内皮素受体反义寡聚核苷酸抑制血管平滑肌细胞增殖
作者：张岚 张柏根 张纪蔚 钱济先 朱雅萍 邓廉夫
单位：张岚 张柏根 张纪蔚 钱济先(200001上海第二医科大学仁济医院血管外科)；朱雅萍 邓廉夫(上海市创伤骨科研究所)
关键词：
中华外科杂志000326 血管移植或动脉腔内成形术后，常因内膜增厚致血管再狭窄。内皮素(ET)在内膜增生中有重要的促分裂效应。我们设计合成含18 bp的内皮素Ⅰ型受体(ETA)和内皮素Ⅱ型受体(ETB)反义寡聚核苷酸(ODNs)，探讨ODNs对平滑肌细胞(SMC)上ET受体(ETR)蛋白表达和SMC增殖的影响。
1.材料与方法：主要试剂有DMEM细胞培养液；胰蛋白酶；125I-ET-1；抗α-actin单抗；小牛血清；ETA-ODNs和ETB-ODNs。实验方法：(1)细胞培养：无菌状态取3只家兔主动脉段，按文献[1]方法培养SMC，取4～6代细胞。(2)SMC鉴定：按1×104 /L的细胞浓度将SMC接种于含无菌载玻片的六孔板内，生长至一定密度取出，免疫组化法(ABC)鉴定。(3)ODNs的设计合成：从克隆的大鼠和人的ETA和ETB核酸序列，分别筛选设计特异性高的2条含18 bp的反义片段，DNA自动合成仪合成，聚丙烯酰胺凝聚电泳(PAGE)纯化。硫代磷酸修饰5′末端，增加寡核苷酸的稳定性。同法合成相应的正义片段和标有地高辛的反义ETA。(4)ODNS的膜透性检测：地高辛修饰的ETA-ODNs与SMC共培养，爬片生长，分别于4、12、24、48 h后行抗体免疫组化呈色反应。(5)MTT实验：取第4代SMC，按1×104/L浓度接种96孔培养板，孵育48 h后，分别加入不同浓度ETA-ODNs、ETB-ODNs和ETA+ETB-ODNs(均分别为5、10、15 μmol/L)。设立正义对照、阴性对照(不加ODNs)和空白对照(不加细胞)，每组3孔，分别在培养12、24、48、72 h时依次加入5%的噻唑蓝和二甲基亚砜，酶标仪测定OD值。(6)细胞生长计数：据MTT实验结果，用最佳实验组，步骤同MTT实验，计算活细胞个数，设阴性对照组。(7)ODNs作用后SMC蛋白表达状况的检测：采用放射受体结合分析法检测ETA-ODNs组SMC蛋白的表达状况，γ闪烁计数；免疫组化染色(ABC)检测ETB-ODNs对ETB组SMC蛋白表达的影响，均设阴性对照。
, http://www.100md.com
统计方法：组间采用团体t检验，使用STATPAL软件包。
2.结果：血管SMC经传代培养后，细胞形态稳定，抗α-actin抗体免疫组化阳性，证实培养的细胞为血管SMC。ODN的膜透性检测显示ETA-ODNs与SMC共同培养4 h为阴性(无ETA-ODNs进入细胞)，12 h弱阳性(有少量ETA-ODNs进入细胞)，24 h后为阳性(进入细胞的ETA-ODNs增多)。ETR-ODNs对血管SMC增殖作用的影响见表1。15 μmol/L的ETA-ODNs与SMC共同培养后，SMC的增长率在24、48、72 h组与阴性对照及培养12 h组相比，差异均有显著性意义(P<0.05)；正义对照组与阴性组相比差异无显著性意义。15 μmol/L ETA-ODNs组细胞生长计数与阴性对照组相比，培养24 h后差异有显著性意义(P<0.05)。放射受体结合分析实验，经γ计数显示15 μmol/L的ETA-ODNs可抑制血管SMC膜ETA蛋白的表达(表2)；而ETB-ODNs处理或未处理的SMC均未见ETB蛋白表达。
, 百拇医药
表1 ETA-ODN、ETB-ODN对血管SMC增殖作用的影响(OD值，
±s, n=3)
作用时间(h)
ETA-ODNs(μmol/L)
ETB-ODNs(μmol/L)
ET(A+B)-ODNs(μmol/L)
空白
组
阴性
组
15
, http://www.100md.com
10
5
15
10
5
15
10
5
12
0.152
0.165
0.171
0.188
, 百拇医药 0.154
0.168
0.172
0.173
0.173
0.029
0.175
24
0.108
0.132
