TTV感染成年树鼠句的初步研究
作者：谢志春 周元平 吴继周 高伟志 胡慧宁 张杰
单位：谢志春(广西医科大学公共卫生学院 南宁530021)；胡慧宁(广西医科大学公共卫生学院 南宁530021)；张杰(广西医科大学公共卫生学院 南宁530021)；周元平(中山医科大学第三附属医院传染科)；吴继周(广西医科大学第一附属医院)；高伟志(广西壮族自治区岑溪市卫生局)
关键词：TTV树鼠句
广西预防医学000302
[摘要] 目的探讨树鼠句对TTV的易感性。方法通过股静脉将TTV接种于树鼠句并设对照组。用PCR技术检测血清及肝组织中TTVDNA，并用全自动分析仪进行DNA序列分析。结果在4只接种了TTV的树鼠句中，2只(50%)血清ALT异常升高，肝组织有炎症表现，同时血清及肝组织均检出TTV-DNA，这些检出物的序列与接种物TTV完全一致。结论树鼠句对TTV是敏感的,有望建成TTV感染的树鼠句动物模型。
, 百拇医药
中图分类号：R512.6+02 文献标识码：A 文章编号：1007-158X(2000)03-0133-03
Experimental infection of TT- virus in adult tree shrews.
XIE Zhichun, ZHOU Yuanping,WU Jizhou,et al.Faculty of Public Health,Guangxi
Medical University, Nanning 530021
[Abstract] Objective To investigate the susceptibility of tree shrew to TT_virus (TTV) infection. Method Tree shrews were intravenously inoculated with TT_virus and control was also established with normal human serum injection. By PCR,the serum and liver tissue samples were examined for the presence of TTV DNA.Results In two of four animals inoculated with TTV, not only ALT elevation and inflammatory change were observed in their serum and liver, but also the sequence of TTVDNA in tree shrews was completely the same as that in the innoculum used in this study. Conclusion Tree shrew is susceptible to TTV.
, http://www.100md.com
[Key words] TT_virus Tree shrew
至目前为止，仍有相当一部分肝炎患者病因不明，用已知的病原学检测方法查不出任何病毒感染标志，现将他们称为非甲-非庚型肝炎(hepatitisnonAtoG)。1997年12月，日本学者Nishizawa等在一例非甲-非庚型肝炎中分离出一种新型肝炎病毒，称为输血相关病毒(TTV)，TT也刚好是那名患者的名字缩写[1]。有关其致病性，分子生物学特征等目前尚不十分清楚[2,3]。很显然，动物模型对研究TTV的致病性、致病机理及可能的防治措施都是非常有用的。遗憾的是，目前国内外均尚未发现一种理想的动物可用于TTV的研究。已知树鼠句是一种低等灵长类动物，它可感染人类甲型、乙型、丁型肝炎病毒及人类单纯疱疹病毒和轮状病毒[4～9]，我们在刚完成的研究里也证实树鼠句可以感染丙型肝炎病毒[10]。既然树鼠句对这么多的人类肝炎病毒易感，或许对TTV也是易感的，为了探讨这个问题，我们进行了本研究。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1接种方法从一名在广西医科大学第一附院传染科住院确诊为TTV感染的黄疸肝炎患者取静脉血10ml，分离血清作为接种物。该患者甲、乙、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒感染指标全阴性，但TTVDNA强阳性，谷丙转氨酶(ALT)150单位(赖氏法)。取4只购自昆明动物研究所的成年树鼠句(雌、雄各半，体重130～151g)作实验组，经股静脉每只动物接种TTV血清0.5ml，另取1只树鼠句作对照组，注射正常人血清0.5ml。
1.2标本采集所有5只动物接种前均采血及取活体肝组织，动物接种后每隔1～3周取血1次，当发现血清TTVDNA阳性时，再对所有动物取活体肝组织一次。血清保存在-20℃待检，肝组织分2份，2份经10%福尔马林固定，石蜡包埋用于组织学观察，另1份保存于液氮，用于PCR检测。
