor effect; Cell▲
脑胶质瘤是脑部最常见的原发性肿瘤，其特性是不论其组织学恶性程度如何，它都浸润其周围的正常脑组织，这是治疗的最大障碍。对胶质瘤发生发展机理及其治疗的研究已成为神经外科学、肿瘤学、药理学研究领域的热点。我们在对人脑胶质瘤中性鞘糖脂(Neutral glycosphingolipids,N-GSLs)的研究中已发现正常人脑组织以红细胞糖苷脂(Globoside,Glob-N)表达为主，而二己糖神经鞘氨醇(CDHdihexosylceramide)在胶质瘤组织中表达较强[1]。为了了解正常及肿瘤相关鞘糖脂对肿瘤细胞的生长调控作用，本实验观察了各种来源的Glob-N对胶质瘤细胞株SWO-38生长的影响。
1 材料与方法
1.1 细胞株
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SWO-38，人脑星形胶质瘤细胞株[2],购自暨南大学医学院病理教研室,本室传代培养。
1.2 脑组织
正常人脑组织(脑灰质)取自因意外事故非疾病死亡之尸体,取标本时间距死亡<1h.牛脑组织(脑灰质)取自广州畜牧场，正常人“0”型血红细胞取自健康献血者，脑胶质瘤组织手术切除标本，经病理证实为星型胶质细胞瘤Ⅲ级.
1.3 牛脑、正常人脑、红细胞膜Glob-N及人脑CDH的制备
按改良的Hakomori的方法[1]提取、纯化以上各组织N-GSLs。采用柱层析的方法从以上各组织N-GSLs中分离Glob-N及人脑CDH。
1.4 Glob-N、CDH液的准备
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将一定量的GlobN、CDH加入到少量含2%胎牛血清的RPMI1640培养液中，超声乳化，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，定容后4℃下保存备用。
1.5 Glob-N对SWO38细胞增殖的影响(MTT法[3])
1.5.1 SWO-38细胞培养：用含2%胎牛血清的RPMI1640培养液(pH7.4)，37℃、5%CO2培养箱培养，72小时传代一次。取对数期生长的SWO-38细胞，用0.25%的胰酶消化，0.01mol/LpH7.2的PBS洗两次，以含2%胎牛血清的RPMI1640培养液将细胞稀释成2×104/ml，按每孔180μl接种于96孔培养板，5%CO2、37℃培养24小时；5、12.5、25、50、100μg/ml，设4个复孔。对照加含2%胎牛血清的培养液20μl，继续培养48小时；每孔去除培养液100μl，加入MTT(5mg/ml)各10μl，继续培养4小时。每孔加入MTT裂解液100μl，37℃过夜；酶联免疫检测仪570nm下测定各孔OD值。
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1.5.2 按以下公式计算实验组各孔抑制率
1.6 各种Glob-N的IC50值
以抑制率对药物浓度的对数作图，从图上求得各种Glob-N的IC50值。
1.7 Glob-N对SWO-38生长曲线的影响
按文献[4]进行，具体方法如下：
1.7.1 制作标准曲线：准备细胞悬液，从2×106细胞/200μl/孔开始在96孔板中倍比稀释至1×102细胞/孔，每个浓度设4个复孔，培养板置37℃培养4小时后细胞贴壁，每孔中加入MTT(5mg/ml)各10μl，继续培养4小时，然后吸出150μl培养液，加入等量DMSO，37℃20分钟，570nm处测定OD值。以OD值为纵坐标，细胞浓度的对数为横坐标，绘出细胞标准浓度曲线。
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1.7.2 制作生长曲线：调整细胞浓度为2.5×104/ml，按200μl/孔接种在96孔板中，每孔加入1mg/ml各种Glob20μl，对照加同等浓度人脑CDH，并设置不加任何处理因素的空白对照。置37℃培养，每天用MTT比色法测定3个复孔细胞的OD值，在标准曲线上计算出相应的细胞数，绘制细胞生长曲线。
1.8 统计学处理
各组OD值与对照进行方差分析(one-way ANOVA)两两比较；抑制率对药物浓度的对数作直线相关拟合(curve estimation regression)，根据得到的方程求不同来源Glob-N的IC50值。
2 结果
2.1 不同组织来源的Glob及人脑CDH的纯化和高效薄层层析(high performance thin layer chromatography,HPTLC)结果