0.141
0.149
0.135
, http://www.100md.com
0.135
0.118
0.137
0.149
0.021
0.130
48
0.099
0.138
0.134
0.154
0.141
0.121
, http://www.100md.com
0.127
0.128
0.149
0.029
0.138
72
0.092
0.120
0.115
0.123
0.125
0.123
0.134
, 百拇医药
0.123
0.106
0.043
0.111
表2 不同时间血管SMC膜ETA蛋白表达状况(CPM×103) 组别
ETA蛋白
12 h
24 h
48 h
72 h
ETA-ODNs组
6.64±0.05
, 百拇医药
5.36±0.04*
3.51±0.05**
1.50±0.02**
(15 μmol/L)
阴性组
7.02±0.04
9.55±1.02
13.23±1.58
17.54±1.48
注：与阴性对照组相比* P<0.05，**P<0.01 3.讨论：血管SMC和内膜增生是血管移植术、成形术后再狭窄的主要原因，ET-1与SMC表面ETA受体结合后触发的促分裂在内膜增生中发挥重要作用。15 μmol/L浓度的ETA-ODNs对培养的血管SMC的增殖及ETA的表达有抑制作用； ETB-ODNs对SMC增殖无抑制作用。ETA-ODNs通过反义机制抑制ETA蛋白表达及SMC的增殖，其效应与浓度及时间有关。这显示了ETA-ODNs在临床血管移植及重建中应用的良好前景。
参考文献：
[1]Masakazu KO,Hiroaki KA,Takeshi HO,et al.Inhibition of endothelin production by adrenomedulin in vascular smooth muscle cells.Hypertension,1995,25:1185-1190.
收稿日期：1999-03-04, 百拇医药
单位：张岚 张柏根 张纪蔚 钱济先(200001上海第二医科大学仁济医院血管外科)；朱雅萍 邓廉夫(上海市创伤骨科研究所)
关键词：
中华外科杂志000326 血管移植或动脉腔内成形术后，常因内膜增厚致血管再狭窄。内皮素(ET)在内膜增生中有重要的促分裂效应。我们设计合成含18 bp的内皮素Ⅰ型受体(ETA)和内皮素Ⅱ型受体(ETB)反义寡聚核苷酸(ODNs)，探讨ODNs对平滑肌细胞(SMC)上ET受体(ETR)蛋白表达和SMC增殖的影响。
1.材料与方法：主要试剂有DMEM细胞培养液；胰蛋白酶；125I-ET-1；抗α-actin单抗；小牛血清；ETA-ODNs和ETB-ODNs。实验方法：(1)细胞培养：无菌状态取3只家兔主动脉段，按文献[1]方法培养SMC，取4～6代细胞。(2)SMC鉴定：按1×104 /L的细胞浓度将SMC接种于含无菌载玻片的六孔板内，生长至一定密度取出，免疫组化法(ABC)鉴定。(3)ODNs的设计合成：从克隆的大鼠和人的ETA和ETB核酸序列，分别筛选设计特异性高的2条含18 bp的反义片段，DNA自动合成仪合成，聚丙烯酰胺凝聚电泳(PAGE)纯化。硫代磷酸修饰5′末端，增加寡核苷酸的稳定性。同法合成相应的正义片段和标有地高辛的反义ETA。(4)ODNS的膜透性检测：地高辛修饰的ETA-ODNs与SMC共培养，爬片生长，分别于4、12、24、48 h后行抗体免疫组化呈色反应。(5)MTT实验：取第4代SMC，按1×104/L浓度接种96孔培养板，孵育48 h后，分别加入不同浓度ETA-ODNs、ETB-ODNs和ETA+ETB-ODNs(均分别为5、10、15 μmol/L)。设立正义对照、阴性对照(不加ODNs)和空白对照(不加细胞)，每组3孔，分别在培养12、24、48、72 h时依次加入5%的噻唑蓝和二甲基亚砜，酶标仪测定OD值。(6)细胞生长计数：据MTT实验结果，用最佳实验组，步骤同MTT实验，计算活细胞个数，设阴性对照组。(7)ODNs作用后SMC蛋白表达状况的检测：采用放射受体结合分析法检测ETA-ODNs组SMC蛋白的表达状况，γ闪烁计数；免疫组化染色(ABC)检测ETB-ODNs对ETB组SMC蛋白表达的影响，均设阴性对照。