1.3ALT检测采用赖氏法，所用试剂盒由上海荣盛生物技术有限公司提供。
1.4套式PCR检测TTVDNA用中山医科大学第三附院传染病研究室建立的方法，即50μl血清用5μl蛋白酶K裂解液在55℃裂解30分钟，之后98℃灭活15分钟，12000rpm离心5分钟，取5μl上清液进行第1次PCR扩增，所用引物为5′GCAGCAGCATATGGATATGT3′和5′TGACTGTGCTAAAGCCTCTA3′，反应体积为30μl，PCR反应条件为94℃变性40秒，55℃退火40秒，72℃延伸60秒，35循环后再72℃延伸7分钟。取5μl反应产物进行第2次PCR扩增，所用引物为TTV3(5′CATACACATGAATGCCAGGC3′)和TTV4(5′GTACTTCTTGCTGGTGAAAT3′)，扩增程序同第1次PCR，最后PCR扩增产物长度为197bp。
, 百拇医药
检测肝组织的TTVDNA时，先将10克肝组织在清洁的玻璃匀浆器内制成匀浆，然后用蛋白酶K消化，12000rpm离心10分钟，上清液用酚-氯仿(1:1)抽提，无水乙醇-70℃沉淀DNA，然后用20μl蒸馏水溶解后进行PCR扩增，扩增程序同血清检测。
1.5TTVDNA测序将第2次PCR产物点样于1%低融点琼脂糖凝胶，经电泳及随后的克隆提取、纯化后送中山医科大学达安基因诊断中心，用3700型DNA测序仪(美国PE公司生产)进行DNA测序。
2 结果
2.1生化检查所有动物接种前ALT均处于正常水平(2～20单位)。实验组2只(1号和2号)接种后第39天出现ALT异常升高，第54天达到最高峰(130单位)。另外2只动物和对照组动物ALT一直处于正常水平，最高值仅28单位。
2.2病理检查对所有动物于接种前及接种后第63天均取肝组织进行了病理检查，发现实验组的1号和2号2只动物在接种TTV后肝组织出现较明显的肝细胞混浊、肿胀及炎症细胞浸润，另2只动物及对照组动物未见异常。
, 百拇医药
2.3TTVDNA检出情况实验组的2只动物(50%)在接种后第54、60和109天血清中检出TTVDNA(见表1)，为了确证这两只树鼠句的TTV感染，于接种后的第63天对所有5只树鼠句剖腹取肝组织，用盲法对肝组织进行PCR检测，结果在1号和2号树鼠句肝组织中检出强阳性TTVDNA。
2.4DNA测序结果上述树鼠句血清及肝组织中所检出的TTVDNA，在经全自动DNA序列分析仪分析后发现其所含核苷酸序列与原接种物完全一致。
表1 树鼠句血清TTVDNA检出情况
接种后天数
组别
动物号
0
13
, http://www.100md.com
39
54
60
88
109
1
-
-
-
+
+
-
+
2
, 百拇医药
-
-
-
+
+
-
-
实验组
3
-
-
-
-
-
, 百拇医药
-
-
4
-
-
-
-
-
-
-
对照组
5
-
-
, 百拇医药
-
-
-
-
-
3 讨论
本次研究发现，2/4树鼠句在接种TTV后不仅血清ALT升高及肝组织有病理炎症改变，而且血清及肝组织均检出TTVDNA，DNA测序也表明，PCR扩增产物是特异性的，排除了假阳性的可能。此外，在接种后的最先两次(第13,39天)血清中均未检出TTVDNA，表明在第54，60和109天所检出的血清TTV不是残留的接种物。肝脏和血清同时检出TTVDNA则更证明了树鼠句确已感染上TTV。另外2只实验树鼠句未检出TTVDNA可能有下面两种原因，一是由于动物的个体差异，这两只树鼠句的确对TTV不敏感，二是由于血清及肝组织中TTV浓度太低，用我们已建立的PCR方法无法检出。但无论如何，我们的这一发现为将来进一步建立和完善TTV的树鼠句动物模型提供了重要的科学根据。
, 百拇医药
广西自治区科委自然科学基金资助课题(桂科自9811002)
谢志春(1963-)，男，广西阳朔县人，医学硕士，副教授，主要从事病毒性肝炎的防治研究。
参考文献
1 NishizawaT,OkamotoH,KonishiK,etal.A novelDNAvirus(TTV)associatedwithelevat
edtransaminaselevelsinposttransfusionhep atitisofunknownetiology.BiochemBiophys
Rescommun,1997,241:92-95
2 CharltonM,AdjeiP,PoteruchaJ,etal.TT virusinfectioninNorthAmericanblooddonors,patientswithfulminanthepaticfailure,andcryp togeniccirrhosis.Hepatology,1998,28:839-842
, 百拇医药