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三种组织来源的中性鞘糖脂均由单己糖神经鞘氨醇(monohexosylceramide,CMH)、CDH、三己糖神经鞘氨醇(trihexosylceramide CTH)、Glob-N组成，采用柱层析分离纯化其中的Glob-N和人脑N-GSLs的CDH，展开后呈单一清晰条带，均达到了层析纯(见图1～2)。
图1 图2
图1 人脑GIobN及CHD的纯化和HPTLC图谱
1.人脑N-GSLs;2.人脑CDH；3.人脑Glob-N
图2 不同组织来源的Glob-N的纯化和HPTLC图谱
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1.正常人“O”型血红细胞膜的N-GSLs；
2.正常人“O”型血红细胞膜Glob-N；
3.牛脑N-GSLs；4.牛脑Glob-N
2.2 不同来源Glob-N对脑胶质瘤细胞株SWO-38生长有抑制作用
不同来源Glob-N对SWO-38生长的抑制作用见表1，其中人脑Glob-N的作用最强，红细胞Glob-N作用次之，牛脑Glob-N最弱，而人脑CDH对SWO-38的生长没有影响。在6.25～100μg/ml之间，Glob-N的抑制作用呈浓度依赖性，所以选择其最适浓度为100μg/ml(图3)。
表1 Glob-N对SWO-38细胞增殖的影响(
±s) 剂量(μg/ml), http://www.100md.com
吸光值
人脑Glob
红细胞Glob
牛脑Glob
人脑CDH
对照
6025
0.630±0.029
0.627±0.034
0.688±0.048
0.570±0.084*
0.693±0.054
, 百拇医药
1205
0.548±0.061*
0.568±0.022*
0.655±0.040
0.535±0.017*
25
0.575±0.013*
0.546±0.019*
0.628±0.025
0.628±0.041
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0.418±0.127*
0.503±0.017*
0.503±0.082*
0.568±0.035*
100
0.360±0.102*
0.357±0.017*
0.478±0.017*
0.570±0.034*
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*P<0.05vs对照组
图3 Glob-N 对SWO-38细胞生长的量效曲线
2.3 各种来源的Glob-N对SWO-38细胞的半数抑制浓度(IC50值)
以lgc为横坐标，抑制率为纵坐标，从图4求出各种Glob-N的IC50值。正常人脑Glob-N的IC50值为122.4μg/ml；牛脑Glob-N的IC50值为481.6μg/ml；正常人O型血红细胞膜Glob-N的IC50值为182.9μg/ml。可见人脑IC50值最小，说明其抑制作用最强。而人脑CDH无抑制作用(经统计学分析直线回归系数R2=0.025，无线性相关)(见图4)
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图4 各种来源的Glob-N对SWO-38细胞的半抑制浓度
1.牛脑Glob-N；2.“O”型血红细胞膜Glob-N；
3.正常人脑Glob-N
2.4 各种来源的Glob-N对SWO-38细胞生长曲线的影响
2.4.1 SWO细胞的标准曲线：SWO细胞浓度的标准曲线呈“S"形，即浓度过高或过低时，其吸光值差别均不大，而细胞浓度在2×103～2×105时，吸光值差别较为显著。因此，我们将96孔板接种细胞的数量定为5×103个/孔(图5)。
图5 SWO-38细胞的标准生长曲线
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2.4.2 各种Glob作用后SWO细胞的生长曲线：不同来源Glob-N均影响SWO-38生长曲线(图6)。其中人脑来源的Glob作用最强，红细胞的次之，牛脑来源的最弱。
图6 各种来源的Glob-N 100μg/ml对胶质瘤
细胞株SWO-38生长曲线的影响
3 讨论
目前国内外对肿瘤相关鞘糖脂的研究主要集中在含唾液酸的鞘糖脂即神经节苷脂方面[5～7]，探讨鞘糖脂与肿瘤发生、发展的关系，而对中性鞘糖脂结构与功能关系的研究较少，尚未见中性鞘糖脂作用于肿瘤细胞的报道。
我们既往的研究已发现正常人脑组织以Glob-N表达为主,而CDH、CTH在胶质瘤组织中表达较强,这在胶质瘤恶性增殖中有何意义呢?本实验研究了人脑Glob-N、红细胞膜Glob-N、牛脑Glob-N对胶质瘤细胞SWO-38生长的影响，选择人脑CDH作为实验对照。
