核因子-κB在气道上皮细胞的激活及N-乙酰半胱氨酸的影响
作者：莫红缨 钟南山 郑劲平 龙启才
单位：莫红缨 钟南山 郑劲平(广州呼吸疾病研究所)；龙启才(中山医科大学药理教研室，广州 510120)
关键词：N-乙酰半胱氨酸气道上皮细胞核因子-κB白细胞介素-8肿瘤坏死因子-α
中国临床药理学与治疗学000301
目的 探讨在人气道上皮细胞核因子-κB(NF-κB)的激活情况及抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)对NF-κB的作用机理。方法 应用炎前性细胞因子TNF-α刺激正常人气道上皮细胞株(16HBE)和肿瘤病人气道上皮细胞株(H292)，利用Western-Blot免疫印迹电泳和ELISA实验检测NF-κB的表达和IL-8的分泌水平。结果 TNF-α在体外能刺激激活人气道上皮细胞16HBE和H292的NF-κB表达，刺激后2～4h最高，6h后有所下降。随着TNF-α刺激量的增加，NF-κB活性也随之升高。TNF-α刺激气道上皮细胞后IL-8的分泌水平增加。加入NAC后可抑制NF-κB激活，IL-8分泌水平随之降低；同时发现NAC能以一种剂量依赖方式发挥作用。结论 NAC可通过阻断NF-κB激活的信号转导，参与细胞因子和炎症介质表达的转录调控，在呼吸系气道炎症控制中起着一定的作用。
, 百拇医药
中图分类号 R965
Activation of NF-κ B in airway epithelial cell and modulation mechanism of NAC
MO Hong-Ying，ZHONG Nan-Shan，ZHENG Jing-Ping
(Guangzhou Institute of Respiratory Disease)
LONG Qi-Cai1
(Department of Pharmacology,Sun Yi-Xian Medical University， Guangzhou 510120)
Aim The expression of NF-κ B activation and the effect of antioxidant (N- acetylcysteine, NAC) on NF-κ B activity in human airway epithelial cell was assessed. Methods Using the TNF-α ,the airway epithelial cell strains of normal subject(16HBE) and tumor patient (H292) was activated and using Western-Blot and ELISA the expression of NF-κ B and IL-8 were detected. Results It was found that the activity of NF-κ B could be stimulated by the TNF-α and increase with the amount of TNF-α with the peak occurring at 2 to 4 hours after stimulation and then decreasing at six hours. At the same time, the level of IL-8 was elevated, but decreased with inhibition of NF-κ B activity by NAC, that means the action of NAC has a dose-dependent effect. Conclusion NAC not only blocks the signal transmission activated by NF-κ B, but also anticipates the transcription modulation of expression of many cell factors and inflammatory mediums. It suggests that NAC may play a role in the anti-inflammatory treatment of respiratory diseases.
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Key words N-acetylcysteine; airway epithelial cell; NF-κ B; IL-8; TNF-α
核因子-κB(NF-κB)是一种多向性转录调节蛋白，能与多种细胞基因的启动子和增强子中的κB序列位点发生特异结合,参与众多与免疫和炎症反应有关的基因转录调控,在一系列由细胞因子,炎症介质及蛋白酶类参与的疾病的发病过程中发挥重要作用[1]。肿瘤坏死因子(TNF-α)是重要的一线炎前性细胞因子，在气道炎症的发生发展过程中具有关键的作用[2]。研究表明[3]：TNF-α可激活NF-κB诱导其它炎症因子的表达，从而在气道炎症中发挥其重要作用。然而，TNF-α在人气道上皮细胞重塑中的地位及其作用机制并不十分清楚。为此，本实验利用体外培养的人气道上皮细胞株，通过TNF-α刺激气道上皮细胞来观察NF-κB激活情况以及N-乙酰半胱氨酸(NAC)对NF-κB的作用及其对白细胞介素-8(IL-8)分泌水平的影响，试图探讨NF-κB激活在气道上皮细胞的作用和NAC的可能作用机理。
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1材料和方法
11细胞培养正常人气道上皮细胞株(16HBE)
