血管肽对离体大鼠血管平滑肌细胞增殖和c-myb mRNA表达的影响
作者：郗永安 汪丽蕙 唐朝枢
单位：郗永安(天坛医院CCU工作)；汪丽蕙 唐朝枢(北京大学第一医院心内科 100034)
关键词：血管平滑肌细胞；血管肽；癌基因
中国介入心脏病学杂志000315 【摘要】 目的 观察了血管肽(angiopeptim，AP)对血小板源性生长因子刺激下离体大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和c-myb mRNA表达的影响，从分子生物学水平探讨其抗增殖作用机制。方法 采用细胞计数确定VSMC增殖状态。以Nothern印迹法测定c-myb mRNA表达水平。结果 各组细胞计数分别为(5.45±0.57)×104，对照组；(4.12±0.13)×104,30 nmol/L；(3.13±0.20)×104,60 nmol/L和(2.03±0.05)×104，120 nmol/L；(q=10.50,10.32和27.01，P<0.01)。抑制率分别为29%，52%和77%。其对VSMC c-myb mRNA表达的抑制也具剂量依赖性。c-myb mRNA/GAPDH比值分别为1.12±0.02(对照组)；0.61±0.01,30 nmol/L;0.34±0.01,60 nmol/L和0.16±0.01,120 nmol/L;q=39.23,60.00和73.85,P<0.01)。结论 血管肽显著抑制VSMC增殖及c-myb原癌基因表达，作用呈剂量依赖性。提示AP抗增殖作用与抑制晚期生长调节基因表达有关。
, 百拇医药
Effects of angiopeptin on expression of c-myb mRNA in rat vascular smooth muscle cells
Xi Yongan, Wang Lihui, Tang Chaoshu.
(Department of Cardiology, First Hospital of Beijing Medical University, Beijing 100034)
【Abstract】 Objective Oncogenes play an important role in cell growth and differentiation. Angiopeptin (AP) has been shown to be a potent antiproliferative agent for various cell types. The mechanism of AP on the VSMC proliferation is unclear. The aim of this study was to analyze the effects of AP on proliferation and expression of c-myb protooncogene in cultured rat VSMC treated with platelet-derived growth factor (PDGF). Methods Cell proliferation was determined by cell counting. The expression of c-myb mRNA of VSMC was detected by Northern blot. Results AP produced a dose-dependent inhibition of VSMC proliferation compared with control group. The number of VSMC were (5.45±0.57)×104 (for control group,
±s)； (4.12±0.13)×104, 30 nmol/L； (3.13±0.20)×104, 60 nmol/L; and (2.03±0.05)×104， 120 nmol/L；(q=10.50, 10.32 and 27.01; P<0.01) respectively. The inhibitory rates were in turn 29%， 52% and 77%, compared with control group. The c-myb mRNA expression of VSMC was also inhibited by AP in a dose-dependent manner. The relative densitometric units were 1.12±0.02 (for control); 0.61±0.01, 30 nmol/L; 0.34±0.01, 60 nmol/L and 0.16±0.01, 120 nmol/L; (q=39.23, 60.00, and 73.85; P<0.01). Conclusions AP strongly inhibits both VSMC proliferation and c-myb mRNA expression, suggesting that the mechanism of AP on VSMC proliferation is related to suppressing the late growth regulated gene expression.
, 百拇医药
【Key words】 Smooth muscle cells; Angiopeptin; Oncogene
血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和表型改变是动脉粥样硬化及其他闭塞性血管疾病的主要病理基础[1]。血管肽(angiopeptin,AP)系一人工合成环八肽生长激素释放抑制因子类似物，对多种细胞具有抗增殖作用，并能抑制大鼠，家兔，猪和非人灵长类血管内皮损伤后肌内膜增殖[2]。其作用机理尚不完全清楚，一般认为与抑制VSMC活化所需生长因子有关。新近，AP对VSMC增殖基因表达的影响受到学者们关注。有证据表明，AP能抑制损伤家兔动脉c-fos和c-jun的表达。迄今，AP对c-myb mRNA表达的作用尚少报道。为此，我们探讨了AP对血小板源性生长因子(PDGF)刺激的体外大鼠胸主动脉VSMC表达c-myb mRNA的作用，从分子生物学角度研究AP抗细胞增殖的作用机理。
