紫外线诱导成纤维细胞凋亡时胞浆pH值的变化
作者：王振岳 刘斐球
单位：王振岳(第一军医大学南方医院烧伤科510515)；刘斐球(广州空军后勤部防疫队510620)
关键词：pH值；紫外线；细胞凋亡；成纤维细胞
广东医学000309
【摘要】 目的 研究紫外线(UVB)诱导成纤维细胞(NIH3T3)凋亡时胞浆pH值的变化。方法 利用粘附式细胞仪(ACAS-570)测定UVB诱导NIH3T3细胞凋亡时，胞浆pH值的变化。结果 NIH3T3细胞经UVB照射后，胞内pH值会逐渐升高，并在1.6 h左右达到最大值，25 min后恢复正常，在细胞内外钙被螯合后，不管UVB照射与否，胞内pH值无变化。结论 UVB照射导致细胞凋亡时，胞液呈碱性，pH值的变化参与了细胞凋亡的调控；细胞内外Ca2+水平影响胞浆pH值的变化，胞浆Ca2+与胞浆pH值的变化存在一定的相关关系。
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The changes of intracellular pH of apoptotic fibroblasts induced by UVB radiation
Wang Zhenyue， Liu Feiqiu.
(Department of burns,Nanfang Hospital, The First Military Medical University, Guangzhou 510515)
【Abstract】 Objective To explore the changes of intracellular pH in the apoptotic fibroblast (NIH3T3 cells) induced by UVB radiation. Methods By using adherent cell analysis and sorting (ACAS-570), the changes of intracellular pH were determinated while apoptosis was induced in NIH3T3 cells by UVB.Results The intracellular pH of the NIH3T3 cells radiated by UVB rose and reached the highest level after 1h and 35mins then returned to normal in 25mins. When extracellular and intracellular calcium were chelated,the intracellular pH of the NIH3T3 cell, radiated by UVB or not, had no changes. Conclusion The intracellular pH rises in the apoptotic NIH3T3 cells induced by UVB radiation. The changes of intracellular pH, affected by cytosol Ca2+ level, participate in the regulation of apoptosis. Regulation of apoptosis and were affected by the level of cytosol Ca2+. There is correlation between cytosol Ca2+ and intracellular pH.
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【Key words】 pH Ultraviolet rays Apoptosis Fibroblasts
实验表明，胞浆内pH值变化在细胞凋亡过程中起重要的作用，普遍认为细胞内pH值参与细胞凋亡的调控，但pH值的变化并不是恒定的。在不同细胞或同一种细胞(如HL-60)发生凋亡时，细胞内pH值也可以不同；反过来，胞浆呈酸性、中性或碱性都可以调节细胞凋亡。但是胞浆只有pH值的改变并不足以触发细胞凋亡[1]，我们知道，凋亡的显著生化特征是核酸内切酶的活化，切断DNA双链形成寡聚核小体片段 ，因此，不同pH值 的胞液通过为不同的核酸内切酶提供最合适的活化环境，从而来促进细胞凋亡[1]。 本实验以紫外线(UVB)照射为剌激因素，观察UVB在引起NIH3T3细胞凋亡时，胞内pH值如何变化以及NIH3T3细胞内外Ca2+浓度与胞浆pH值之间关系。
1 材料与方法
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1.1 细胞准备 将NIH3T3细胞用含10%小牛血清的RPMI 1640(美国Sigma公司)培养基稀释成106/ml，接种于改良Petri培养皿中，在37℃，5% CO2和饱和湿度下培养36 h备用。
1.2 细胞内pH值的测定 试剂配制：用二甲亚砜将Snafl-1-AM(美国Molecular probe公司)配成1 mmol/L储备液，分装冻存于-20℃中，染色前用不含血清、酚红的RPMI 1640将其稀释至10 μmol/L。吸去皿中培养基，将NIH3T3细胞以RPMI?1640(不含血清、酚红，下同)清洗3次，加入80 μl 10 μmol/L Snafl-1-AM， 避光置37℃ CO2孵育箱40 min，吸去染液，以RPMI 1640清洗3次，加入1.0 ml Hanks液。将培养皿置于粘附式细胞仪(ACAS-570，美国Meridian公司)载物台上，选定适当参数后进行细胞检测和荧光动态扫描。
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1.3 实验分组
1.3.1 细胞内外有钙时胞内pH值测定 设空白对照组和处理组(UVB照射10 min，光源距样品垂直距离为40 cm，下同)。按上法测pH值。