和肿瘤病人气道上皮细胞株(H292)均由英国Southampton大学医学院惠赠。
111TNF-α对人气道上皮细胞NF-κB表达水平及IL-8分泌水平的作用用含10%胎牛血清MEM为培养基,以1×105/ml细胞接种于25cm2培养瓶中,置于37℃,5%二氧化碳孵箱里培养,每隔2d换液,待细胞长至基本融合状态时用于实验。细胞经常规胰蛋白酶法消化后以1×105/ml接种于75cm2培养瓶和6孔培养板中继续培养至细胞基本长满瓶底。实验：3瓶(孔)/组，加入不同浓度(0,100,1000U·mL-1)的TNF-α(peninsulalab产品)，培养瓶刺激2h；培养板刺激4h。(其中0U·mL-1的TNF-α作对照组，只加MEM空白培养液)。经1000U·mL-1TNF-α刺激后，于不同时间(1,2,4,6h)收集培养板细胞培养液，以4℃,2790×g离心10min，收集上清液，密封保存于-70℃低温冰箱中，待测IL-8。收集培养瓶细胞提取细胞核蛋白。
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1.1.2N-乙酰半胱氨酸(NAC)对TNF-α刺激人气道上皮细胞NF-κB表达水平及IL-8分泌水平的影响所选细胞株及细胞培养方法与1.1.1相同，3瓶(孔)/组，分别加入不同浓度(4,8,16,32mmol·L-1)的NAC(Zambon公司惠赠)培养24h后，再加入1000U·mL-1TNF-α，培养瓶刺激2h；培养板刺激4h。收集培养板细胞培养液，处理及保存方法同1.1.1，待测IL-8。收集培养瓶细胞提取细胞核蛋白。
1.2细胞核蛋白提取及免疫印迹电泳(Wes-tern-Blot)实验
1.2.1细胞核蛋白提取[4]在4℃条件下将细胞悬于0.5ml的A液[10mmol·L-1Hepes-NaOH(pH7.8),1.5mmol·L-1KCl，0.1mmol·L-1EDTA，1mmol·L-1DTT，1mmol·L-1PMSF]，在4℃，750×g离心5min,将沉淀细胞悬于0.2ml的A液，在冰上10min,加入P-40至0.5%,振荡15s，在4℃，1330×g离心5min，将沉淀细胞悬于15μl的B液[20mmol·L-1Hepes-NaOH(pH7.8),1.5mmol·L-1MgCl2,0.5mmol·L-1DTT,0.42mol·L-1NaCl,0.2mmol·L-1EDTA,25%甘油,0.5mmol·L-1PMSF],在冰上振荡洗涤5min,在4℃，16300×g离心10min,上清于75μl的C液[20mmol·L-1Hepes-NaOH(pH7.8),50mmol·L-1KCl,0.2mmol·L-1EDTA,0.5mmol·L-1DTT,0.5mmol·L-1PMSF]保存于-70℃备用。
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1.2.2核蛋白浓度测定采用Bradford法，BrilliantBlueG-250显色,用BSA作标准。(Bio-Rad公司)。
1.2.3Western-Blot免疫印迹电泳用10%SDS-PAGE丙烯酰胺凝胶垂直电泳分离不同分子量蛋白，在4℃转移到硝酸纤维膜上，用抗NF-κB特异性抗体，P50和P65为探针(第一抗体)使用浓度0.5μg·mL-1,(SantaCruz生物技术公司),多克隆抗兔IgG为第二抗体，用量1∶5000,(Promega公司)，碱性磷酸酶酶联抗体生色底物使用NBT和BCIP，在原位杂交显色。
1.2.4NF-κB表达量分析采用凝胶扫描图象分析仪,以峰面积P50,P65总量分析NF-κB表达量。
1.3IL-8的测定ELISA方法测定细胞培养上清液IL-8浓度,试剂盒为第四军医大学免疫教研室产品，按照说明书提供步骤操作。
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1.4统计学处理实验组间采用两个样本均数t检验。
2结果
2.1TNF-α对人气道上皮细胞NF-κB表达水平及IL-8分泌水平的作用
2.1.1TNF-α对人气道上皮细胞NF-κB表达水平的作用图1和图2所示，TNF-α刺激正常人气道上皮细胞株(16HBE)和肿瘤病人气道上皮细胞株(H292)后均可以激活NF-κB，由P50和P65共同参与。动态观察NF-κB变化情况，在培养基的培养条件下对照组有一定水平的表达。以TNF-α刺激2～4h达最高，6h已有所下降，但仍高于对照组；随着TNF-α量(100,1000U·mL-1)的增加，NF-κB活性也随之升高。与对照组相比均有明显的差异(P<0.05)。实验发现，在相同条件下，肿瘤病人上皮细胞株(H292)的NF_κB表达比正常人气道上皮细胞株(16HBE)高。
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图1TNF-α刺激正常人气道上皮细胞(16HBE)激活NF-κB(n="3)
图2TNF-α刺激肿瘤病人气道上皮细胞(H292)激活HF-κB(n=3)
图1、2：1～4分别经1000U·mL-1TNF-α刺激1,2,4,6h后激活的NF-κB；5：对照组；6～7分别经100,1000U·mL-1TNF-α刺激2h后激活的NF-κB
表1 TNF-α对人气道上皮细胞IL-8分必水平的下调作用(
±s,n=3ng.L-1) 组别
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对照组
TNF-α不同剂量刺激/U·ml-1
TNF-α不同作用时间刺激/h
100
1000
1
2
4
6
16HBE
91.4±55.9
233.1±50.0*
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840.6±223.7*