3 NaoumovN,PetroraEP,ThomasMG,etal.PresenceofanewlydescribedhumanDNAvirus(TTV)
inpatientswithliverdisease.Lancet,1998,352:195-97
4 詹美云,刘崇柏,李成明,等.甲型肝炎病毒感染树鼠句初步研究.中国医学科学院学报,1981,3:
148-152
5 WalterE,KeistR,NiederostB,etal.Hepatitis Bvirusinfectionoftupaiahepatocytesinvitro
andinvivo.Hepatology,1996,24:1-5
, 百拇医药
6 YanRQ,SuJJ,HangDR,etal.Humanhepati tisBvirusandhepatocellularcarcinoma.I.Exp
erimentalinfectionoftreeshrewswithhepatitis Bvirus.JCancerResClinOncol,1996,122:283
-288
7 李奇芬,丁明权,王洪,等.树鼠句染丁型肝炎病毒的实验研究.中华医学杂志,1995,75:611-613
8 DaraiG,SchwaierA,KomtowskD,etal.Experimentalinfectionoftupaiabelangari(treeshrews)
withherpessimplexvirustypeⅠand Ⅱ.JInfectDis,1978,137:221-226
9 万新邦,刘玑昌,胥爱源,等.用人轮状病毒感染成年树鼠句实验性感染.中华医学杂志,1982,62:461-465
10 XieZC,RiezBojJI,LasarteJJ,etal.Transm issionofhepatitisCvirusinfectiontotree
shrews.Virology,1998,244:513-520
2000-03-20，2000-04-15修回, http://www.100md.com
单位：谢志春(广西医科大学公共卫生学院 南宁530021)；胡慧宁(广西医科大学公共卫生学院 南宁530021)；张杰(广西医科大学公共卫生学院 南宁530021)；周元平(中山医科大学第三附属医院传染科)；吴继周(广西医科大学第一附属医院)；高伟志(广西壮族自治区岑溪市卫生局)
关键词：TTV树鼠句
广西预防医学000302
[摘要] 目的探讨树鼠句对TTV的易感性。方法通过股静脉将TTV接种于树鼠句并设对照组。用PCR技术检测血清及肝组织中TTVDNA，并用全自动分析仪进行DNA序列分析。结果在4只接种了TTV的树鼠句中，2只(50%)血清ALT异常升高，肝组织有炎症表现，同时血清及肝组织均检出TTV-DNA，这些检出物的序列与接种物TTV完全一致。结论树鼠句对TTV是敏感的,有望建成TTV感染的树鼠句动物模型。
, 百拇医药
中图分类号：R512.6+02 文献标识码：A 文章编号：1007-158X(2000)03-0133-03
Experimental infection of TT- virus in adult tree shrews.
XIE Zhichun, ZHOU Yuanping,WU Jizhou,et al.Faculty of Public Health,Guangxi
Medical University, Nanning 530021
[Abstract] Objective To investigate the susceptibility of tree shrew to TT_virus (TTV) infection. Method Tree shrews were intravenously inoculated with TT_virus and control was also established with normal human serum injection. By PCR,the serum and liver tissue samples were examined for the presence of TTV DNA.Results In two of four animals inoculated with TTV, not only ALT elevation and inflammatory change were observed in their serum and liver, but also the sequence of TTVDNA in tree shrews was completely the same as that in the innoculum used in this study. Conclusion Tree shrew is susceptible to TTV.
