两种细胞免疫功能测定方法的比较
作者:黄文成 朱波 王英 黄玲莎
单位:广西壮族自治区肿瘤防治研究所 530021
关键词:细胞免疫功能APAAP法S_P一步法
广西预防医学000312
[摘要]目的探讨细胞免疫功能测定的APAAP法和S_P一步法的准确性、可靠性及其简捷性。方法采用上述两法对30份标本进行检测。结果两法所得结果经方差分析无显著差异(P>0.05),但APAAP法耗时242分钟,S_P一步法仅耗时62分钟。结论S_P一步法较APAAP法更快速简捷,结果可靠程度和准确性更高。
中图分类号:R446.63 文献标识码:B 文章编号:1007-158X(2000)03-0158-03
本文把细胞免疫功能检测的两种方法:碱性磷酸酶—抗碱性磷酸酶(APAAP)法和链亲合素—过氧化物酶(S_P)一步法进行对比研究。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1标本来源30份标本取自防癌体检中的正常人,男、女各15份,年龄34~68岁。
1.2试剂APAAP法试剂盒由北京邦定生物医学公司提供;S_P一步法试剂盒由福建日通生命技术有限公司提供,均在有效期内使用。
1.3实验方法
1.3.1淋巴细胞分离取2ml经肝素抗凝的血,与2mlHank's液(PH7.2~7.4)轻轻混匀,将3ml稀释血轻移至装有2ml淋巴细胞分离液的干净试管中使其分层,2000转/分离心20分钟,吸取血浆和分离液之间的呈白色雾状的细胞层,即得淋巴细胞悬液。
1.3.2APAAP法将上述分离好的细胞悬液用0.01MPH7.2PBS液洗涤1次,取沉淀涂片干燥2小时以上,加抗T亚群单克隆抗体10μl,放湿盒30分钟,PBS洗涤3次,加羊抗鼠IgG10μl置室温30分钟,PBS洗涤3次,加APAAP复合物10μl置室温30分钟,PBS洗涤3次,加显色剂37℃30分钟PBS洗涤3次,复染2分钟,自来水洗,封片镜检计数200个细胞,计算阳性百分率。在高倍镜下观察,细胞核呈蓝色,细胞表面有红色标记物的细胞为阳性细胞,无红色标记物的细胞为阴性细胞。
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1.3.3S_P一步法将上述分离好的细胞悬液用2mlHank's液洗涤,1000转/分离心6分钟,洗2次,倾去上清液,加20%小牛血清Hank's液0.12ml配成淋巴细胞备用液,取干净小试管加入T亚群单克隆抗体12μl、B1试剂15μl、B2试剂18μl,加入淋巴细胞备用液32μl,轻轻摇匀,37℃水浴30分钟,加1mlHank's液洗涤1次,1000转/分离心5分钟弃上清,将剩余Hank's液轻轻吸干,加入预先配好的显色液50μl,37℃水浴10分钟,加0.5mlHank's液洗涤1次,1000转/分离心4分钟,弃上清,将沉淀摇匀滴片镜检。高倍镜下观察,阳性T细胞表现为周边胞膜呈棕红色颗粒或细胞周缘及中央均呈棕红色。周缘呈淡棕红色而无明显颗粒的细胞是弱阳性细胞,这类细胞计数时容易忽略。周缘无着色反应的细胞为阴性细胞,其体积略
小于阳性细胞。假阳性细胞主要包括粒细胞和红细胞,此类细胞不列入计数范围。粒细胞较阳性T细胞着色要深,胞体要大,细胞呈弥漫颗粒状;红细胞无核体积大,阳性较强且弥散整个细胞。计数200个T淋巴细胞,计取阳性T细胞的百分数。
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2 结果
2.1两种方法实验结果比较APAAP法及S_P一步法测得的CD3、CD4、CD8、CD4/CD8、CD16结果见表1。经方差分析两法相应结果比较无显著差异(P>0.05),见表1。
2.2两种方法所用时间的比较从表2可以知道,APAAP法耗时4个多小时,而S_P一步法只要1小时零几分钟便可以出报告。
2.3两种方法所得结果的观察比较在高倍镜下观察,由于APAAP法涂片固定等过程致使细胞比较集中,不方便观察,虽然阴性和阳性细胞较容易区别,但假阳性细胞(如红细胞,粒细胞等)却不能分辩出来。而S_P一步法除阴性和阳性细胞很容易区别外,而且假阳性细胞(主要是红细胞和粒细胞)与阳性淋巴细胞亦有明显的区别,弱阴性细胞也能识别出来。
表1 两种方法实验结果比较(±s) 方法
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样本量
CD3+
CD4+
CD8+
CD4+/CD8+
CD16+
APAAP法
30
72.4±6.0
45.8±5.5
, 百拇医药
28.5±4.0
1.8±0.4
21.3±4.5
S-P一步法