105.2±77.2
150.5±105.9
840.6±223.5*
1045.5±439.0*
H292
334.2±110.9
566.9±84.4+
823.9±178.0+
379.4±152.2
404.2±159.8
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823.9±178.0+
11242.2±425.8+
与16HBE对照组比较*P<0.05与H292对照组比较+
表2 NAC对人气道上皮细胞IL-8分必水平的下调作用(±s,n=3ng.L-1) 组别
刺激组
NAC不同剂量/mmol.L-1
4
8
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16
32
16HBE
840.6±223.7
390.9±72.8*
243.1±47.6*
148.8±69.5*
129.7±70.8*
H292
823.9±178.8
502.2±61.7*
401.0±118.3+
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382.4±149.1+
366.6±125.6+
与16HBE对照组比较P<0.05与H292对照组比较+P0.05
2.1.2TNF-α对人气道上皮细胞IL-8分泌水平的作用见表1，基础状态下气道上皮细胞16HBE和H292能分泌一定量的IL-8。在TNF-α(1000U·mL-1)刺激不同作用时间(1，2，4，6h)，IL-8的分泌水平均有增高，其中在4，6h，16HBE和H292的IL-8分泌水平显著高于对照组(P<0.05)。不同刺激剂量TNF_α(100,1000U·mL-1)在刺激4h的时间点上，16HBE和H292的IL_8分泌水平与对照组相比均有明显的差异(P<0.05)。IL_8分泌水平也随TNF_α量的增加而增加。
2.2N-乙酰半胱氨酸(NAC)对人气道上皮细胞激活的NF-κB的抑制作用及IL-8分泌水平的影响
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2.2.1NAC对人气道上皮细胞激活的NF-κB的抑制作用图3和图4显示，加入不同浓度(4,8,16,32mmol·L-1)NAC后可在一定程度上抑制由TNF-α刺激激活NF-κB，分别与TNF-α(1000U·mL-1,2h)刺激组16HBE和H292的NF-κB相比，均有明显的差异(P<0.05)。同时发现NAC的抑制作用能以一种剂量依赖方式，随着NAC量的增加，NF_κB活性随之下降。
图3NAC对正常人气道上皮细胞(16HBE)激活的NF-κB抑制作用
图4NAC对肿瘤病人气道上皮细胞(H292)激活的NF-κB抑制作用
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图3、4：1：对照组；2：1000U·mL-1TNF-α刺激2h后NF-κB(刺激组)；3～6分别加入4,8,16,32mmol·L-1NAC培养24h后,经1000U·mL-1TNF-α刺激2h后NF-κB。
2.2.2NAC对人气道上皮细胞IL-8分泌水平的下调作用见表2，加入上述不同浓度NAC与细胞培养24h后，用1000U·mL-1TNF-α刺激4h后观察IL-8分泌水平变化。在不同浓度NAC作用下，16HBE和H292的IL-8浓度，分别与TNF-α(1000U·mL-1,4h)刺激组16HBE和H292的IL-8浓度相比，均有明显的差异(P<0.05)。NAC对IL_8分泌水平的下调作用也有剂量依赖性。
3讨论
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气道上皮细胞不仅具有防御保护和物理屏障的功能，而且还能通过分泌炎症因子TNF-α，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，细胞间粘附分子-1(ICAM-1)，IL-8等发挥免疫效应细胞的功能，因此在气道炎症的发病机制中占有一定的地位。TNF-α是气道炎症过程中重要的启动因子,是气道强有力的刺激剂,可诱导一系列细胞因子的产生而介导炎症反应[2]。有学者[5]认为TNF-α诱导诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性表达导致氧自由基大量增多,引起气道组织细胞损伤。最近研究发现在气道中许多增加炎症的刺激可导致NF-κB的激活,且免疫细胞化学揭示主要定位于上皮细胞和巨噬细胞[6]，本研究也证实：正常人气道上皮细胞株(16HBE)和肿瘤病人气道上皮细胞株(H292)经TNF-α刺激均可激活NF-κB，并由P50和P65共同参与。与对照组相比，均有明显的统计学差异(P<0.05)。而TNF_α既可作为NF_κB的激活剂，又受其调节，因此，反映NF_κB不仅使气道中炎症介质基因表达，而且通过反馈环路导致炎症过程的放大和持续。由于受NF_κB调控的基因表达产物包括了大多数参与气道炎症形成的主要细胞因子和炎症介质，提示NF_κB在气道炎症的发病机制中起重要作用。由于NF_κB是各种炎症反应的共同通路，故可作为进行干预治疗的重要靶位。至于NF_κB能否选择性控制某一特异性炎症反应基因目前尚未清楚。
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研究报道[7]NF-κB对气道炎症因子基因的转录调控起至关重要的作用。已知多种炎症介质：如TNF-α，IL-1,IL-6,IL-8,IL-2和血管细胞粘附分子-1(VCAM-1),内皮细胞白细胞粘附分子-1(ELAM-1),ICAM-1等基因的启动子和增强子中存在一个或多个κB序列。活化的NF-κB可单独或与其它转录因子协同，参与上述介质基因的诱导表达。在其它细胞已证实NF-κB参与IL-8的转录调控[7]，本研究结果显示TNF-α刺激气道上皮细胞激活NF-κB的同时IL-8分泌水平升高，说明在气道上皮细胞，NF-κB参与TNF-α诱导的IL-8mRNA的表达调控，导致IL-8分泌水平的增加，证实NF-κB在促进炎症的过程中发挥着重要作用。
