肝动脉灌注莪术油明胶微球对荷瘤大鼠的抗癌活性
作者：邓嵘 陈济民 吴万垠
单位：陈济民 邓嵘(沈阳药科大学药学系，沈阳 110015)
关键词：莪术油；明胶微球；肝动脉栓塞；肿瘤生长抑制率；生命延长率
沈阳药科大学学报000314 摘 要 建立了大鼠移植性肝癌模型，对肝动脉栓塞用莪术油明胶微球的抗癌活性进行研究，结果表明莪术油明胶微球经肝动脉灌注对大鼠移植性肝癌有较好的疗效，大鼠平均肿瘤生长抑制率为94.5%，平均生命延长率为117.9%，与对照组相比能显著性抑制肿瘤生长(P<0.01)和延长大鼠生存时间(P<0.01).
分类号 R96
The Anti-tumor Activity of Zedoary Turmeric Oil Gelatin Microspheres for Heparical Arterial Embolization
, 百拇医药
Deng Rong,Chen Jimin,Wu Wanyin
Department of Pharmacy,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015
Abstract The anti-tumor activity of zedoary turmeric oil gelatin microspheres(ZT-GMS)was studied in Wistar rats bearing transplantable hepatocelluar cancer.Seven days after inoculation into the rats′livers,normal saline,conventional zedoary turmeric oil,placebo gelatin microspheres and ZT-GMS at high or low dosage were infused into the proper hepatic artery.The results indicated that the rats treated with ZT-GMS had a significantly slower tumor growth(P<0.01)and longer survival(P<0.01)as compared with the four other groups.It is suggested that the tumoricidal effect of arterial chemoembolization with ZT-GMS is superior to arterial chemotherapy or embolizaton alone in the treatment of the liver cancer.
, http://www.100md.com
Key words zedoary turmeric oil;gelatin microspheres;hepatic arterial embolization;tumor growth inhibition percent;prolongation percent of life
正常肝脏25%～30%的血液供应来自肝动脉，70%～75%来自门静脉，大多数肝癌表现为多血供，且肝癌血供中90%～99%来自肝动脉〔1〕，因此栓塞肝动脉能有效治疗肝癌，特别是对于不能手术的患者已成为首选疗法之一.作者从祖国传统医学的角度出发，将具有抗癌作用的中药莪术根茎中的挥发油莪术油制备成莪术油明胶微球(ZT-GMS)，为了研究其治疗优越性，建立了大鼠移植性肝癌模型，并对肝动脉灌注空白明胶微球、莪术油明胶微球及莪术油对大鼠移植性肝癌的抗癌活性进行了比较研究.
1 实验材料
莪术油明胶微球(莪术油含量不低于8%，粒径分布50～150 μm，沈阳药科大学)；空白明胶微球(粒径分布50～150 μm，沈阳药科大学)；1%莪术油注射液(广东省中医院制剂室)；3%戊巴比妥钠、75%乙醇等(广东省中医院中心实验室)；雄性Wistar大鼠(体重100～120 g，上海医药工业研究院提供)；Walker-256瘤株(上海医药工业研究院提供).
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2 实验方法
2.1 大鼠移植性肝癌模型建立的方法〔2〕
将皮下荷瘤大鼠断颈处死后，局部消毒，取皮下瘤块，拨去纤维组织，挑选无出血、无坏死肿瘤组织，用利刀片切成0.2 mm3大小的小块备用.另取Wistar大鼠，以戊巴比妥钠按40 mg/kg腹腔注射麻醉，取仰卧位，四肢固定于手术板上后，手术区用75%酒精消毒后，在腹正中切开皮肤10 mm左右，用显微组织镊子将肝包膜戳一小口，将肿瘤块沿隧道嵌入.移植完毕后逐层缝合腹壁，饲养待用，整个过程在无菌条件下进行.