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本实验初步发现三种不同来源的Glob均能抑制胶质瘤细胞SWO-38的增殖。其中以正常人脑的作用最强，红细胞来源的作用次之，牛脑来源的最弱，而人脑CDH则缺乏抑制作用。说明尽管来源不同，但可能因为三种Glob结构上的共同点，使得它们具有一些共同的活性。而糖基数量较少的CDH不具有上述活性。
我们对三种不同来源的Glob-N的核磁共振、飞行时间质谱结构鉴定已表明人脑Glob中的神经酰胺(ceramide,Cer)部分含有的碳原子数量最多，红细胞膜的次之,牛脑Glob中含有的碳原子数量最少。三种Glob-N对胶质瘤细胞增殖的抑制活性也以人脑Glob最强；而牛脑Glob抑制活性最弱。说明Cer的结构与生物活性有一定的关联。Ladisch[8]于1994年曾报道GD2的免疫抑制活性受Cer的影响，短脂酰链GD2活性远远高于长脂酰链者，而单纯Cer却不具有上述生物活性。故认为神经节苷脂免疫抑制活性需要完整分子的参与，Cer决定活性的强弱。我们初步的实验结果与此类似，三种来源的Glob均能抑制胶质瘤细胞增殖，但活性有所不同，并与Cer中含有的碳原子数量存在联系，其中的详细机理还有待进一步实验证实。
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Glob-N抑制SWO-38细胞增殖的机理推测与下列因素有关：(1)通过与胶质瘤细胞表面鞘糖脂相互作用，影响细胞增殖信号传递。如Otsuji[9]研究发现，外源性GM3、Gg3Cer脂质体能抑制B16黑色素瘤的转移，原因是通过抑制GM3-Gg3Cer或GM3-LacCer相互作用，抑制肿瘤细胞粘附于内皮细胞。(2)抑制胶质瘤细胞表面信号蛋白，影响增殖。由于鞘糖脂在细胞膜上的特殊位置，使其非常容易与跨膜蛋白作用，而外源性鞘糖脂又极易与细胞表面糖萼结合。(3)细胞表面可能存在鞘糖脂受体，这样外源性鞘糖脂就可以和受体结合，影响细胞增殖。已有研究[10]认为Glob-N可作为膜受体，起着信号传递作用。Glob-N作用于胶质瘤的分子机理还有待继续深入研究。
Glob-N抑制胶质瘤细胞增殖生长的意义在于：脑胶质瘤具有浸润特性和术后易复发的特点，病人预后欠佳，近20余年的研究尚未取得突破性进展，寻找和发现新的脑胶质瘤生长抑制因子是近年来国内外研究的热点。对Glob-N的深入研究不仅有可能发现一种新的脑胶质瘤生长抑制因子，为胶质瘤细胞恶性增殖机理的研究探索一个新的方向，还为中性鞘糖脂的研究拓宽了领域。
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基金项目：本课题由国家自然科学基金(No.39700143)资助
通讯作者：张健:Tel：86-20-85143484 Fax：86-20-85143487 E-mail：gzzhjr@public.guangzhou.gd.cn
参考文献：
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[8]Ladisch S, Li R, Olson E, et al. Ceramide structure predicts tumor ganglioside immunosuppressive activity [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91： 1974～ 1978.
[9]Otsuji E, Park Y S, Tashiro K, et al. Inhibition of B16 melanoma metastasis by administration of GM3 or Gg3 liposomes： blocking adhesion of melanoma cells to endothelial cells(anti adhesion therapy) via inhibition of GM3-Gg3Cer or GM3 LacCer interaction [J]. Int J Oncol,1995,6： 319～ 327.
[10]Jones DH, Lingwood CA, Barber KR, et al. Globoside as a membrane receptor： a consideration of oligosaccharide communication with the hydrophobic domain [J]. Biochemistry, 1997, 36(28)： 8539～ 8547.
收稿日期：1999-10-06
修稿日期：1999-10-28, 百拇医药