酪氨酸激酶途径在成骨细胞增殖及c-fos表达中的作用
作者：童安莉 陈璐璐 丁桂芝 张澈
单位：童安莉(430022 武汉，同济医科大学附属协和医院内分泌科；现在中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院内分泌科)；陈璐璐(430022 武汉，同济医科大学附属协和医院内分泌科)；丁桂芝(430022 武汉，同济医科大学附属协和医院内分泌科)；张澈(430022 武汉，同济医科大学附属协和医院内分泌科)
关键词：酪氨酸激酶抑制剂；成骨细胞；增殖c-fos
中国骨质疏松杂志000303 [摘要] 目的 探讨酪氨酸激酶信息传递途径在成骨细胞增殖及c-fos表达中的作用。方法 采用阶段性酶消化法分离培养新生大鼠颅盖骨成骨细胞，用MTT法观察成骨细胞增殖，用免疫组化SP法结合计算机图像处理系统检测成骨细胞c-fos表达。结果 酪氨酸激酶抑制剂Genistein和Herbimycin A抑制成骨细胞增殖，且两者均部分阻断血清刺激的成骨细胞c-fos表达。结论 血清刺激和维持成骨细胞增殖及诱导c-fos表达均涉及酪氨酸激酶信息传递途径。
, 百拇医药
Involvement of tyrosine kinase pathway in proliferation and c-fos expression of osteoblasts
Tong Anli，Chen Lulu，Ding Guizhi
(Department of Endocrinology,Union Hospital of Tongji Medical University,Wuhan 430022,China)
[Abstract] Objective To study the signal transduction pathway in the proliferation and c-fos expression of osteoblasts.Methods Osteoblastic cells from rat calvaria were isolated by sequential enzymatic digestion.The proliferation of osteoblasts was measured by tetrazolium salt(MTT)method,and c-fos expression of osteoblasts was detected by immunohistochemistry combined with computer-based image analysis.Results Both genistein and herbimycin A,the inhibitors of tyrosine kinase,inhibited proliferation of osteoblasts,and they both partly blocked the c-fos expression induced by fresh serum. Conclusion Tyrosine kinase pathway is involved in the proliferation and c-fos expression of osteoblasts induced by serum.
, 百拇医药
[Key words] Tyrosine kinase inhibitor; Osteoblasts; Proliferation; c-fos
近几年，国内外对胞外信号激活细胞基因转录所要经历的信息传递途径的研究取得了很大进展。胞外信号由细胞表面传入细胞核，激活转录因子，而后者调控靶基因的转录[1]。c-fos由原癌基因c -fos编码，参与转录因子AP-1的组成，调节细胞的生长分化[2]。c-fos的成骨细胞增殖期高表达，而在分化期低表达或没有表达，影响成骨细胞的增殖、分化，尤其与成骨细胞的增殖激活密切相关[3，4]。血清中含有生长因子、激素等成分，能刺激和维持体外培养细胞的增殖生长。本实验研究血清诱导成骨细胞增殖及c-fos表达的信息传递机理，探讨其中可能涉及的酪氨酸激酶途径。
1 材料和方法
1.1 主要试剂：α-MEM培养基、胎牛血清(FCS)购自Gibco公司。Genistein、Herbimycin A、胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、MTT购自Sigma公司。c-fos抗体为Santa Cruz公司产品。
