用逆转录酶-聚合酶链反应检测心肌炎患者心肌活检标本中柯萨奇病毒RNA特异性片段
作者：涂良珍 孙荷 汪公亮 王凤秀
单位：涂良珍(新疆维吾尔族自治区人民医院心脏内科 乌鲁木齐，830001)；孙荷(新疆维吾尔族自治区人民医院心脏内科 乌鲁木齐，830001)；汪公亮(新疆维吾尔族自治区人民医院心脏内科 乌鲁木齐，830001)；王凤秀(新疆维吾尔族自治区人民医院心脏内科 乌鲁木齐，830001)；马伟(新疆维吾尔族自治区人民医院心脏内科 乌鲁木齐，830001)
关键词：
临床心血管病杂志000313 聚合酶链反应(PCR)技术可广泛应用于各领域，其中之一是作为一种分子生物学研究新技术用于病毒性心肌炎的诊断和分析，本文应用逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)技术对心肌活检标本中柯萨奇病毒RNA进行检测分析，报告如下。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 材料
自1995年3月～1996年5月，对住本院心内科40例心律紊乱并怀疑为病毒性心肌炎的患者进行了心肌超微结构观察，对其中12例心肌活检标本，进行了RT-PCR检测，心肌活检标本每块0.8 mm×2 mm～2 mm×2 mm大小，加入无菌生理盐水中，-30℃冻存待查。
1.2 方法
柯萨奇病毒RT-PCR检测试剂盒购自中国科学院北京科海医疗生物工程公司。
1.2.1 样品处理：心肌活检标本加100 ml Lysis、37℃作用4 h使之完全溶解，加20 ml氯仿充分混匀，12 000 r/min离心5 min，小心吸取上层水相，加3倍体积无水乙醇，-20℃放置40 min，12 000 r/min，离心5 min，小心弃上清、沉淀室温晾干，溶于5 ml无RNase水中，做为模板。
, http://www.100md.com
1.2.2 扩增反应：向处理好的样品管中加入10 ml RTmix、10 ml Emix，2滴石蜡油，42℃水浴30 min，然后加入30 ml PCRmix、0.2 ml Taq酶，混匀接94℃ 1 min，55℃ 1 min，扩增35个循环。
1.2.3 结果判定：取10 ml PCR扩增产物于2%琼脂糖凝胶进行电泳，于紫外灯下观察有500 bp荧光条带者为阳性，电泳时设marker。
1.2.4 1109型PCR扩增仪：北京高科技开发公司研制，VV-1型三用紫外检测仪，由上海光明仪器厂生产。
2 结果
12例心肌活检标本柯萨奇病毒RT-PCR检测结果全部为阴性。
3 讨论
, 百拇医药 用RT-PCR方法，未能在心肌活检标本中检测到柯萨奇病毒，主要可能为病毒血症在前，心脏症状在后。出现症状时，病毒血症已过。心肌局部病毒复制亦近尾声。有些心肌损伤是免疫机制引起，所以发病后很难从心脏分离到病毒。
多年来国内仍以常用双份血清病毒中和抗体检测作为诊断病毒性心肌炎依据，特异性IgM抗体测定，在病程早期1～3 d即出现结果，不需双份血清，也不做中和抗体试验，需每日观察细胞病变1周，但非特异性强，在抗核抗体阳性时会出现假阳性，因此利弊具存。
心内膜-心肌活检常从右室取材，而心肌炎时病变主要在左心，活检又限于很小几个局部，虽能看到病理改变，但分离病毒阳性率却很低。用RT-PCR方法检测柯萨奇病毒RNA同病毒分离意义一样，是检测病毒本身，所以阳性率也同样很低。本文12例心肌活检标本结果均为阴性也说明这个问题。因此可见病毒感染后病毒潜在活动和宿主免疫功能失调以及自身免疫异常存在，在本病发生、发展过程中的主要意义。
心内膜-心肌活检后，心肌超微结构组织病理学检查，未发现病毒颗粒及病毒包涵体。心肌病毒分离及RT-PCR也未分离出某种病毒，说明心肌炎病症并非病毒直接作用而引起的，而是病毒感染后，才产生心肌炎病变。炎症持续与免疫系统改变引起心肌细胞损伤有关。
收稿 1999-10-06, 百拇医药