30
68.6±8.5*
43.3±8.0*
27.8±8.5*
1.6±0.6*
18.8±6.5*
3 讨论
, 百拇医药
T淋巴细胞和NK细胞是宿主抗肿瘤免疫反应中起主导作用的免疫活性细胞,反映机体细胞免疫功能。且T淋巴细胞是免疫调节的中心枢纽,McMichael认为Th与Ts细胞间的平衡是通过CD4与CD8细胞间的百分比表达出来,其比值下降表示患者处于免疫抑制状态[1]。目前研究发现,CD4细胞在协同杀伤肿瘤细胞中起重要作用,CD4细胞数下降可使肿瘤发生免疫逃逸[2,3]。
APAAP法与S_P一步法是细胞免疫功能检测常用的两种方法,与放免法相比,它们具有不需接触放射性物质、安全、设备简单、容易操作等优点,而且两法所得结果无显著差异(P>0.05),但APAAP法所需时间是S_P一步法的4倍,且APAAP法不能区别阳性细胞与假阳性细胞,由于操作过程相对复杂,APAAP法受影响因素多。而S_P一步法操作相对简单,耗时短,结果能清晰地区分阴性和阳性细胞、阳性细胞与假阳性细胞,其结果更具科学性和准确性。表2 APAAP法与S_P一步法所用时间的比较
APAAP法
, 百拇医药
S-P一步法
标本制作
涂片、干燥2小时以上或离心涂片固定
小试管内洗涤离心2次×6′
染色过程
一抗30′
一抗加二抗与S_P复合物
洗涤5′,二抗30′
37℃30′
洗涤5′,APAAP复合物30′
洗涤1次×5′
洗涤5′,显色25′
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显色10′
洗涤,复染2′
洗涤1次×5′
封片镜检计数
滴片计数
时间
242′
62′
在S-P一步法操作过程中,我们要注意以下事项:试管和玻片要保证洁净,Hank's液始终保持等渗状态,采用光学效果好的显微镜,滴加细胞悬液后用吸头适当抹平液滴以防弄湿显微镜镜头。
黄文成(1971-),男(壮),广西桂平市人,检验师,主要从事临床检验工作。
参考文献
1 张峻梅,张正伟,刘晓平,等.肺癌患者细胞免疫的改变及临床意义.四川肿瘤防治,1999,12(3):18
2 苏燎原,徐映东,耿勇志,等.淋巴细胞亚群与肿瘤免疫的初探.免疫学杂志,1992,8(4):251
3 傅体辉.肿瘤的免疫逃避机制.国外医学(肿瘤学分册),1990,17(6):366
1999-12-06收稿, 百拇医药
单位:广西壮族自治区肿瘤防治研究所 530021
关键词:细胞免疫功能APAAP法S_P一步法
广西预防医学000312
[摘要]目的探讨细胞免疫功能测定的APAAP法和S_P一步法的准确性、可靠性及其简捷性。方法采用上述两法对30份标本进行检测。结果两法所得结果经方差分析无显著差异(P>0.05),但APAAP法耗时242分钟,S_P一步法仅耗时62分钟。结论S_P一步法较APAAP法更快速简捷,结果可靠程度和准确性更高。
中图分类号:R446.63 文献标识码:B 文章编号:1007-158X(2000)03-0158-03
本文把细胞免疫功能检测的两种方法:碱性磷酸酶—抗碱性磷酸酶(APAAP)法和链亲合素—过氧化物酶(S_P)一步法进行对比研究。
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1 材料和方法
1.1标本来源30份标本取自防癌体检中的正常人,男、女各15份,年龄34~68岁。
1.2试剂APAAP法试剂盒由北京邦定生物医学公司提供;S_P一步法试剂盒由福建日通生命技术有限公司提供,均在有效期内使用。
1.3实验方法
1.3.1淋巴细胞分离取2ml经肝素抗凝的血,与2mlHank's液(PH7.2~7.4)轻轻混匀,将3ml稀释血轻移至装有2ml淋巴细胞分离液的干净试管中使其分层,2000转/分离心20分钟,吸取血浆和分离液之间的呈白色雾状的细胞层,即得淋巴细胞悬液。
1.3.2APAAP法将上述分离好的细胞悬液用0.01MPH7.2PBS液洗涤1次,取沉淀涂片干燥2小时以上,加抗T亚群单克隆抗体10μl,放湿盒30分钟,PBS洗涤3次,加羊抗鼠IgG10μl置室温30分钟,PBS洗涤3次,加APAAP复合物10μl置室温30分钟,PBS洗涤3次,加显色剂37℃30分钟PBS洗涤3次,复染2分钟,自来水洗,封片镜检计数200个细胞,计算阳性百分率。在高倍镜下观察,细胞核呈蓝色,细胞表面有红色标记物的细胞为阳性细胞,无红色标记物的细胞为阴性细胞。