, 百拇医药
1.2 成骨细胞分离及培养：取出生24 h的SD大鼠，无菌操作下取出颅盖骨，剥离去除软组织与骨膜，用无血清α-MEM培养基洗两次后，将其剪碎，然后进行阶段性酶消化：加入0.2%的Ⅰ型胶原酶和0.1%的透明质酸酶37℃搅拌消化20 min，如此反复消化5次，共收集5批细胞，前2批细胞弃去不用，后3批细胞收集后，用α-MEM冲洗细胞1次，将细胞悬浮于α-MEM培养基中(含10%FCS，青、链霉素各100U/ml)接种于培养瓶中，置于37℃，饱和湿度，5% CO2的培养箱中培养。24 h后，更换培养基继续培养，以后每隔2 d更换培养基1次，待细胞接近融合时用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA将细胞从瓶底消化下来，加入含10%FCS的培养基吹打成细胞悬液，调整细胞浓度，将细胞以2×104/cm2的细胞密度接种于96孔培养板和装入消毒好的盖玻片的6孔培养板中。
1.3 细胞增殖测定：成骨细胞在含10% FCS的α-MEM中生长24 h，换用新鲜的含10% FCS的α-MEM，同时分别加入处理因素(Genistein浓度分别为10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L；Herbimycin A浓度分别为10ng/ml、50 ng/ml、200 ng/ml)并设对照组(只加入新鲜10% FCS的α-MEM)，再培养24 h，吸出培养基，加入MTT溶液(1 mg/ml)100 μl/孔，置37℃温箱中孵育3 h，细胞内出现蓝紫色甲FDA1晶体，然后，每孔加入100μl甲FDA1提取液(20% SDS)，4℃冰箱过夜，使细胞内的蓝紫色甲FDA1晶体完全溶解，酶标仪在570 nm波长处测A值。用MTT和甲FDA1提取液作空白对照。MTT法测定的A值与增殖细胞数量呈线性关系。
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1.4 c-fos免疫组化(SP法)染色：成骨细胞在装有盖玻片的6孔板中培养24 h，吸出培养基，洗板两次后，随机分为4组(每组接种盖玻片4张)：对照组加不含FCS的α-MEM；SER组加含10%FCS的α-MEM；SER+GEN组加含100μmol/LGenistein 及10% FCS的α-MEM；SER+HA组加入含200ng/ml Herbimycin A及10% FCS的α-MEM，继续培养2 h后取出盖玻片，进行c-fos的免疫组化染色。具体步骤如下：1%的多聚甲醛固定10 min。0.1% Tritron X-100-PBS,常温下20 min。3%H2O2室温20 min。10%正常羊血清(NSS)室温过夜。加生物素化羊抗免(1：100)37℃，40 min。加辣根酶标记链霉卵白素(1：100)37℃，40 min。加DAB*H2O2溶液，镜下显色至满意，自来水冲洗，双蒸水漂洗。以上各步骤间均用PBS振洗，5 min×3。常规脱水、透明、树胶封片。用PBS代替一抗作阴性对照。
, 百拇医药
免疫组化染色结果半定量分析：每组随机选取20个细胞，用同济太阳500彩色多媒体图像处理系统，测试着色平均光密度值。
图1 酪氨酸激酶抑制剂对血清刺激
成骨细胞c-fos表达的影响
注：SER组、SER+GEN组、SER+HA组与对照
组比，*P<0.01；SER+GEN组、SER+HA组
与SER组比，#P<0.05
1.5 统计分析：实验结果以均值±标准差(
±s)表示，组间进行t检验。
, 百拇医药
2 结果
2.1 酪氨酸激酶抑制剂对成骨细胞增殖的影响：Genistein、Herbimycin A作用成骨细胞24 h，用MTT法检测成骨细胞数量所得的A值，在对照组为0.155±0.005，Genistein 10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L组分别为0.144±0.026、0.143±0.007和0.135±0.014，其中后两组数值与对照组比较经统计学分析，差异有显著性(P<0.05)；Herbimycin A 10 ng/ml、50 ng/ml、200 ng/ml组测定值分别为0.154±0.023、0.122±0.019和0.116±0.007，其中后两组数值与对照组比较经统计学分析，差异有非常显著性(P<0.01)。这一结果表明：Genistein、Herbimycin A均抑制成骨细胞增殖。