动态观察发现TNF-α刺激气道上皮细胞引起NF-κB活性和IL-8分泌水平的变化有时间和剂量依赖性的。有学者认为[8]NF-κB激活状态的维持与诱导剂的种类、刺激的时间、剂量、细胞类型有关。如TNF-α刺激HL-60细胞后2～4min即可探及NF-κB活性，并可持续至少3h(已知活性的NF-κB的半衰期短于30min)，但是NF-κB活性的维持需要新的蛋白的合成及持续的外部刺激。
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在呼吸道细菌感染、气道炎症、哮喘、支气管高反应性的发病过程中有大量的自由基产生，氧自由基可刺激气道上皮细胞内皮素(ET-1)、血栓素A2(TXA2)释放，引起支气管平滑肌收缩，支气管高反应性形成[9]，此外氧自由基可诱导中性粒细胞粘附于呼吸道上皮细胞，刺激IL-1、TNF-α产生，而后者又通过刺激ET-1,TXA2产生，从而加剧支气管高反应性发生。目前报道[10]，抗氧化剂能阻断各种刺激剂刺激激活的NF-κB。本实验证实：抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)能以一种剂量依赖方式抑制由TNF-α刺激气道上皮细胞激活的NF-κB和下调IL-8分泌水平。提示NAC通过抑制上皮细胞激活NF-κB的途径，导致下调IL-8分泌水平。此可能在气道炎症和支气管高反应性控制中起着一定作用。
莫红缨，女，硕士。
钟南山，男，中国工程院院士，博士研究生导师。
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参 考 文 献
1，Barnes PJ,Adcock IM. NF-κ B: a pivotal role in asthma and a new target for therapy.Pharmacol Sci,1997;18(2):46
2，Matsumoto K,Hashimoto S, Gon, et al. Proinflam-matory cytokine-induced and chemical mediator induced IL-8 expression in human bronchial epithelial cells through P38 mitogen-activated protein kinase-dependent pathway. J Allergy Clin Immunol, 1998;101(6Pt1):825
3，Jang B,Betz R,Schreck R. Activation of the tran-scription factor NF-κ B in human tracheobronchial ep-ithelial cells by inflammatory stimuli. Eur Respir J,1995;8:387
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4，Wang P, Wu P, Marvin I, et al. Interleukin (IL)-10 inhibits nuclear factor κ B(NF-κ B) activation in hu-man monocytes. J Bio Chem,1995;270(16):9558
5，Bryant JL.Copurification of 13KD nitric oxide syn-thase and 22KD link protein from human neutrophils.Biochem Biophys Res Commun,1992;189:55869A
6，Adcock IM, Gelder CM, Shirasaki H,et al. Effect of sterodis on transpription factors in human lung. Am Rev Respir Dis,1992;145:A834
, 百拇医药
7，Blackwell TS, Christman JV. The role of nuclear factor-kappa B in cytokine gene regulation. Am J Respir Cell Mol Biol,1997;17:3
8，张彦红,钟南山.NF-κB和呼吸疾病.国外医学呼吸系统分册，1999； 19(2):88
9，Katsumata U,Miura M,Ichinosa M,et al. Oxygen radicals produce airway construction and hyperre-sponsiveness in anesthetized cats.Am Rew Res Dis,1990； 141:1158
10，Lentsch AB, Cxermark BJ, Bless NM, et al.NF-κ B activation during IgG immune complex induced lung njury: requirements for TNF-α and IL-1β but not complement. Am J Pathol,1998； 152(5):1327
2000-05-26收稿，2000-06-21修回, http://www.100md.com