1.3.2 细胞内外钙被螯合后胞内pH值测定 设空白对照组和处理组。空白对照组为只加入10 μmol/L EGTA；处理组为先加10 μmol/L EGTA，荧光变化稳定后，再UVB照射10 min。按上法测pH值。
1.4 数据处理 数据经ACAS-570微机系统对图形及时间进行实时测量而获得。
2 结果
附图中的纵轴为检测到的细胞内荧光值，数值已经标准化，数值大小与pH值成正比。横轴为时间。
2.1 细胞在Hanks液环境下，UVB致胞内pH值变化 空白对照组，胞内荧光值在很小的范围内波动，如图1中虚线A所示;处理组，细胞经UVB照射后，胞内荧光值会逐渐升高，并在1.6 h左右达到最大值，25 min后恢复正常，如图1中实线B所示。
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图1 Hank,s液下UVB对细胞内荧光强度变化的影响
注：图中实线B上两根竖线为辐射起始、终止点
2.2 细胞内外钙被螯合后，UVB致胞内pH值的变化 空白对照组，胞内荧光值在很小范围内波动，如图2，表明无其他因素刺激下，胞内、外无钙时，胞内pH值呈中性;处理组，先加10 mM EGTA，螯合细胞内外钙[2]，荧光变化稳定后，再经UVB照射，可见基本不能引起胞内荧光值的升高，如图3。
图2 细胞内外钙被螯合后胞内荧光强度的变化
注：图中单根竖线表示荧光值稳定后开始动态观察点
3 讨论
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细胞内环境的稳定是维持细胞正常功能的必要条件，而酸碱平衡的调节则是内环境稳定的前提。细胞内pH值的调节是通过离子转运机制以及胞液强大的缓冲能力来完成的[3] ，这种离子转运机制包括：Na+/H+对流(antiport)、ATP驱动的H+泵以及几种碳酸氢盐交换器[1]，其中，Na+/H+对流在细胞调控pH值中起主要作用 。现在已经知道，细胞内有大量的参与各种新陈代谢的酶是pH值敏感性的，在pH值生理性范围内它们各自有最适宜酶活性的pH值。同样，在凋亡细胞内发生的一系列生化改变中，胞浆pH值的变化也占有重要的地位[3] 。凋亡显著的生化特征是核酸内切酶的活化，切断DNA双链形成寡聚核小体片段 ，而这些核酸内切酶也是pH值敏感性的[1]，不同种类的细胞所含的核酸内切酶种类、数量也不尽相同，有的细胞发生凋亡主要是由于中性、Ca2+/Mg2+依赖型核酸内切酶的活化而起作用 ；有的细胞发生凋亡主要是由于酸性核酸内切酶的活化而起作用[4，5]；也有的细胞发生凋亡主要是由于碱性核酸内切酶的活化而起作用[1，6]；甚至有同种细胞(如HL-60)在酸性环境[5，7] 和碱性环境[1，6]都能发生凋亡。
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图3 细胞内外钙被螯合后UVB对胞内荧光强度变化的影响
注：图中两根竖线为辐射起始、终止点
Martin等[8] 认为UVB辐射能诱发细胞凋亡，而且还认为凋亡是由于UVB直接作用于细胞膜启动了鞘磷脂循环途径分解生成神经酰胺，再由神经酰胺触发后续的一系列细胞反应。Haimovitz-Friedman等人也通过实验发现，UVB作用于细胞膜通过激活一种中性鞘磷脂酶分解鞘磷脂生成神经酰胺。这种中性鞘磷脂酶主要分布于原生质膜，而且是Mg2+依赖性，在pH值7～7.5环境中活性最大[9，10]。
本实验图1中示，UVB照射NIH3T3细胞在Hank,s液环境下诱导凋亡时，细胞胞浆呈碱性，说明NIH3T3细胞内pH值的变化(碱化)与凋亡有关，参与了凋亡的调控；它有可能是通过活化碱性核酸内切酶来消化DNA的；由于实验体系是在Hank,s液环境下(pH值约为7.4)，那么，我们推测如果UVB诱导的凋亡信号是通过神经酰胺作为第二信使传导的话，那么神经酰胺的生成是通过活化中性鞘磷脂酶分解鞘磷脂而来。
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实验图2,3中示， 在细胞内外钙被螯合后，不管UVB照射与否，胞内pH值无变化。表明NIH3T3细胞内Ca2+变化与pH值变化关系密切，胞内Ca2+水平影响胞浆pH值的变化。正如前面所述，胞内pH值主要靠离子转运机制来调控，而离子转运机制中Na+/H+对流起主要作用。有文献报道，当激素或生长因子与细胞内相应受体结合后，可激活蛋白激酶C，从而活化Na+/H+对流诱导细胞内碱化。而且还知道，电离辐射可引起细胞内结合水和溶解水的放射性分解，生成H+、过氧化氢、过氧化物自由基 ，这些氧化剂，如过氧化氢和过氧化物能诱导磷脂酶PLC激活，导致Ca2+动员和蛋白激酶C(PKC)激活 ，从而激活Na+/H+对流引起细胞内碱化。可见Ca2+变化与pH值变化是有联系的，而且Ca2+变化可能在pH值变化之前。
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本实验反映了UVB作用下，NIH3T3细胞内pH值的变化过程，揭示了胞内Ca2+变化与pH值的变化不是两个独立的现象，而是彼此间有联系的，胞浆pH值的变化可能参与了细胞凋亡的调控。
参考文献
[1]Zhu WH， Loh TT. Effects of Na+/H+ antiport and intracellular pH in the regulation of HL-60 cell apoptosis. Biochem Biophys Acta, 1995，1269(2):122
[2]Hess SD，Oortgiesen M，Cahalan MD，et al. Calcium oscillations in human tand natural killer cells depend upon membrane potential and calcium influx. J Immunol, 1993;150(7):2620
, 百拇医药
[3]Kroemer G，Petit P，Zamzami N， et al. The biochemistry of programmed cell death. FASEB J, 1995, 9(13):1277