2.2 酪氨酸激酶抑制剂对血清诱导成骨细胞c-fos表达的影响：对照组及处理组的成骨细胞内均有黄褐色染色颗粒，表明成骨细胞中有c-fos表达。将c-fos免疫组化染色进行图像分析，平均光密度测量(见图1)显示，Genistein、Herbimycin A均部分阻断血清刺激的成骨细胞c-fos表达。
, 百拇医药
3 讨论
细胞内酪氨酸激酶种类很多，参与介导胞外信号的信息传递，与细胞的增殖、分化、存活密切相关。Genistein和Herbimycin A均是酪氨酸激酶抑制剂，但对其所抑制的具体酪氨酸激酶目前还不清楚。酪氨酸激酶传递途径主要包括：受体和非受体酪氨酸激酶→Ras蛋白→MAPKKK(如Raf1)→MAPKK→MAPK→底物→基因转录DNA合成[5，6]。血清中含有生长因子及激素，很多生长因子受体都是酪氨酸激酶，可以通过以上的级联系统将信号传递到细胞核内，调节转录因子的产生而最终调控基因表达。c-fos为快速早期基因，在刺激因子作用下，具有在转录水平快速激活的特点。其蛋白质产物在刺激后1～2 h表达达到高峰，c-fos与c-jun结合可形成转录因子AP-1复合物。在对其他细胞的研究表明MAPK可激活c-fos基因表达[2，7]，而对在成骨细胞中诱导c-fos表达的信号传递机理的研究报道较少。
, 百拇医药 近几年，体内、外实验及转基因动物研究发现，c-fos表达对骨转换有重要意义，严格调控c-fos的表达对正常骨代谢很重要[8，9]。已有实验证明，甲状旁腺激素(PTH)[10]、前列环素(PGI2)[11]、胰岛素样生长因子(IGF)[12]、转化生长因子β(TGFβ)[13]均诱导c-fos原癌基因的表达，同时这些因子又影响成骨细胞的增殖，且用c-fos反义核苷酸能阻断TGFβ的致有丝分裂作用。由此证明，c-fos表达在调控成骨细胞增殖中起重要作用。现已证明，c-fos在成骨细胞增殖期高表达，在分化期低表达或没有表达，与成骨细胞增殖激活有关[3]。在对其他细胞系的研究中发现抑制c-fos表达不仅阻断细胞由G0期向G1期转化，还能抑制对数生长期细胞的增殖[14，15]。
本研究发现酪氨酸激酶抑制剂Genistein、Herbimycin A能抑制成骨细胞增殖，且部分阻断血清刺激的c-fos表达，由此证明血清刺激和维持成骨细胞增殖及诱导c-fos表达均涉及酪氨酸激酶途径。对血清通过酪氨酸激酶途径刺激c-fos表达增加及后者作为转录因子的组成部分而最终诱导与细胞增殖有关基因的表达并促进增殖的推测还有待进一步研究证实。血清刺激细胞增殖的信息传递途径很复杂，很可能同时包括其他一些与c-fos表达无关的促增殖的信息传递机制。本研究结果可以为进一步认识成骨细胞增殖的分子机制提供帮助。
, 百拇医药
参考文献
1，Karin M.Signal transduction from the cell surface to the nucleus through the phosphorylation of transcriptional factors.Curr Opin Cell Biol,1994,6:415-420.
2，Janknecht R.Regulation of c-fos promoter.Immunobiol,1995,193:137-142.
3，Lian JB,Stein GS.Osteoblast biology.In Robert M,David F,Jennifer K,eds.Osteoporosis.San Diego,California,U.S.A:Academic Press,1996,23-59.
, 百拇医药
4，Mccabe LR,Kockx M,Lian J,et al.Selective expression of fos-and jun-related genes during osteoblast proliferation and differentiation.Exp Cell Res,1995,218:255-262.
5，Kyriakis JM,App h,Zhang XF,et al.Raf-1 activates MAP kinase-kinase.Nature,1992,358:417-421.