单位：莫红缨 钟南山 郑劲平(广州呼吸疾病研究所)；龙启才(中山医科大学药理教研室，广州 510120)
关键词：N-乙酰半胱氨酸气道上皮细胞核因子-κB白细胞介素-8肿瘤坏死因子-α
中国临床药理学与治疗学000301
目的 探讨在人气道上皮细胞核因子-κB(NF-κB)的激活情况及抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)对NF-κB的作用机理。方法 应用炎前性细胞因子TNF-α刺激正常人气道上皮细胞株(16HBE)和肿瘤病人气道上皮细胞株(H292)，利用Western-Blot免疫印迹电泳和ELISA实验检测NF-κB的表达和IL-8的分泌水平。结果 TNF-α在体外能刺激激活人气道上皮细胞16HBE和H292的NF-κB表达，刺激后2～4h最高，6h后有所下降。随着TNF-α刺激量的增加，NF-κB活性也随之升高。TNF-α刺激气道上皮细胞后IL-8的分泌水平增加。加入NAC后可抑制NF-κB激活，IL-8分泌水平随之降低；同时发现NAC能以一种剂量依赖方式发挥作用。结论 NAC可通过阻断NF-κB激活的信号转导，参与细胞因子和炎症介质表达的转录调控，在呼吸系气道炎症控制中起着一定的作用。
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中图分类号 R965
Activation of NF-κ B in airway epithelial cell and modulation mechanism of NAC
MO Hong-Ying，ZHONG Nan-Shan，ZHENG Jing-Ping
(Guangzhou Institute of Respiratory Disease)
LONG Qi-Cai1
(Department of Pharmacology,Sun Yi-Xian Medical University， Guangzhou 510120)
Aim The expression of NF-κ B activation and the effect of antioxidant (N- acetylcysteine, NAC) on NF-κ B activity in human airway epithelial cell was assessed. Methods Using the TNF-α ,the airway epithelial cell strains of normal subject(16HBE) and tumor patient (H292) was activated and using Western-Blot and ELISA the expression of NF-κ B and IL-8 were detected. Results It was found that the activity of NF-κ B could be stimulated by the TNF-α and increase with the amount of TNF-α with the peak occurring at 2 to 4 hours after stimulation and then decreasing at six hours. At the same time, the level of IL-8 was elevated, but decreased with inhibition of NF-κ B activity by NAC, that means the action of NAC has a dose-dependent effect. Conclusion NAC not only blocks the signal transmission activated by NF-κ B, but also anticipates the transcription modulation of expression of many cell factors and inflammatory mediums. It suggests that NAC may play a role in the anti-inflammatory treatment of respiratory diseases.
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Key words N-acetylcysteine; airway epithelial cell; NF-κ B; IL-8; TNF-α
核因子-κB(NF-κB)是一种多向性转录调节蛋白，能与多种细胞基因的启动子和增强子中的κB序列位点发生特异结合,参与众多与免疫和炎症反应有关的基因转录调控,在一系列由细胞因子,炎症介质及蛋白酶类参与的疾病的发病过程中发挥重要作用[1]。肿瘤坏死因子(TNF-α)是重要的一线炎前性细胞因子，在气道炎症的发生发展过程中具有关键的作用[2]。研究表明[3]：TNF-α可激活NF-κB诱导其它炎症因子的表达，从而在气道炎症中发挥其重要作用。然而，TNF-α在人气道上皮细胞重塑中的地位及其作用机制并不十分清楚。为此，本实验利用体外培养的人气道上皮细胞株，通过TNF-α刺激气道上皮细胞来观察NF-κB激活情况以及N-乙酰半胱氨酸(NAC)对NF-κB的作用及其对白细胞介素-8(IL-8)分泌水平的影响，试图探讨NF-κB激活在气道上皮细胞的作用和NAC的可能作用机理。
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1材料和方法
11细胞培养正常人气道上皮细胞株(16HBE)