2.2 治疗方法
动脉插管参照Lindell等〔3〕的方法肝脏接种瘤块后第7 d，大鼠腹腔麻醉后固定，再次剖腹(开口约2～3 cm)，暴露肝脏，测量肿瘤表面最大径(a)和最小径(b)，分离胃十二指肠动脉、肝动脉及肝固有动脉，结扎胃十二指肠动脉的远端.以银夹暂时阻断肝总动脉，于手术显微镜下在胃十二指肠动脉上切一小口，由此将外径约0.3 mm的特制导管上行插入肝固有动脉.待回血后，按以下分组及剂量(表1)分别灌注相应制剂.灌注后拔管、结扎胃十二指肠动脉近端，放开肝总动脉上的银夹，逐层缝合切口后擦净伤口、外涂金霉素软膏，分笼恒温、自动供水供食饲养.
, 百拇医药
Tab.1 The groups and dosages of the therapy Group No
Dosage
A Normal Saline
0.2～0.3 mL/kg
B 1% Zedoary turmeric oil
10 mg/kg
C Vacant gelation microspheres
10 mg/kg
D ZT-GMS(low dosage)
, http://www.100md.com 5 mg/kg
E ZT-GMS(high dosage)
10 mg/kg
C,D,E were suspended in 0.5% CMC-Na
3 实验结果
3.1 肿瘤生长率
每组部分大鼠于治疗后第7 d处死，再次测量肿瘤的最大径(a)和最小径(b)，按公式计算肿瘤体积：V=ab2/2，再根据治疗前后的肿瘤体积计算肿瘤生长率(GR):GR=(治疗后的肿瘤体积/治疗前的肿瘤体积).
5组大鼠灌注前后的肿瘤体积及肿瘤生长率方差分析结果见表2.治疗前各组肿瘤体积之间均无显著性差异(P>0.01).肝动脉灌注生理盐水后(A)，所有大鼠的肿瘤均明显增大，平均肿瘤体积显著大于灌注前(P<0.01)；灌注常规剂型莪术油(B)和空白明胶微球(C)后，肿瘤体积较治疗前亦明显增大(P<0.01)，但肿瘤生长率低于对照组(A)(P<0.01)；灌注低剂量莪术油明胶微球后，肿瘤体积较治疗前亦明显增大(P<0.01)，但肿瘤生长率显著低于对照组(P<0.01)；而灌注高剂量莪术油明胶微球后有3只大鼠肿瘤增大，4只大鼠肿瘤无明显改变，余3只大鼠肿瘤均有不同程度的缩小，治疗前后平均肿瘤体积无显著差异(P>0.01)，肿瘤生长率显著低于其它各组(P<0.01).
, 百拇医药
Tab.2 The volume and the average growth rate of tumor after arterial infusion(
±s)
n
Tumor volume/cm3
Pa
Tumor growth
rate
Tumor growth
inhibit percent
, 百拇医药 /%
Pb
Before infusion
After infusion
A
10
0.059±0.022
1.01±0.47
<0.01
22.43±
17.80
—
, 百拇医药
—
B
10
0.065±0.020
0.67±0.16
<0.01
10.79±
4.47
51.87
<0.1
C
10
0.065±0.020
, http://www.100md.com
0.72±0.15
<0.01
11.52±
3.94
48.64
<0.1
D
10
0.079±0.022
0.36±0.08
<0.01
4.85±
1.47
, http://www.100md.com
78.35
<0.01
E
10
0.062±0.016
0.074±0.034
>0.01
1.22±
0.65
94.5
<0.01
a—Comparison between before therapy and after therapy;b—Compared with A;In addition,E compred with B,C and D,P<0.01；D compared with B,C,P<0.013.2 生存时间
, 百拇医药
每组其余大鼠治疗后在相同条件下续养，观察其生存天数，并计算治疗组大鼠的生命延长率(治疗组平均生存天数/对照组平均生存天数-1)×100%.