[4]Barry MA， Eastman A. Identification of deoxyribonuclease as an endonuclease involved in apoptosis. Arch Biochem Biophys, 1993,300(1):440
[5]Barry MA,Reynolds JE, Eastman A, et al. Etoposide-induced apoptosis in human HL-60 cells is associated with intracellular acidification. Cancer Res, 1993,53(10 suppl):2349
, 百拇医药
[6]Matsubara K,Kubota M,Adachi S,et al.Different mode of cell death by calcium ionophore in human leukemia cell lines:possible role of constitutive endomuclease. Exp Cell Res, 1994,210(1):19
[7]Li J,Eastman A.Apoptosis in an interleukin-2-dependent cytotoxic T lymphocyte cell line is associated with intracellular acidification.Role of the Na+/H+-antiport. J Biol Chem, 1995,270(7):3203
[8]Martin SJ,Newmeyer DD,Mathias S, et al.Cell free reconstitution of fas, UV radiation and ceramide induced apoptosis. EMBO J, 1995,14(21):5191
[9]Spence MW. Sphingomyelinases. Adv Lip Res, 1993,26:3
[10]Chatterjee S. Neutral Sphingomyelinases. Adv Lip Res, 1993,26:25
(收稿日期：1999-11-22), http://www.100md.com
单位：王振岳(第一军医大学南方医院烧伤科510515)；刘斐球(广州空军后勤部防疫队510620)
关键词：pH值；紫外线；细胞凋亡；成纤维细胞
广东医学000309
【摘要】 目的 研究紫外线(UVB)诱导成纤维细胞(NIH3T3)凋亡时胞浆pH值的变化。方法 利用粘附式细胞仪(ACAS-570)测定UVB诱导NIH3T3细胞凋亡时，胞浆pH值的变化。结果 NIH3T3细胞经UVB照射后，胞内pH值会逐渐升高，并在1.6 h左右达到最大值，25 min后恢复正常，在细胞内外钙被螯合后，不管UVB照射与否，胞内pH值无变化。结论 UVB照射导致细胞凋亡时，胞液呈碱性，pH值的变化参与了细胞凋亡的调控；细胞内外Ca2+水平影响胞浆pH值的变化，胞浆Ca2+与胞浆pH值的变化存在一定的相关关系。
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The changes of intracellular pH of apoptotic fibroblasts induced by UVB radiation
Wang Zhenyue， Liu Feiqiu.
(Department of burns,Nanfang Hospital, The First Military Medical University, Guangzhou 510515)
【Abstract】 Objective To explore the changes of intracellular pH in the apoptotic fibroblast (NIH3T3 cells) induced by UVB radiation. Methods By using adherent cell analysis and sorting (ACAS-570), the changes of intracellular pH were determinated while apoptosis was induced in NIH3T3 cells by UVB.Results The intracellular pH of the NIH3T3 cells radiated by UVB rose and reached the highest level after 1h and 35mins then returned to normal in 25mins. When extracellular and intracellular calcium were chelated,the intracellular pH of the NIH3T3 cell, radiated by UVB or not, had no changes. Conclusion The intracellular pH rises in the apoptotic NIH3T3 cells induced by UVB radiation. The changes of intracellular pH, affected by cytosol Ca2+ level, participate in the regulation of apoptosis. Regulation of apoptosis and were affected by the level of cytosol Ca2+. There is correlation between cytosol Ca2+ and intracellular pH.