和肿瘤病人气道上皮细胞株(H292)均由英国Southampton大学医学院惠赠。
111TNF-α对人气道上皮细胞NF-κB表达水平及IL-8分泌水平的作用用含10%胎牛血清MEM为培养基,以1×105/ml细胞接种于25cm2培养瓶中,置于37℃,5%二氧化碳孵箱里培养,每隔2d换液,待细胞长至基本融合状态时用于实验。细胞经常规胰蛋白酶法消化后以1×105/ml接种于75cm2培养瓶和6孔培养板中继续培养至细胞基本长满瓶底。实验：3瓶(孔)/组，加入不同浓度(0,100,1000U·mL-1)的TNF-α(peninsulalab产品)，培养瓶刺激2h；培养板刺激4h。(其中0U·mL-1的TNF-α作对照组，只加MEM空白培养液)。经1000U·mL-1TNF-α刺激后，于不同时间(1,2,4,6h)收集培养板细胞培养液，以4℃,2790×g离心10min，收集上清液，密封保存于-70℃低温冰箱中，待测IL-8。收集培养瓶细胞提取细胞核蛋白。
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1.1.2N-乙酰半胱氨酸(NAC)对TNF-α刺激人气道上皮细胞NF-κB表达水平及IL-8分泌水平的影响所选细胞株及细胞培养方法与1.1.1相同，3瓶(孔)/组，分别加入不同浓度(4,8,16,32mmol·L-1)的NAC(Zambon公司惠赠)培养24h后，再加入1000U·mL-1TNF-α，培养瓶刺激2h；培养板刺激4h。收集培养板细胞培养液，处理及保存方法同1.1.1，待测IL-8。收集培养瓶细胞提取细胞核蛋白。
1.2细胞核蛋白提取及免疫印迹电泳(Wes-tern-Blot)实验
1.2.1细胞核蛋白提取[4]在4℃条件下将细胞悬于0.5ml的A液[10mmol·L-1Hepes-NaOH(pH7.8),1.5mmol·L-1KCl，0.1mmol·L-1EDTA，1mmol·L-1DTT，1mmol·L-1PMSF]，在4℃，750×g离心5min,将沉淀细胞悬于0.2ml的A液，在冰上10min,加入P-40至0.5%,振荡15s，在4℃，1330×g离心5min，将沉淀细胞悬于15μl的B液[20mmol·L-1Hepes-NaOH(pH7.8),1.5mmol·L-1MgCl2,0.5mmol·L-1DTT,0.42mol·L-1NaCl,0.2mmol·L-1EDTA,25%甘油,0.5mmol·L-1PMSF],在冰上振荡洗涤5min,在4℃，16300×g离心10min,上清于75μl的C液[20mmol·L-1Hepes-NaOH(pH7.8),50mmol·L-1KCl,0.2mmol·L-1EDTA,0.5mmol·L-1DTT,0.5mmol·L-1PMSF]保存于-70℃备用。
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1.2.2核蛋白浓度测定采用Bradford法，BrilliantBlueG-250显色,用BSA作标准。(Bio-Rad公司)。
1.2.3Western-Blot免疫印迹电泳用10%SDS-PAGE丙烯酰胺凝胶垂直电泳分离不同分子量蛋白，在4℃转移到硝酸纤维膜上，用抗NF-κB特异性抗体，P50和P65为探针(第一抗体)使用浓度0.5μg·mL-1,(SantaCruz生物技术公司),多克隆抗兔IgG为第二抗体，用量1∶5000,(Promega公司)，碱性磷酸酶酶联抗体生色底物使用NBT和BCIP，在原位杂交显色。
1.2.4NF-κB表达量分析采用凝胶扫描图象分析仪,以峰面积P50,P65总量分析NF-κB表达量。
1.3IL-8的测定ELISA方法测定细胞培养上清液IL-8浓度,试剂盒为第四军医大学免疫教研室产品，按照说明书提供步骤操作。
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1.4统计学处理实验组间采用两个样本均数t检验。
2结果
2.1TNF-α对人气道上皮细胞NF-κB表达水平及IL-8分泌水平的作用
2.1.1TNF-α对人气道上皮细胞NF-κB表达水平的作用图1和图2所示，TNF-α刺激正常人气道上皮细胞株(16HBE)和肿瘤病人气道上皮细胞株(H292)后均可以激活NF-κB，由P50和P65共同参与。动态观察NF-κB变化情况，在培养基的培养条件下对照组有一定水平的表达。以TNF-α刺激2～4h达最高，6h已有所下降，但仍高于对照组；随着TNF-α量(100,1000U·mL-1)的增加，NF-κB活性也随之升高。与对照组相比均有明显的差异(P<0.05)。实验发现，在相同条件下，肿瘤病人上皮细胞株(H292)的NF_κB表达比正常人气道上皮细胞株(16HBE)高。
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图1TNF-α刺激正常人气道上皮细胞(16HBE)激活NF-κB(n="3)
图2TNF-α刺激肿瘤病人气道上皮细胞(H292)激活HF-κB(n=3)
图1、2：1～4分别经1000U·mL-1TNF-α刺激1,2,4,6h后激活的NF-κB；5：对照组；6～7分别经100,1000U·mL-1TNF-α刺激2h后激活的NF-κB
表1 TNF-α对人气道上皮细胞IL-8分必水平的下调作用(
±s,n=3ng.L-1) 组别, 百拇医药
对照组
TNF-α不同剂量刺激/U·ml-1
TNF-α不同作用时间刺激/h
100
1000
1
2
4
6
16HBE
91.4±55.9
233.1±50.0*
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840.6±223.7*
105.2±77.2
150.5±105.9
840.6±223.5*