各组其余大鼠动脉灌注后生存时间见表3.经方差分析，大鼠灌注高剂量莪术油明胶微球(E)、低剂量明胶微球(D)的平均生存时间均显著长于其它组(A、B、C)(P>0.01)，但这两组间无显著性差异(P>0.01)；大鼠灌注莪术油(B)、空白微球(C)的平均生存时间明显大于对照组(A)(P<0.05)，但这两组间也无显著性差异(P>0.01).
Tab.3 The living days of the rats after arterial infusion(±s) group
n
Living days/d
, 百拇医药
P*
Prolongation percent of life/%
A
10
11.70±1.88
——
——
B
10
14.80±3.36
<0.05
26.49
, 百拇医药
C
10
14.00±2.58
<0.05
19.65
D
10
22.70±3.91
<0.01
94.0
E
10
25.50±3.89
, 百拇医药
<0.01
117.9
*Compared with A;In addition,E compared with B and C,P<0.01;E compared with D,P>0.01；D compared with B and C,P<0.01；B compared with C,P<0.05 其它两次相同条件下的实验结果与上述实验结果，经统计学检验，三者间无显著性差异(P>0.01).
4 讨论
a.莪术油的体外实验〔4〕表明，它能直接抑制破坏多种癌细胞，包括体外培养的人体肝癌细胞；影响癌细胞的核酸代谢；调节并促进机体免疫反应；增强主动免疫保护效应.因此肝动脉灌注莪术油使癌变处药物浓度远比全身给药时高，能起到一定的疗效，但直接灌注莪术油难以维持肿瘤组织内药物的持久性高浓度，对肿瘤的治疗作用较短暂.
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b.肝动脉栓塞的关键在于栓塞物质进入末梢血管，有效的阻断血流，造成局部组织缺血、缺氧，血管通透性增加，使药物从微球中缓慢释放，渗入到组织中.微球的栓塞作用也与所选的载体材料以及药物有关〔5〕.亲水凝胶型的微球进入血管后，对水是渗透的，易形成血栓，因此除了机械栓塞外，还有血栓的作用，从而达到长效栓塞的作用.此外，凝胶表面多孔结构和其它特性使其对血细胞敏感，血细胞易粘附到微球上或是进入微球内.在这种情况下，血小板的海绵状吸附使栓塞物的粒径和机械强度均得以提高，这对栓塞特别有利.细胞的再克隆和栓塞物能否长久地吸附到血管腔也都依赖于凝胶的网状大孔，但该类型的微球往往是易造成近端栓塞，易形成侧枝循环.而惰性材料微球不具有以上优点，而且由于它栓塞后导致血压升高，血管壁弹性增大使其还有一致命的缺点，即远程栓塞.因此，我们选用亲水性材料明胶作为基质.全身给药有效的药物不一定适用于化疗栓塞.栓塞后导致靶器官缺血、pH值下降、氧压减少、能量降低，这就要求药物在这些情况下仍然具有活性.此外，药物须与载体有一定的亲和力，能有效阻止突释，与体内的环境相容，因为在栓塞的情况下，会引起微观生理环境以及药物吸收代谢的变化.目前，肝动脉化疗栓塞的首选化疗药物为丝裂霉素C，顺铂，就是因为它们能符合以上要求.莪术油中含有多种有效成分，它们之间的协同作用使其在缺血、缺氧的情况下，仍具有抗癌活性.ZT-GMS的抗癌活性与以上两点有关.