单位：涂良珍(新疆维吾尔族自治区人民医院心脏内科 乌鲁木齐，830001)；孙荷(新疆维吾尔族自治区人民医院心脏内科 乌鲁木齐，830001)；汪公亮(新疆维吾尔族自治区人民医院心脏内科 乌鲁木齐，830001)；王凤秀(新疆维吾尔族自治区人民医院心脏内科 乌鲁木齐，830001)；马伟(新疆维吾尔族自治区人民医院心脏内科 乌鲁木齐，830001)
关键词：
临床心血管病杂志000313 聚合酶链反应(PCR)技术可广泛应用于各领域，其中之一是作为一种分子生物学研究新技术用于病毒性心肌炎的诊断和分析，本文应用逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)技术对心肌活检标本中柯萨奇病毒RNA进行检测分析，报告如下。
1 材料与方法
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1.1 材料
自1995年3月～1996年5月，对住本院心内科40例心律紊乱并怀疑为病毒性心肌炎的患者进行了心肌超微结构观察，对其中12例心肌活检标本，进行了RT-PCR检测，心肌活检标本每块0.8 mm×2 mm～2 mm×2 mm大小，加入无菌生理盐水中，-30℃冻存待查。
1.2 方法
柯萨奇病毒RT-PCR检测试剂盒购自中国科学院北京科海医疗生物工程公司。
1.2.1 样品处理：心肌活检标本加100 ml Lysis、37℃作用4 h使之完全溶解，加20 ml氯仿充分混匀，12 000 r/min离心5 min，小心吸取上层水相，加3倍体积无水乙醇，-20℃放置40 min，12 000 r/min，离心5 min，小心弃上清、沉淀室温晾干，溶于5 ml无RNase水中，做为模板。
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1.2.2 扩增反应：向处理好的样品管中加入10 ml RTmix、10 ml Emix，2滴石蜡油，42℃水浴30 min，然后加入30 ml PCRmix、0.2 ml Taq酶，混匀接94℃ 1 min，55℃ 1 min，扩增35个循环。
1.2.3 结果判定：取10 ml PCR扩增产物于2%琼脂糖凝胶进行电泳，于紫外灯下观察有500 bp荧光条带者为阳性，电泳时设marker。
1.2.4 1109型PCR扩增仪：北京高科技开发公司研制，VV-1型三用紫外检测仪，由上海光明仪器厂生产。
2 结果
12例心肌活检标本柯萨奇病毒RT-PCR检测结果全部为阴性。
3 讨论
, 百拇医药 用RT-PCR方法，未能在心肌活检标本中检测到柯萨奇病毒，主要可能为病毒血症在前，心脏症状在后。出现症状时，病毒血症已过。心肌局部病毒复制亦近尾声。有些心肌损伤是免疫机制引起，所以发病后很难从心脏分离到病毒。
多年来国内仍以常用双份血清病毒中和抗体检测作为诊断病毒性心肌炎依据，特异性IgM抗体测定，在病程早期1～3 d即出现结果，不需双份血清，也不做中和抗体试验，需每日观察细胞病变1周，但非特异性强，在抗核抗体阳性时会出现假阳性，因此利弊具存。
心内膜-心肌活检常从右室取材，而心肌炎时病变主要在左心，活检又限于很小几个局部，虽能看到病理改变，但分离病毒阳性率却很低。用RT-PCR方法检测柯萨奇病毒RNA同病毒分离意义一样，是检测病毒本身，所以阳性率也同样很低。本文12例心肌活检标本结果均为阴性也说明这个问题。因此可见病毒感染后病毒潜在活动和宿主免疫功能失调以及自身免疫异常存在，在本病发生、发展过程中的主要意义。
心内膜-心肌活检后，心肌超微结构组织病理学检查，未发现病毒颗粒及病毒包涵体。心肌病毒分离及RT-PCR也未分离出某种病毒，说明心肌炎病症并非病毒直接作用而引起的，而是病毒感染后，才产生心肌炎病变。炎症持续与免疫系统改变引起心肌细胞损伤有关。
收稿 1999-10-06, 百拇医药