1045.5±439.0*
H292
334.2±110.9
566.9±84.4+
823.9±178.0+
379.4±152.2
404.2±159.8
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823.9±178.0+
11242.2±425.8+
与16HBE对照组比较*P<0.05与H292对照组比较+
表2 NAC对人气道上皮细胞IL-8分必水平的下调作用(
±s,n=3ng.L-1) 组别刺激组
NAC不同剂量/mmol.L-1
4
8
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16
32
16HBE
840.6±223.7
390.9±72.8*
243.1±47.6*
148.8±69.5*
129.7±70.8*
H292
823.9±178.8
502.2±61.7*
401.0±118.3+
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382.4±149.1+
366.6±125.6+
与16HBE对照组比较P<0.05与H292对照组比较+P0.05
2.1.2TNF-α对人气道上皮细胞IL-8分泌水平的作用见表1，基础状态下气道上皮细胞16HBE和H292能分泌一定量的IL-8。在TNF-α(1000U·mL-1)刺激不同作用时间(1，2，4，6h)，IL-8的分泌水平均有增高，其中在4，6h，16HBE和H292的IL-8分泌水平显著高于对照组(P<0.05)。不同刺激剂量TNF_α(100,1000U·mL-1)在刺激4h的时间点上，16HBE和H292的IL_8分泌水平与对照组相比均有明显的差异(P<0.05)。IL_8分泌水平也随TNF_α量的增加而增加。
2.2N-乙酰半胱氨酸(NAC)对人气道上皮细胞激活的NF-κB的抑制作用及IL-8分泌水平的影响
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2.2.1NAC对人气道上皮细胞激活的NF-κB的抑制作用图3和图4显示，加入不同浓度(4,8,16,32mmol·L-1)NAC后可在一定程度上抑制由TNF-α刺激激活NF-κB，分别与TNF-α(1000U·mL-1,2h)刺激组16HBE和H292的NF-κB相比，均有明显的差异(P<0.05)。同时发现NAC的抑制作用能以一种剂量依赖方式，随着NAC量的增加，NF_κB活性随之下降。
图3NAC对正常人气道上皮细胞(16HBE)激活的NF-κB抑制作用
图4NAC对肿瘤病人气道上皮细胞(H292)激活的NF-κB抑制作用
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图3、4：1：对照组；2：1000U·mL-1TNF-α刺激2h后NF-κB(刺激组)；3～6分别加入4,8,16,32mmol·L-1NAC培养24h后,经1000U·mL-1TNF-α刺激2h后NF-κB。
2.2.2NAC对人气道上皮细胞IL-8分泌水平的下调作用见表2，加入上述不同浓度NAC与细胞培养24h后，用1000U·mL-1TNF-α刺激4h后观察IL-8分泌水平变化。在不同浓度NAC作用下，16HBE和H292的IL-8浓度，分别与TNF-α(1000U·mL-1,4h)刺激组16HBE和H292的IL-8浓度相比，均有明显的差异(P<0.05)。NAC对IL_8分泌水平的下调作用也有剂量依赖性。
3讨论
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气道上皮细胞不仅具有防御保护和物理屏障的功能，而且还能通过分泌炎症因子TNF-α，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，细胞间粘附分子-1(ICAM-1)，IL-8等发挥免疫效应细胞的功能，因此在气道炎症的发病机制中占有一定的地位。TNF-α是气道炎症过程中重要的启动因子,是气道强有力的刺激剂,可诱导一系列细胞因子的产生而介导炎症反应[2]。有学者[5]认为TNF-α诱导诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性表达导致氧自由基大量增多,引起气道组织细胞损伤。最近研究发现在气道中许多增加炎症的刺激可导致NF-κB的激活,且免疫细胞化学揭示主要定位于上皮细胞和巨噬细胞[6]，本研究也证实：正常人气道上皮细胞株(16HBE)和肿瘤病人气道上皮细胞株(H292)经TNF-α刺激均可激活NF-κB，并由P50和P65共同参与。与对照组相比，均有明显的统计学差异(P<0.05)。而TNF_α既可作为NF_κB的激活剂，又受其调节，因此，反映NF_κB不仅使气道中炎症介质基因表达，而且通过反馈环路导致炎症过程的放大和持续。由于受NF_κB调控的基因表达产物包括了大多数参与气道炎症形成的主要细胞因子和炎症介质，提示NF_κB在气道炎症的发病机制中起重要作用。由于NF_κB是各种炎症反应的共同通路，故可作为进行干预治疗的重要靶位。至于NF_κB能否选择性控制某一特异性炎症反应基因目前尚未清楚。
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研究报道[7]NF-κB对气道炎症因子基因的转录调控起至关重要的作用。已知多种炎症介质：如TNF-α，IL-1,IL-6,IL-8,IL-2和血管细胞粘附分子-1(VCAM-1),内皮细胞白细胞粘附分子-1(ELAM-1),ICAM-1等基因的启动子和增强子中存在一个或多个κB序列。活化的NF-κB可单独或与其它转录因子协同，参与上述介质基因的诱导表达。在其它细胞已证实NF-κB参与IL-8的转录调控[7]，本研究结果显示TNF-α刺激气道上皮细胞激活NF-κB的同时IL-8分泌水平升高，说明在气道上皮细胞，NF-κB参与TNF-α诱导的IL-8mRNA的表达调控，导致IL-8分泌水平的增加，证实NF-κB在促进炎症的过程中发挥着重要作用。