, http://www.100md.com
[Key words] TT_virus Tree shrew
至目前为止，仍有相当一部分肝炎患者病因不明，用已知的病原学检测方法查不出任何病毒感染标志，现将他们称为非甲-非庚型肝炎(hepatitisnonAtoG)。1997年12月，日本学者Nishizawa等在一例非甲-非庚型肝炎中分离出一种新型肝炎病毒，称为输血相关病毒(TTV)，TT也刚好是那名患者的名字缩写[1]。有关其致病性，分子生物学特征等目前尚不十分清楚[2,3]。很显然，动物模型对研究TTV的致病性、致病机理及可能的防治措施都是非常有用的。遗憾的是，目前国内外均尚未发现一种理想的动物可用于TTV的研究。已知树鼠句是一种低等灵长类动物，它可感染人类甲型、乙型、丁型肝炎病毒及人类单纯疱疹病毒和轮状病毒[4～9]，我们在刚完成的研究里也证实树鼠句可以感染丙型肝炎病毒[10]。既然树鼠句对这么多的人类肝炎病毒易感，或许对TTV也是易感的，为了探讨这个问题，我们进行了本研究。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1接种方法从一名在广西医科大学第一附院传染科住院确诊为TTV感染的黄疸肝炎患者取静脉血10ml，分离血清作为接种物。该患者甲、乙、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒感染指标全阴性，但TTVDNA强阳性，谷丙转氨酶(ALT)150单位(赖氏法)。取4只购自昆明动物研究所的成年树鼠句(雌、雄各半，体重130～151g)作实验组，经股静脉每只动物接种TTV血清0.5ml，另取1只树鼠句作对照组，注射正常人血清0.5ml。
1.2标本采集所有5只动物接种前均采血及取活体肝组织，动物接种后每隔1～3周取血1次，当发现血清TTVDNA阳性时，再对所有动物取活体肝组织一次。血清保存在-20℃待检，肝组织分2份，2份经10%福尔马林固定，石蜡包埋用于组织学观察，另1份保存于液氮，用于PCR检测。
1.3ALT检测采用赖氏法，所用试剂盒由上海荣盛生物技术有限公司提供。
1.4套式PCR检测TTVDNA用中山医科大学第三附院传染病研究室建立的方法，即50μl血清用5μl蛋白酶K裂解液在55℃裂解30分钟，之后98℃灭活15分钟，12000rpm离心5分钟，取5μl上清液进行第1次PCR扩增，所用引物为5′GCAGCAGCATATGGATATGT3′和5′TGACTGTGCTAAAGCCTCTA3′，反应体积为30μl，PCR反应条件为94℃变性40秒，55℃退火40秒，72℃延伸60秒，35循环后再72℃延伸7分钟。取5μl反应产物进行第2次PCR扩增，所用引物为TTV3(5′CATACACATGAATGCCAGGC3′)和TTV4(5′GTACTTCTTGCTGGTGAAAT3′)，扩增程序同第1次PCR，最后PCR扩增产物长度为197bp。
, 百拇医药
检测肝组织的TTVDNA时，先将10克肝组织在清洁的玻璃匀浆器内制成匀浆，然后用蛋白酶K消化，12000rpm离心10分钟，上清液用酚-氯仿(1:1)抽提，无水乙醇-70℃沉淀DNA，然后用20μl蒸馏水溶解后进行PCR扩增，扩增程序同血清检测。
1.5TTVDNA测序将第2次PCR产物点样于1%低融点琼脂糖凝胶，经电泳及随后的克隆提取、纯化后送中山医科大学达安基因诊断中心，用3700型DNA测序仪(美国PE公司生产)进行DNA测序。
2 结果
2.1生化检查所有动物接种前ALT均处于正常水平(2～20单位)。实验组2只(1号和2号)接种后第39天出现ALT异常升高，第54天达到最高峰(130单位)。另外2只动物和对照组动物ALT一直处于正常水平，最高值仅28单位。
2.2病理检查对所有动物于接种前及接种后第63天均取肝组织进行了病理检查，发现实验组的1号和2号2只动物在接种TTV后肝组织出现较明显的肝细胞混浊、肿胀及炎症细胞浸润，另2只动物及对照组动物未见异常。
, 百拇医药
2.3TTVDNA检出情况实验组的2只动物(50%)在接种后第54、60和109天血清中检出TTVDNA(见表1)，为了确证这两只树鼠句的TTV感染，于接种后的第63天对所有5只树鼠句剖腹取肝组织，用盲法对肝组织进行PCR检测，结果在1号和2号树鼠句肝组织中检出强阳性TTVDNA。
2.4DNA测序结果上述树鼠句血清及肝组织中所检出的TTVDNA，在经全自动DNA序列分析仪分析后发现其所含核苷酸序列与原接种物完全一致。