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基金项目：国家中医药局“九五”攻关项目部分内容，项目号：96-90607-04
参考文献
1 Starkhammer H.On the effect of degradable starch microspheres in intra-arterial Chemotherapy.Linkping University,1987，9～10
2 陈庆华.肝动脉栓塞微球对移植性肝癌大鼠疗效的实验研究.介入放射学杂志，1994，3(2)：93～95
3 Lindell B,Aronson KF,Nosslin B,et al. Repeated arterial embolization of rat liver by degradable microspheres.Eur Sur Res,1988，9：347～352
4 刘军怡.防治肿瘤的中药—莪术.中草药，1996，27(9)：572～574
5 Jonkmande Vries J D,Flora KP,Bult A.Pharmaceutical development of anticancer agents for parental use-a review.Drug Dev Ind Pharm.1996，22(6)：484～486
收稿日期:1999-10-11
, http://www.100md.com
单位：陈济民 邓嵘(沈阳药科大学药学系，沈阳 110015)
关键词：莪术油；明胶微球；肝动脉栓塞；肿瘤生长抑制率；生命延长率
沈阳药科大学学报000314 摘 要 建立了大鼠移植性肝癌模型，对肝动脉栓塞用莪术油明胶微球的抗癌活性进行研究，结果表明莪术油明胶微球经肝动脉灌注对大鼠移植性肝癌有较好的疗效，大鼠平均肿瘤生长抑制率为94.5%，平均生命延长率为117.9%，与对照组相比能显著性抑制肿瘤生长(P<0.01)和延长大鼠生存时间(P<0.01).
分类号 R96
The Anti-tumor Activity of Zedoary Turmeric Oil Gelatin Microspheres for Heparical Arterial Embolization
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Deng Rong,Chen Jimin,Wu Wanyin
Department of Pharmacy,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015
Abstract The anti-tumor activity of zedoary turmeric oil gelatin microspheres(ZT-GMS)was studied in Wistar rats bearing transplantable hepatocelluar cancer.Seven days after inoculation into the rats′livers,normal saline,conventional zedoary turmeric oil,placebo gelatin microspheres and ZT-GMS at high or low dosage were infused into the proper hepatic artery.The results indicated that the rats treated with ZT-GMS had a significantly slower tumor growth(P<0.01)and longer survival(P<0.01)as compared with the four other groups.It is suggested that the tumoricidal effect of arterial chemoembolization with ZT-GMS is superior to arterial chemotherapy or embolizaton alone in the treatment of the liver cancer.
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Key words zedoary turmeric oil;gelatin microspheres;hepatic arterial embolization;tumor growth inhibition percent;prolongation percent of life
正常肝脏25%～30%的血液供应来自肝动脉，70%～75%来自门静脉，大多数肝癌表现为多血供，且肝癌血供中90%～99%来自肝动脉〔1〕，因此栓塞肝动脉能有效治疗肝癌，特别是对于不能手术的患者已成为首选疗法之一.作者从祖国传统医学的角度出发，将具有抗癌作用的中药莪术根茎中的挥发油莪术油制备成莪术油明胶微球(ZT-GMS)，为了研究其治疗优越性，建立了大鼠移植性肝癌模型，并对肝动脉灌注空白明胶微球、莪术油明胶微球及莪术油对大鼠移植性肝癌的抗癌活性进行了比较研究.
1 实验材料
莪术油明胶微球(莪术油含量不低于8%，粒径分布50～150 μm，沈阳药科大学)；空白明胶微球(粒径分布50～150 μm，沈阳药科大学)；1%莪术油注射液(广东省中医院制剂室)；3%戊巴比妥钠、75%乙醇等(广东省中医院中心实验室)；雄性Wistar大鼠(体重100～120 g，上海医药工业研究院提供)；Walker-256瘤株(上海医药工业研究院提供).
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2 实验方法
2.1 大鼠移植性肝癌模型建立的方法〔2〕
将皮下荷瘤大鼠断颈处死后，局部消毒，取皮下瘤块，拨去纤维组织，挑选无出血、无坏死肿瘤组织，用利刀片切成0.2 mm3大小的小块备用.另取Wistar大鼠，以戊巴比妥钠按40 mg/kg腹腔注射麻醉，取仰卧位，四肢固定于手术板上后，手术区用75%酒精消毒后，在腹正中切开皮肤10 mm左右，用显微组织镊子将肝包膜戳一小口，将肿瘤块沿隧道嵌入.移植完毕后逐层缝合腹壁，饲养待用，整个过程在无菌条件下进行.