动态观察发现TNF-α刺激气道上皮细胞引起NF-κB活性和IL-8分泌水平的变化有时间和剂量依赖性的。有学者认为[8]NF-κB激活状态的维持与诱导剂的种类、刺激的时间、剂量、细胞类型有关。如TNF-α刺激HL-60细胞后2～4min即可探及NF-κB活性，并可持续至少3h(已知活性的NF-κB的半衰期短于30min)，但是NF-κB活性的维持需要新的蛋白的合成及持续的外部刺激。
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在呼吸道细菌感染、气道炎症、哮喘、支气管高反应性的发病过程中有大量的自由基产生，氧自由基可刺激气道上皮细胞内皮素(ET-1)、血栓素A2(TXA2)释放，引起支气管平滑肌收缩，支气管高反应性形成[9]，此外氧自由基可诱导中性粒细胞粘附于呼吸道上皮细胞，刺激IL-1、TNF-α产生，而后者又通过刺激ET-1,TXA2产生，从而加剧支气管高反应性发生。目前报道[10]，抗氧化剂能阻断各种刺激剂刺激激活的NF-κB。本实验证实：抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)能以一种剂量依赖方式抑制由TNF-α刺激气道上皮细胞激活的NF-κB和下调IL-8分泌水平。提示NAC通过抑制上皮细胞激活NF-κB的途径，导致下调IL-8分泌水平。此可能在气道炎症和支气管高反应性控制中起着一定作用。
莫红缨，女，硕士。
钟南山，男，中国工程院院士，博士研究生导师。
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参 考 文 献
1，Barnes PJ,Adcock IM. NF-κ B: a pivotal role in asthma and a new target for therapy.Pharmacol Sci,1997;18(2):46
2，Matsumoto K,Hashimoto S, Gon, et al. Proinflam-matory cytokine-induced and chemical mediator induced IL-8 expression in human bronchial epithelial cells through P38 mitogen-activated protein kinase-dependent pathway. J Allergy Clin Immunol, 1998;101(6Pt1):825
3，Jang B,Betz R,Schreck R. Activation of the tran-scription factor NF-κ B in human tracheobronchial ep-ithelial cells by inflammatory stimuli. Eur Respir J,1995;8:387
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4，Wang P, Wu P, Marvin I, et al. Interleukin (IL)-10 inhibits nuclear factor κ B(NF-κ B) activation in hu-man monocytes. J Bio Chem,1995;270(16):9558
5，Bryant JL.Copurification of 13KD nitric oxide syn-thase and 22KD link protein from human neutrophils.Biochem Biophys Res Commun,1992;189:55869A
6，Adcock IM, Gelder CM, Shirasaki H,et al. Effect of sterodis on transpription factors in human lung. Am Rev Respir Dis,1992;145:A834
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7，Blackwell TS, Christman JV. The role of nuclear factor-kappa B in cytokine gene regulation. Am J Respir Cell Mol Biol,1997;17:3
8，张彦红,钟南山.NF-κB和呼吸疾病.国外医学呼吸系统分册，1999； 19(2):88
9，Katsumata U,Miura M,Ichinosa M,et al. Oxygen radicals produce airway construction and hyperre-sponsiveness in anesthetized cats.Am Rew Res Dis,1990； 141:1158
10，Lentsch AB, Cxermark BJ, Bless NM, et al.NF-κ B activation during IgG immune complex induced lung njury: requirements for TNF-α and IL-1β but not complement. Am J Pathol,1998； 152(5):1327
2000-05-26收稿，2000-06-21修回, http://www.100md.com