表1 树鼠句血清TTVDNA检出情况
接种后天数
组别
动物号
0
13
, http://www.100md.com
39
54
60
88
109
1
-
-
-
+
+
-
+
2
, 百拇医药
-
-
-
+
+
-
-
实验组
3
-
-
-
-
-
, 百拇医药
-
-
4
-
-
-
-
-
-
-
对照组
5
-
-
, 百拇医药
-
-
-
-
-
3 讨论
本次研究发现，2/4树鼠句在接种TTV后不仅血清ALT升高及肝组织有病理炎症改变，而且血清及肝组织均检出TTVDNA，DNA测序也表明，PCR扩增产物是特异性的，排除了假阳性的可能。此外，在接种后的最先两次(第13,39天)血清中均未检出TTVDNA，表明在第54，60和109天所检出的血清TTV不是残留的接种物。肝脏和血清同时检出TTVDNA则更证明了树鼠句确已感染上TTV。另外2只实验树鼠句未检出TTVDNA可能有下面两种原因，一是由于动物的个体差异，这两只树鼠句的确对TTV不敏感，二是由于血清及肝组织中TTV浓度太低，用我们已建立的PCR方法无法检出。但无论如何，我们的这一发现为将来进一步建立和完善TTV的树鼠句动物模型提供了重要的科学根据。
, 百拇医药
广西自治区科委自然科学基金资助课题(桂科自9811002)
谢志春(1963-)，男，广西阳朔县人，医学硕士，副教授，主要从事病毒性肝炎的防治研究。
参考文献
1 NishizawaT,OkamotoH,KonishiK,etal.A novelDNAvirus(TTV)associatedwithelevat
edtransaminaselevelsinposttransfusionhep atitisofunknownetiology.BiochemBiophys
Rescommun,1997,241:92-95
2 CharltonM,AdjeiP,PoteruchaJ,etal.TT virusinfectioninNorthAmericanblooddonors,patientswithfulminanthepaticfailure,andcryp togeniccirrhosis.Hepatology,1998,28:839-842
, 百拇医药
3 NaoumovN,PetroraEP,ThomasMG,etal.PresenceofanewlydescribedhumanDNAvirus(TTV)
inpatientswithliverdisease.Lancet,1998,352:195-97
4 詹美云,刘崇柏,李成明,等.甲型肝炎病毒感染树鼠句初步研究.中国医学科学院学报,1981,3:
148-152
5 WalterE,KeistR,NiederostB,etal.Hepatitis Bvirusinfectionoftupaiahepatocytesinvitro
andinvivo.Hepatology,1996,24:1-5
, 百拇医药
6 YanRQ,SuJJ,HangDR,etal.Humanhepati tisBvirusandhepatocellularcarcinoma.I.Exp
erimentalinfectionoftreeshrewswithhepatitis Bvirus.JCancerResClinOncol,1996,122:283
-288
7 李奇芬,丁明权,王洪,等.树鼠句染丁型肝炎病毒的实验研究.中华医学杂志,1995,75:611-613
8 DaraiG,SchwaierA,KomtowskD,etal.Experimentalinfectionoftupaiabelangari(treeshrews)
withherpessimplexvirustypeⅠand Ⅱ.JInfectDis,1978,137:221-226
9 万新邦,刘玑昌,胥爱源,等.用人轮状病毒感染成年树鼠句实验性感染.中华医学杂志,1982,62:461-465
10 XieZC,RiezBojJI,LasarteJJ,etal.Transm issionofhepatitisCvirusinfectiontotree
shrews.Virology,1998,244:513-520
2000-03-20，2000-04-15修回, http://www.100md.com