6，Keyse SM.An emerging family of dual specificity MAP kinase phosphatases.Biochim Biophy Acta,1995,1265:152-160.
7，Mehmet H.Regulation of c-fos expression in Swiss 3T3 cells:an interplay of multiple signal transduction pathways.Br Med Bull,1991,47:76-86.
, http://www.100md.com
8，Dony C,Gruss P.Proto-oncogene c-fos expression in growth regions of fetal bone and mesodermal web tissue.Nature,1987,328:711-714.
9，Rurther U,Garber C,Komitowski D,et al.Deregulation of c-fos expression interferes with normal development in transgenic mice.Nature,1987,325:412-416.
10，Pearman AT,Chou WY,Bergman KD,et al.Parathyroid hormone induces c-fos promoter activity in osteoblastic cells through phosphorylated cAMP response element(CRE)-binding protein binding to the major CRE.J Biol Chem,1996,271:25715-25721.
, http://www.100md.com
11，Glantschnig H,Varga F,Klaushoferk.The cellular protooncogenes c-fos and egr-1 are regulated by prostacyclin in rodent osteoblasts and fibroblasts.Endocrinology,1996,137:4536-4541.
12，Merriman HL,Latour D,Linkhart TA,et al.Insulin-like growth factor-Ⅰ and insulin-like growth factor-Ⅱ induce c-fos in mouse osteoblastic cells.Calcif Tissue Int,1990,46:258-264.
13，Machwate M,Jullienne A,Monkhtar M,et al.c-fos protooncogene is involved in the mitogenic effect of transforming growth factor-β in osteoblastic cell.Mol Endocrinol,1995,9:187-196.
14，Nishikura K,Murra JM.Antisense RNA of protooncogene c-fos blocks renewed growth of quiescent 3T3 cells.Mol Cell Biol,1987,7:639-649.
15，Holt JT,Gopal TV,Moulton AD,et al.Inducible production of c-fos antisense RNA inhibits 3T3 proliferation.Proc Natl Acad Sci USA,1986,83:4794-4798., 百拇医药
单位：童安莉(430022 武汉，同济医科大学附属协和医院内分泌科；现在中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院内分泌科)；陈璐璐(430022 武汉，同济医科大学附属协和医院内分泌科)；丁桂芝(430022 武汉，同济医科大学附属协和医院内分泌科)；张澈(430022 武汉，同济医科大学附属协和医院内分泌科)
关键词：酪氨酸激酶抑制剂；成骨细胞；增殖c-fos
中国骨质疏松杂志000303 [摘要] 目的 探讨酪氨酸激酶信息传递途径在成骨细胞增殖及c-fos表达中的作用。方法 采用阶段性酶消化法分离培养新生大鼠颅盖骨成骨细胞，用MTT法观察成骨细胞增殖，用免疫组化SP法结合计算机图像处理系统检测成骨细胞c-fos表达。结果 酪氨酸激酶抑制剂Genistein和Herbimycin A抑制成骨细胞增殖，且两者均部分阻断血清刺激的成骨细胞c-fos表达。结论 血清刺激和维持成骨细胞增殖及诱导c-fos表达均涉及酪氨酸激酶信息传递途径。
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Involvement of tyrosine kinase pathway in proliferation and c-fos expression of osteoblasts
Tong Anli，Chen Lulu，Ding Guizhi
(Department of Endocrinology,Union Hospital of Tongji Medical University,Wuhan 430022,China)
[Abstract] Objective To study the signal transduction pathway in the proliferation and c-fos expression of osteoblasts.Methods Osteoblastic cells from rat calvaria were isolated by sequential enzymatic digestion.The proliferation of osteoblasts was measured by tetrazolium salt(MTT)method,and c-fos expression of osteoblasts was detected by immunohistochemistry combined with computer-based image analysis.Results Both genistein and herbimycin A,the inhibitors of tyrosine kinase,inhibited proliferation of osteoblasts,and they both partly blocked the c-fos expression induced by fresh serum. Conclusion Tyrosine kinase pathway is involved in the proliferation and c-fos expression of osteoblasts induced by serum.