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【Key words】 pH Ultraviolet rays Apoptosis Fibroblasts
实验表明，胞浆内pH值变化在细胞凋亡过程中起重要的作用，普遍认为细胞内pH值参与细胞凋亡的调控，但pH值的变化并不是恒定的。在不同细胞或同一种细胞(如HL-60)发生凋亡时，细胞内pH值也可以不同；反过来，胞浆呈酸性、中性或碱性都可以调节细胞凋亡。但是胞浆只有pH值的改变并不足以触发细胞凋亡[1]，我们知道，凋亡的显著生化特征是核酸内切酶的活化，切断DNA双链形成寡聚核小体片段 ，因此，不同pH值 的胞液通过为不同的核酸内切酶提供最合适的活化环境，从而来促进细胞凋亡[1]。 本实验以紫外线(UVB)照射为剌激因素，观察UVB在引起NIH3T3细胞凋亡时，胞内pH值如何变化以及NIH3T3细胞内外Ca2+浓度与胞浆pH值之间关系。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 细胞准备 将NIH3T3细胞用含10%小牛血清的RPMI 1640(美国Sigma公司)培养基稀释成106/ml，接种于改良Petri培养皿中，在37℃，5% CO2和饱和湿度下培养36 h备用。
1.2 细胞内pH值的测定 试剂配制：用二甲亚砜将Snafl-1-AM(美国Molecular probe公司)配成1 mmol/L储备液，分装冻存于-20℃中，染色前用不含血清、酚红的RPMI 1640将其稀释至10 μmol/L。吸去皿中培养基，将NIH3T3细胞以RPMI?1640(不含血清、酚红，下同)清洗3次，加入80 μl 10 μmol/L Snafl-1-AM， 避光置37℃ CO2孵育箱40 min，吸去染液，以RPMI 1640清洗3次，加入1.0 ml Hanks液。将培养皿置于粘附式细胞仪(ACAS-570，美国Meridian公司)载物台上，选定适当参数后进行细胞检测和荧光动态扫描。
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1.3 实验分组
1.3.1 细胞内外有钙时胞内pH值测定 设空白对照组和处理组(UVB照射10 min，光源距样品垂直距离为40 cm，下同)。按上法测pH值。
1.3.2 细胞内外钙被螯合后胞内pH值测定 设空白对照组和处理组。空白对照组为只加入10 μmol/L EGTA；处理组为先加10 μmol/L EGTA，荧光变化稳定后，再UVB照射10 min。按上法测pH值。
1.4 数据处理 数据经ACAS-570微机系统对图形及时间进行实时测量而获得。
2 结果
附图中的纵轴为检测到的细胞内荧光值，数值已经标准化，数值大小与pH值成正比。横轴为时间。
2.1 细胞在Hanks液环境下，UVB致胞内pH值变化 空白对照组，胞内荧光值在很小的范围内波动，如图1中虚线A所示;处理组，细胞经UVB照射后，胞内荧光值会逐渐升高，并在1.6 h左右达到最大值，25 min后恢复正常，如图1中实线B所示。
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图1 Hank,s液下UVB对细胞内荧光强度变化的影响
注：图中实线B上两根竖线为辐射起始、终止点
2.2 细胞内外钙被螯合后，UVB致胞内pH值的变化 空白对照组，胞内荧光值在很小范围内波动，如图2，表明无其他因素刺激下，胞内、外无钙时，胞内pH值呈中性;处理组，先加10 mM EGTA，螯合细胞内外钙[2]，荧光变化稳定后，再经UVB照射，可见基本不能引起胞内荧光值的升高，如图3。
图2 细胞内外钙被螯合后胞内荧光强度的变化
注：图中单根竖线表示荧光值稳定后开始动态观察点
3 讨论
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细胞内环境的稳定是维持细胞正常功能的必要条件，而酸碱平衡的调节则是内环境稳定的前提。细胞内pH值的调节是通过离子转运机制以及胞液强大的缓冲能力来完成的[3] ，这种离子转运机制包括：Na+/H+对流(antiport)、ATP驱动的H+泵以及几种碳酸氢盐交换器[1]，其中，Na+/H+对流在细胞调控pH值中起主要作用 。现在已经知道，细胞内有大量的参与各种新陈代谢的酶是pH值敏感性的，在pH值生理性范围内它们各自有最适宜酶活性的pH值。同样，在凋亡细胞内发生的一系列生化改变中，胞浆pH值的变化也占有重要的地位[3] 。凋亡显著的生化特征是核酸内切酶的活化，切断DNA双链形成寡聚核小体片段 ，而这些核酸内切酶也是pH值敏感性的[1]，不同种类的细胞所含的核酸内切酶种类、数量也不尽相同，有的细胞发生凋亡主要是由于中性、Ca2+/Mg2+依赖型核酸内切酶的活化而起作用 ；有的细胞发生凋亡主要是由于酸性核酸内切酶的活化而起作用[4，5]；也有的细胞发生凋亡主要是由于碱性核酸内切酶的活化而起作用[1，6]；甚至有同种细胞(如HL-60)在酸性环境[5，7] 和碱性环境[1，6]都能发生凋亡。
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图3 细胞内外钙被螯合后UVB对胞内荧光强度变化的影响