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1.3.3S_P一步法将上述分离好的细胞悬液用2mlHank's液洗涤,1000转/分离心6分钟,洗2次,倾去上清液,加20%小牛血清Hank's液0.12ml配成淋巴细胞备用液,取干净小试管加入T亚群单克隆抗体12μl、B1试剂15μl、B2试剂18μl,加入淋巴细胞备用液32μl,轻轻摇匀,37℃水浴30分钟,加1mlHank's液洗涤1次,1000转/分离心5分钟弃上清,将剩余Hank's液轻轻吸干,加入预先配好的显色液50μl,37℃水浴10分钟,加0.5mlHank's液洗涤1次,1000转/分离心4分钟,弃上清,将沉淀摇匀滴片镜检。高倍镜下观察,阳性T细胞表现为周边胞膜呈棕红色颗粒或细胞周缘及中央均呈棕红色。周缘呈淡棕红色而无明显颗粒的细胞是弱阳性细胞,这类细胞计数时容易忽略。周缘无着色反应的细胞为阴性细胞,其体积略
小于阳性细胞。假阳性细胞主要包括粒细胞和红细胞,此类细胞不列入计数范围。粒细胞较阳性T细胞着色要深,胞体要大,细胞呈弥漫颗粒状;红细胞无核体积大,阳性较强且弥散整个细胞。计数200个T淋巴细胞,计取阳性T细胞的百分数。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1两种方法实验结果比较APAAP法及S_P一步法测得的CD3、CD4、CD8、CD4/CD8、CD16结果见表1。经方差分析两法相应结果比较无显著差异(P>0.05),见表1。
2.2两种方法所用时间的比较从表2可以知道,APAAP法耗时4个多小时,而S_P一步法只要1小时零几分钟便可以出报告。
2.3两种方法所得结果的观察比较在高倍镜下观察,由于APAAP法涂片固定等过程致使细胞比较集中,不方便观察,虽然阴性和阳性细胞较容易区别,但假阳性细胞(如红细胞,粒细胞等)却不能分辩出来。而S_P一步法除阴性和阳性细胞很容易区别外,而且假阳性细胞(主要是红细胞和粒细胞)与阳性淋巴细胞亦有明显的区别,弱阴性细胞也能识别出来。
表1 两种方法实验结果比较(±s) 方法
, http://www.100md.com
样本量
CD3+
CD4+
CD8+
CD4+/CD8+
CD16+
APAAP法
30
72.4±6.0
45.8±5.5
, 百拇医药
28.5±4.0
1.8±0.4
21.3±4.5
S-P一步法
30
68.6±8.5*
43.3±8.0*
27.8±8.5*
1.6±0.6*
18.8±6.5*
3 讨论
, 百拇医药
T淋巴细胞和NK细胞是宿主抗肿瘤免疫反应中起主导作用的免疫活性细胞,反映机体细胞免疫功能。且T淋巴细胞是免疫调节的中心枢纽,McMichael认为Th与Ts细胞间的平衡是通过CD4与CD8细胞间的百分比表达出来,其比值下降表示患者处于免疫抑制状态[1]。目前研究发现,CD4细胞在协同杀伤肿瘤细胞中起重要作用,CD4细胞数下降可使肿瘤发生免疫逃逸[2,3]。
APAAP法与S_P一步法是细胞免疫功能检测常用的两种方法,与放免法相比,它们具有不需接触放射性物质、安全、设备简单、容易操作等优点,而且两法所得结果无显著差异(P>0.05),但APAAP法所需时间是S_P一步法的4倍,且APAAP法不能区别阳性细胞与假阳性细胞,由于操作过程相对复杂,APAAP法受影响因素多。而S_P一步法操作相对简单,耗时短,结果能清晰地区分阴性和阳性细胞、阳性细胞与假阳性细胞,其结果更具科学性和准确性。表2 APAAP法与S_P一步法所用时间的比较
APAAP法
, 百拇医药
S-P一步法
标本制作
涂片、干燥2小时以上或离心涂片固定
小试管内洗涤离心2次×6′
染色过程
一抗30′
一抗加二抗与S_P复合物
洗涤5′,二抗30′
37℃30′
洗涤5′,APAAP复合物30′
洗涤1次×5′
洗涤5′,显色25′
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显色10′
洗涤,复染2′
洗涤1次×5′
封片镜检计数
滴片计数
时间
242′
62′
在S-P一步法操作过程中,我们要注意以下事项:试管和玻片要保证洁净,Hank's液始终保持等渗状态,采用光学效果好的显微镜,滴加细胞悬液后用吸头适当抹平液滴以防弄湿显微镜镜头。
黄文成(1971-),男(壮),广西桂平市人,检验师,主要从事临床检验工作。
参考文献
1 张峻梅,张正伟,刘晓平,等.肺癌患者细胞免疫的改变及临床意义.四川肿瘤防治,1999,12(3):18
2 苏燎原,徐映东,耿勇志,等.淋巴细胞亚群与肿瘤免疫的初探.免疫学杂志,1992,8(4):251
3 傅体辉.肿瘤的免疫逃避机制.国外医学(肿瘤学分册),1990,17(6):366
1999-12-06收稿, 百拇医药