, 百拇医药
[Key words] Tyrosine kinase inhibitor; Osteoblasts; Proliferation; c-fos
近几年，国内外对胞外信号激活细胞基因转录所要经历的信息传递途径的研究取得了很大进展。胞外信号由细胞表面传入细胞核，激活转录因子，而后者调控靶基因的转录[1]。c-fos由原癌基因c -fos编码，参与转录因子AP-1的组成，调节细胞的生长分化[2]。c-fos的成骨细胞增殖期高表达，而在分化期低表达或没有表达，影响成骨细胞的增殖、分化，尤其与成骨细胞的增殖激活密切相关[3，4]。血清中含有生长因子、激素等成分，能刺激和维持体外培养细胞的增殖生长。本实验研究血清诱导成骨细胞增殖及c-fos表达的信息传递机理，探讨其中可能涉及的酪氨酸激酶途径。
1 材料和方法
1.1 主要试剂：α-MEM培养基、胎牛血清(FCS)购自Gibco公司。Genistein、Herbimycin A、胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、MTT购自Sigma公司。c-fos抗体为Santa Cruz公司产品。
, 百拇医药
1.2 成骨细胞分离及培养：取出生24 h的SD大鼠，无菌操作下取出颅盖骨，剥离去除软组织与骨膜，用无血清α-MEM培养基洗两次后，将其剪碎，然后进行阶段性酶消化：加入0.2%的Ⅰ型胶原酶和0.1%的透明质酸酶37℃搅拌消化20 min，如此反复消化5次，共收集5批细胞，前2批细胞弃去不用，后3批细胞收集后，用α-MEM冲洗细胞1次，将细胞悬浮于α-MEM培养基中(含10%FCS，青、链霉素各100U/ml)接种于培养瓶中，置于37℃，饱和湿度，5% CO2的培养箱中培养。24 h后，更换培养基继续培养，以后每隔2 d更换培养基1次，待细胞接近融合时用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA将细胞从瓶底消化下来，加入含10%FCS的培养基吹打成细胞悬液，调整细胞浓度，将细胞以2×104/cm2的细胞密度接种于96孔培养板和装入消毒好的盖玻片的6孔培养板中。
1.3 细胞增殖测定：成骨细胞在含10% FCS的α-MEM中生长24 h，换用新鲜的含10% FCS的α-MEM，同时分别加入处理因素(Genistein浓度分别为10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L；Herbimycin A浓度分别为10ng/ml、50 ng/ml、200 ng/ml)并设对照组(只加入新鲜10% FCS的α-MEM)，再培养24 h，吸出培养基，加入MTT溶液(1 mg/ml)100 μl/孔，置37℃温箱中孵育3 h，细胞内出现蓝紫色甲FDA1晶体，然后，每孔加入100μl甲FDA1提取液(20% SDS)，4℃冰箱过夜，使细胞内的蓝紫色甲FDA1晶体完全溶解，酶标仪在570 nm波长处测A值。用MTT和甲FDA1提取液作空白对照。MTT法测定的A值与增殖细胞数量呈线性关系。
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1.4 c-fos免疫组化(SP法)染色：成骨细胞在装有盖玻片的6孔板中培养24 h，吸出培养基，洗板两次后，随机分为4组(每组接种盖玻片4张)：对照组加不含FCS的α-MEM；SER组加含10%FCS的α-MEM；SER+GEN组加含100μmol/LGenistein 及10% FCS的α-MEM；SER+HA组加入含200ng/ml Herbimycin A及10% FCS的α-MEM，继续培养2 h后取出盖玻片，进行c-fos的免疫组化染色。具体步骤如下：1%的多聚甲醛固定10 min。0.1% Tritron X-100-PBS,常温下20 min。3%H2O2室温20 min。10%正常羊血清(NSS)室温过夜。加生物素化羊抗免(1：100)37℃，40 min。加辣根酶标记链霉卵白素(1：100)37℃，40 min。加DAB*H2O2溶液，镜下显色至满意，自来水冲洗，双蒸水漂洗。以上各步骤间均用PBS振洗，5 min×3。常规脱水、透明、树胶封片。用PBS代替一抗作阴性对照。
, 百拇医药
免疫组化染色结果半定量分析：每组随机选取20个细胞，用同济太阳500彩色多媒体图像处理系统，测试着色平均光密度值。
图1 酪氨酸激酶抑制剂对血清刺激
成骨细胞c-fos表达的影响
注：SER组、SER+GEN组、SER+HA组与对照
组比，*P<0.01；SER+GEN组、SER+HA组
与SER组比，#P<0.05
1.5 统计分析：实验结果以均值±标准差(