, http://www.100md.com
统计方法：组间采用团体t检验，使用STATPAL软件包。
2.结果：血管SMC经传代培养后，细胞形态稳定，抗α-actin抗体免疫组化阳性，证实培养的细胞为血管SMC。ODN的膜透性检测显示ETA-ODNs与SMC共同培养4 h为阴性(无ETA-ODNs进入细胞)，12 h弱阳性(有少量ETA-ODNs进入细胞)，24 h后为阳性(进入细胞的ETA-ODNs增多)。ETR-ODNs对血管SMC增殖作用的影响见表1。15 μmol/L的ETA-ODNs与SMC共同培养后，SMC的增长率在24、48、72 h组与阴性对照及培养12 h组相比，差异均有显著性意义(P<0.05)；正义对照组与阴性组相比差异无显著性意义。15 μmol/L ETA-ODNs组细胞生长计数与阴性对照组相比，培养24 h后差异有显著性意义(P<0.05)。放射受体结合分析实验，经γ计数显示15 μmol/L的ETA-ODNs可抑制血管SMC膜ETA蛋白的表达(表2)；而ETB-ODNs处理或未处理的SMC均未见ETB蛋白表达。
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表1 ETA-ODN、ETB-ODN对血管SMC增殖作用的影响(OD值，
±s, n=3)作用时间(h)
ETA-ODNs(μmol/L)
ETB-ODNs(μmol/L)
ET(A+B)-ODNs(μmol/L)
空白
组
阴性
组
15
, http://www.100md.com
10
5
15
10
5
15
10
5
12
0.152
0.165
0.171
0.188
, 百拇医药 0.154
0.168
0.172
0.173
0.173
0.029
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24
0.108
0.132
0.141
0.149
0.135
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48
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0.123
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0.043
0.111
表2 不同时间血管SMC膜ETA蛋白表达状况(CPM×103) 组别
ETA蛋白
12 h
24 h
48 h
72 h
ETA-ODNs组
6.64±0.05
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5.36±0.04*
3.51±0.05**
1.50±0.02**
(15 μmol/L)
阴性组
7.02±0.04
9.55±1.02
13.23±1.58
17.54±1.48
注：与阴性对照组相比* P<0.05，**P<0.01 3.讨论：血管SMC和内膜增生是血管移植术、成形术后再狭窄的主要原因，ET-1与SMC表面ETA受体结合后触发的促分裂在内膜增生中发挥重要作用。15 μmol/L浓度的ETA-ODNs对培养的血管SMC的增殖及ETA的表达有抑制作用； ETB-ODNs对SMC增殖无抑制作用。ETA-ODNs通过反义机制抑制ETA蛋白表达及SMC的增殖，其效应与浓度及时间有关。这显示了ETA-ODNs在临床血管移植及重建中应用的良好前景。
参考文献：
[1]Masakazu KO,Hiroaki KA,Takeshi HO,et al.Inhibition of endothelin production by adrenomedulin in vascular smooth muscle cells.Hypertension,1995,25:1185-1190.
收稿日期：1999-03-04, 百拇医药