2.2 治疗方法
动脉插管参照Lindell等〔3〕的方法肝脏接种瘤块后第7 d，大鼠腹腔麻醉后固定，再次剖腹(开口约2～3 cm)，暴露肝脏，测量肿瘤表面最大径(a)和最小径(b)，分离胃十二指肠动脉、肝动脉及肝固有动脉，结扎胃十二指肠动脉的远端.以银夹暂时阻断肝总动脉，于手术显微镜下在胃十二指肠动脉上切一小口，由此将外径约0.3 mm的特制导管上行插入肝固有动脉.待回血后，按以下分组及剂量(表1)分别灌注相应制剂.灌注后拔管、结扎胃十二指肠动脉近端，放开肝总动脉上的银夹，逐层缝合切口后擦净伤口、外涂金霉素软膏，分笼恒温、自动供水供食饲养.
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Tab.1 The groups and dosages of the therapy Group No
Dosage
A Normal Saline
0.2～0.3 mL/kg
B 1% Zedoary turmeric oil
10 mg/kg
C Vacant gelation microspheres
10 mg/kg
D ZT-GMS(low dosage)
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E ZT-GMS(high dosage)
10 mg/kg
C,D,E were suspended in 0.5% CMC-Na
3 实验结果
3.1 肿瘤生长率
每组部分大鼠于治疗后第7 d处死，再次测量肿瘤的最大径(a)和最小径(b)，按公式计算肿瘤体积：V=ab2/2，再根据治疗前后的肿瘤体积计算肿瘤生长率(GR):GR=(治疗后的肿瘤体积/治疗前的肿瘤体积).
5组大鼠灌注前后的肿瘤体积及肿瘤生长率方差分析结果见表2.治疗前各组肿瘤体积之间均无显著性差异(P>0.01).肝动脉灌注生理盐水后(A)，所有大鼠的肿瘤均明显增大，平均肿瘤体积显著大于灌注前(P<0.01)；灌注常规剂型莪术油(B)和空白明胶微球(C)后，肿瘤体积较治疗前亦明显增大(P<0.01)，但肿瘤生长率低于对照组(A)(P<0.01)；灌注低剂量莪术油明胶微球后，肿瘤体积较治疗前亦明显增大(P<0.01)，但肿瘤生长率显著低于对照组(P<0.01)；而灌注高剂量莪术油明胶微球后有3只大鼠肿瘤增大，4只大鼠肿瘤无明显改变，余3只大鼠肿瘤均有不同程度的缩小，治疗前后平均肿瘤体积无显著差异(P>0.01)，肿瘤生长率显著低于其它各组(P<0.01).
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Tab.2 The volume and the average growth rate of tumor after arterial infusion(
±s)n
Tumor volume/cm3
Pa
Tumor growth
rate
Tumor growth
inhibit percent
, 百拇医药 /%
Pb
Before infusion
After infusion
A
10
0.059±0.022
1.01±0.47
<0.01
22.43±
17.80
—
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—
B
10
0.065±0.020
0.67±0.16
<0.01
10.79±
4.47
51.87
<0.1
C
10
0.065±0.020
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0.72±0.15
<0.01
11.52±
3.94
48.64
<0.1
D
10
0.079±0.022
0.36±0.08
<0.01
4.85±
1.47
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78.35
<0.01
E
10
0.062±0.016
0.074±0.034
>0.01
1.22±
0.65
94.5
<0.01
a—Comparison between before therapy and after therapy;b—Compared with A;In addition,E compred with B,C and D,P<0.01；D compared with B,C,P<0.013.2 生存时间
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每组其余大鼠治疗后在相同条件下续养，观察其生存天数，并计算治疗组大鼠的生命延长率(治疗组平均生存天数/对照组平均生存天数-1)×100%.
各组其余大鼠动脉灌注后生存时间见表3.经方差分析，大鼠灌注高剂量莪术油明胶微球(E)、低剂量明胶微球(D)的平均生存时间均显著长于其它组(A、B、C)(P>0.01)，但这两组间无显著性差异(P>0.01)；大鼠灌注莪术油(B)、空白微球(C)的平均生存时间明显大于对照组(A)(P<0.05)，但这两组间也无显著性差异(P>0.01).