±s)表示，组间进行t检验。, 百拇医药
2 结果
2.1 酪氨酸激酶抑制剂对成骨细胞增殖的影响：Genistein、Herbimycin A作用成骨细胞24 h，用MTT法检测成骨细胞数量所得的A值，在对照组为0.155±0.005，Genistein 10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L组分别为0.144±0.026、0.143±0.007和0.135±0.014，其中后两组数值与对照组比较经统计学分析，差异有显著性(P<0.05)；Herbimycin A 10 ng/ml、50 ng/ml、200 ng/ml组测定值分别为0.154±0.023、0.122±0.019和0.116±0.007，其中后两组数值与对照组比较经统计学分析，差异有非常显著性(P<0.01)。这一结果表明：Genistein、Herbimycin A均抑制成骨细胞增殖。
2.2 酪氨酸激酶抑制剂对血清诱导成骨细胞c-fos表达的影响：对照组及处理组的成骨细胞内均有黄褐色染色颗粒，表明成骨细胞中有c-fos表达。将c-fos免疫组化染色进行图像分析，平均光密度测量(见图1)显示，Genistein、Herbimycin A均部分阻断血清刺激的成骨细胞c-fos表达。
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3 讨论
细胞内酪氨酸激酶种类很多，参与介导胞外信号的信息传递，与细胞的增殖、分化、存活密切相关。Genistein和Herbimycin A均是酪氨酸激酶抑制剂，但对其所抑制的具体酪氨酸激酶目前还不清楚。酪氨酸激酶传递途径主要包括：受体和非受体酪氨酸激酶→Ras蛋白→MAPKKK(如Raf1)→MAPKK→MAPK→底物→基因转录DNA合成[5，6]。血清中含有生长因子及激素，很多生长因子受体都是酪氨酸激酶，可以通过以上的级联系统将信号传递到细胞核内，调节转录因子的产生而最终调控基因表达。c-fos为快速早期基因，在刺激因子作用下，具有在转录水平快速激活的特点。其蛋白质产物在刺激后1～2 h表达达到高峰，c-fos与c-jun结合可形成转录因子AP-1复合物。在对其他细胞的研究表明MAPK可激活c-fos基因表达[2，7]，而对在成骨细胞中诱导c-fos表达的信号传递机理的研究报道较少。
, 百拇医药 近几年，体内、外实验及转基因动物研究发现，c-fos表达对骨转换有重要意义，严格调控c-fos的表达对正常骨代谢很重要[8，9]。已有实验证明，甲状旁腺激素(PTH)[10]、前列环素(PGI2)[11]、胰岛素样生长因子(IGF)[12]、转化生长因子β(TGFβ)[13]均诱导c-fos原癌基因的表达，同时这些因子又影响成骨细胞的增殖，且用c-fos反义核苷酸能阻断TGFβ的致有丝分裂作用。由此证明，c-fos表达在调控成骨细胞增殖中起重要作用。现已证明，c-fos在成骨细胞增殖期高表达，在分化期低表达或没有表达，与成骨细胞增殖激活有关[3]。在对其他细胞系的研究中发现抑制c-fos表达不仅阻断细胞由G0期向G1期转化，还能抑制对数生长期细胞的增殖[14，15]。
本研究发现酪氨酸激酶抑制剂Genistein、Herbimycin A能抑制成骨细胞增殖，且部分阻断血清刺激的c-fos表达，由此证明血清刺激和维持成骨细胞增殖及诱导c-fos表达均涉及酪氨酸激酶途径。对血清通过酪氨酸激酶途径刺激c-fos表达增加及后者作为转录因子的组成部分而最终诱导与细胞增殖有关基因的表达并促进增殖的推测还有待进一步研究证实。血清刺激细胞增殖的信息传递途径很复杂，很可能同时包括其他一些与c-fos表达无关的促增殖的信息传递机制。本研究结果可以为进一步认识成骨细胞增殖的分子机制提供帮助。
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参考文献
1，Karin M.Signal transduction from the cell surface to the nucleus through the phosphorylation of transcriptional factors.Curr Opin Cell Biol,1994,6:415-420.
2，Janknecht R.Regulation of c-fos promoter.Immunobiol,1995,193:137-142.
3，Lian JB,Stein GS.Osteoblast biology.In Robert M,David F,Jennifer K,eds.Osteoporosis.San Diego,California,U.S.A:Academic Press,1996,23-59.