注：图中两根竖线为辐射起始、终止点
Martin等[8] 认为UVB辐射能诱发细胞凋亡，而且还认为凋亡是由于UVB直接作用于细胞膜启动了鞘磷脂循环途径分解生成神经酰胺，再由神经酰胺触发后续的一系列细胞反应。Haimovitz-Friedman等人也通过实验发现，UVB作用于细胞膜通过激活一种中性鞘磷脂酶分解鞘磷脂生成神经酰胺。这种中性鞘磷脂酶主要分布于原生质膜，而且是Mg2+依赖性，在pH值7～7.5环境中活性最大[9，10]。
本实验图1中示，UVB照射NIH3T3细胞在Hank,s液环境下诱导凋亡时，细胞胞浆呈碱性，说明NIH3T3细胞内pH值的变化(碱化)与凋亡有关，参与了凋亡的调控；它有可能是通过活化碱性核酸内切酶来消化DNA的；由于实验体系是在Hank,s液环境下(pH值约为7.4)，那么，我们推测如果UVB诱导的凋亡信号是通过神经酰胺作为第二信使传导的话，那么神经酰胺的生成是通过活化中性鞘磷脂酶分解鞘磷脂而来。
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实验图2,3中示， 在细胞内外钙被螯合后，不管UVB照射与否，胞内pH值无变化。表明NIH3T3细胞内Ca2+变化与pH值变化关系密切，胞内Ca2+水平影响胞浆pH值的变化。正如前面所述，胞内pH值主要靠离子转运机制来调控，而离子转运机制中Na+/H+对流起主要作用。有文献报道，当激素或生长因子与细胞内相应受体结合后，可激活蛋白激酶C，从而活化Na+/H+对流诱导细胞内碱化。而且还知道，电离辐射可引起细胞内结合水和溶解水的放射性分解，生成H+、过氧化氢、过氧化物自由基 ，这些氧化剂，如过氧化氢和过氧化物能诱导磷脂酶PLC激活，导致Ca2+动员和蛋白激酶C(PKC)激活 ，从而激活Na+/H+对流引起细胞内碱化。可见Ca2+变化与pH值变化是有联系的，而且Ca2+变化可能在pH值变化之前。
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本实验反映了UVB作用下，NIH3T3细胞内pH值的变化过程，揭示了胞内Ca2+变化与pH值的变化不是两个独立的现象，而是彼此间有联系的，胞浆pH值的变化可能参与了细胞凋亡的调控。
参考文献
[1]Zhu WH， Loh TT. Effects of Na+/H+ antiport and intracellular pH in the regulation of HL-60 cell apoptosis. Biochem Biophys Acta, 1995，1269(2):122
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[4]Barry MA， Eastman A. Identification of deoxyribonuclease as an endonuclease involved in apoptosis. Arch Biochem Biophys, 1993,300(1):440
[5]Barry MA,Reynolds JE, Eastman A, et al. Etoposide-induced apoptosis in human HL-60 cells is associated with intracellular acidification. Cancer Res, 1993,53(10 suppl):2349
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[6]Matsubara K,Kubota M,Adachi S,et al.Different mode of cell death by calcium ionophore in human leukemia cell lines:possible role of constitutive endomuclease. Exp Cell Res, 1994,210(1):19
[7]Li J,Eastman A.Apoptosis in an interleukin-2-dependent cytotoxic T lymphocyte cell line is associated with intracellular acidification.Role of the Na+/H+-antiport. J Biol Chem, 1995,270(7):3203
[8]Martin SJ,Newmeyer DD,Mathias S, et al.Cell free reconstitution of fas, UV radiation and ceramide induced apoptosis. EMBO J, 1995,14(21):5191
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[10]Chatterjee S. Neutral Sphingomyelinases. Adv Lip Res, 1993,26:25
(收稿日期：1999-11-22), http://www.100md.com