Tab.3 The living days of the rats after arterial infusion(
±s) groupn
Living days/d
, 百拇医药
P*
Prolongation percent of life/%
A
10
11.70±1.88
——
——
B
10
14.80±3.36
<0.05
26.49
, 百拇医药
C
10
14.00±2.58
<0.05
19.65
D
10
22.70±3.91
<0.01
94.0
E
10
25.50±3.89
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<0.01
117.9
*Compared with A;In addition,E compared with B and C,P<0.01;E compared with D,P>0.01；D compared with B and C,P<0.01；B compared with C,P<0.05 其它两次相同条件下的实验结果与上述实验结果，经统计学检验，三者间无显著性差异(P>0.01).
4 讨论
a.莪术油的体外实验〔4〕表明，它能直接抑制破坏多种癌细胞，包括体外培养的人体肝癌细胞；影响癌细胞的核酸代谢；调节并促进机体免疫反应；增强主动免疫保护效应.因此肝动脉灌注莪术油使癌变处药物浓度远比全身给药时高，能起到一定的疗效，但直接灌注莪术油难以维持肿瘤组织内药物的持久性高浓度，对肿瘤的治疗作用较短暂.
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b.肝动脉栓塞的关键在于栓塞物质进入末梢血管，有效的阻断血流，造成局部组织缺血、缺氧，血管通透性增加，使药物从微球中缓慢释放，渗入到组织中.微球的栓塞作用也与所选的载体材料以及药物有关〔5〕.亲水凝胶型的微球进入血管后，对水是渗透的，易形成血栓，因此除了机械栓塞外，还有血栓的作用，从而达到长效栓塞的作用.此外，凝胶表面多孔结构和其它特性使其对血细胞敏感，血细胞易粘附到微球上或是进入微球内.在这种情况下，血小板的海绵状吸附使栓塞物的粒径和机械强度均得以提高，这对栓塞特别有利.细胞的再克隆和栓塞物能否长久地吸附到血管腔也都依赖于凝胶的网状大孔，但该类型的微球往往是易造成近端栓塞，易形成侧枝循环.而惰性材料微球不具有以上优点，而且由于它栓塞后导致血压升高，血管壁弹性增大使其还有一致命的缺点，即远程栓塞.因此，我们选用亲水性材料明胶作为基质.全身给药有效的药物不一定适用于化疗栓塞.栓塞后导致靶器官缺血、pH值下降、氧压减少、能量降低，这就要求药物在这些情况下仍然具有活性.此外，药物须与载体有一定的亲和力，能有效阻止突释，与体内的环境相容，因为在栓塞的情况下，会引起微观生理环境以及药物吸收代谢的变化.目前，肝动脉化疗栓塞的首选化疗药物为丝裂霉素C，顺铂，就是因为它们能符合以上要求.莪术油中含有多种有效成分，它们之间的协同作用使其在缺血、缺氧的情况下，仍具有抗癌活性.ZT-GMS的抗癌活性与以上两点有关.
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基金项目：国家中医药局“九五”攻关项目部分内容，项目号：96-90607-04
参考文献
1 Starkhammer H.On the effect of degradable starch microspheres in intra-arterial Chemotherapy.Linkping University,1987，9～10
2 陈庆华.肝动脉栓塞微球对移植性肝癌大鼠疗效的实验研究.介入放射学杂志，1994，3(2)：93～95
3 Lindell B,Aronson KF,Nosslin B,et al. Repeated arterial embolization of rat liver by degradable microspheres.Eur Sur Res,1988，9：347～352
4 刘军怡.防治肿瘤的中药—莪术.中草药，1996，27(9)：572～574
5 Jonkmande Vries J D,Flora KP,Bult A.Pharmaceutical development of anticancer agents for parental use-a review.Drug Dev Ind Pharm.1996，22(6)：484～486
收稿日期:1999-10-11
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