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4，Mccabe LR,Kockx M,Lian J,et al.Selective expression of fos-and jun-related genes during osteoblast proliferation and differentiation.Exp Cell Res,1995,218:255-262.
5，Kyriakis JM,App h,Zhang XF,et al.Raf-1 activates MAP kinase-kinase.Nature,1992,358:417-421.
6，Keyse SM.An emerging family of dual specificity MAP kinase phosphatases.Biochim Biophy Acta,1995,1265:152-160.
7，Mehmet H.Regulation of c-fos expression in Swiss 3T3 cells:an interplay of multiple signal transduction pathways.Br Med Bull,1991,47:76-86.
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8，Dony C,Gruss P.Proto-oncogene c-fos expression in growth regions of fetal bone and mesodermal web tissue.Nature,1987,328:711-714.
9，Rurther U,Garber C,Komitowski D,et al.Deregulation of c-fos expression interferes with normal development in transgenic mice.Nature,1987,325:412-416.
10，Pearman AT,Chou WY,Bergman KD,et al.Parathyroid hormone induces c-fos promoter activity in osteoblastic cells through phosphorylated cAMP response element(CRE)-binding protein binding to the major CRE.J Biol Chem,1996,271:25715-25721.
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11，Glantschnig H,Varga F,Klaushoferk.The cellular protooncogenes c-fos and egr-1 are regulated by prostacyclin in rodent osteoblasts and fibroblasts.Endocrinology,1996,137:4536-4541.
12，Merriman HL,Latour D,Linkhart TA,et al.Insulin-like growth factor-Ⅰ and insulin-like growth factor-Ⅱ induce c-fos in mouse osteoblastic cells.Calcif Tissue Int,1990,46:258-264.
13，Machwate M,Jullienne A,Monkhtar M,et al.c-fos protooncogene is involved in the mitogenic effect of transforming growth factor-β in osteoblastic cell.Mol Endocrinol,1995,9:187-196.
14，Nishikura K,Murra JM.Antisense RNA of protooncogene c-fos blocks renewed growth of quiescent 3T3 cells.Mol Cell Biol,1987,7:639-649.
15，Holt JT,Gopal TV,Moulton AD,et al.Inducible production of c-fos antisense RNA inhibits 3T3 proliferation.Proc Natl Acad Sci USA,1986,83:4794-4798., 百拇医药