材料与方法
, 百拇医药
一、细胞培养
选用6周龄雄性SD大鼠活杀，取胸主动脉中膜以贴块法培养于含10%胎牛血清(FCS,GIBCO产品)，20 mmol/L HEPES(Sigma产品)，2 mmol/L L-谷氨酸，100 IU/ml青霉素，100 μg/ml链霉素的DMEM培养基中，置培养箱(37℃)培养。待细胞半融合后以0.01%胰蛋白酶消化传代，取第3代细胞进行实验处理。
二、细胞增殖抑制分析
单细胞悬液种植于含2.5%FCS-DMEM 24孔培养板中(5×103细胞/孔)，24 h后换含PDGF及不同剂量AP(HBI-USA惠赠)的2.5%FCS-DMEM培养基，每剂量组4孔。对照组以PBS代替AP。于第4日行酶消化悬浮细胞，以计数板进行细胞计数。每孔重复4次，以均值行统计分析。
三、c-myb mRNA表达分析
, 百拇医药
1.细胞同步与AP应用：VSMC种植于含2.5%FCS-DMEM的150 mm组织培养皿中(Falcon Labware产品)，每皿9×105细胞。采用血清饥饿法同步细胞，即4 h后换0.1%FCS-DMEM。4日后换2.5%FCS-DMEM。换液前1 h,各皿分别加入AP(30,60和120 nmol/L)与PDGF(30 ng/mL)。每2 h补加等量AP一次，14 h收获细胞。对照组以等量PBS代替AP。
2.RNA提取与Northern印迹，杂交：采用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA，紫外分光光度计定量，行1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，每泳道上样20 μg,按标准方法转于尼龙膜(GIBCO产品)。以随机引物法标记v-myb,GAPDH探针，所用试剂盒为Promega产品。10%硫酸葡聚糖，40%甲酰胺，42℃杂交16 h,标准SSC洗膜，于-70℃行放射自显影。进行光密度扫描分析。
四、统计学分析
, 百拇医药
资料以
±s表示，行Newman-Keuls检验分析。
结 果
一、AP对VSMC增殖的抑制作用
观察了不同剂量AP对PDGF刺激下VSMC增殖的抑制作用。结果表明，AP能显著抑制VSMC增殖，作用呈剂量依赖性。抑制率分别为29%(30 nmol/L),52%(60 nmol/L)和77%(120 nmol/L)(图1)。高剂量时(120 nmol/L)细胞依然铺展，未见细胞死亡，表明细胞处于静止状态。
二、AP对VSMC c-myb mRNA表达的影响
为探讨AP抗增殖作用的分子生物学机制，本研究观察了AP对VSMC c-myb mRNA表达的作用。结果表明，AP能明显抑制VSMC c-myb mRNA的表达，作用呈剂量依赖性(表1，图2)。提示，AP对VSMC增殖的抑制作用至少部分与阻遏c-myb原癌基因表达有关。
, 百拇医药
表1 AP对培养VSMC c-myb mRNA表达的作用(±s) 分组
mRNA
GAPDH
mrNA/GAPDH
对照组
29.3±80.51*
26.27±0.06**
1.12±0.02*
AP1组(30 nmol/L)
, 百拇医药
16.0±50.06
26.40±0.11
0.61±0.01
AP2组(60 nmol/L)
8.94±0.07
26.37±0.09
0.34±0.01
AP3组(120 nmol/L)
4.09±0.12
26.34±0.13
, 百拇医药
0.16±0.01
*与其他组比较P<0.01，**与其他组比较P>0.05讨 论
AP为生长激素释放抑制因子样肽类家系成员之一，晚近被开发用作防止肌内膜增殖的新制剂[3]。最初发现AP能抑制淋巴细胞增生，推测其具有免疫抑制功能。随后研究证实AP对多种肿瘤细胞也有同样效应。新近，其抗增殖作用已扩展至抑制VSMC增殖和动脉外植块的3H掺入[4]。其抗增殖作用机理尚不清楚，推测AP与细胞表面受体结合能产生抑制信号或阻止G1期中期关键丝裂原衍生信号的正常传号。AP能进入VSMC，有可能防止诸如胰岛素样生长因子-1,表皮生长因子，成纤维细胞生长因子的合成与释放。AP能减少生长因子受体表达，如血管紧张素Ⅱ,后者为VSMC增生，肥大的促进物及PDGF的协同剂。最近发现，AP尚能减少VSMC表面血管紧张素Ⅱ受体[5]。AP抑制早期即刻反应原癌基因如c-fos,c-jun的表达，它们编码与生长因子有关的转录调节子，促进导致肌内膜肥厚的VSMC增殖与细胞外基质分泌。AP也可能通过上调受体而增加生长因子表达。c-myb原癌基因同源于禽类髓母细胞瘤病毒转化基因，在细胞分化增殖中起关键作用[6]。本研究AP对PDGF刺激下大鼠离体培养VSMC c-myb mRNA表达的作用。结果表明，AP显著抑制PDGF刺激的VSMC增殖，作用呈剂量依赖性。AP对VSMC c-myb mRNA表达也具有同样效应。提示，AP可能通过抑制G1期中期关键mRNA产生而发挥其抗增殖作用。如果受抑mRNA系随后细胞周期演进所必需，那么G1期中期相应基因表达不足就可能导致细胞生长受抑。
, 百拇医药
本课题为国家自然科学基金资助项目
参 考 文 献
1，Miano JM, Tota RR, Viasic N, et al. Early protooncogene expression in rat aortic smooth muscle cells following endothelial removal. Am J Pathol, 1990,137:761-765.
2，Santoian EC, Schneider JE, Gravanis MB, et al. Angiopeptin inhibits intimal hyperplasia after angioplasty in porcine coronary arteries. Circulation, 1993,88:11-14.
3，Howell MH, Adams MM, Wolfe MS, et al. Angiopeptin inhibition of myointimal hyperplasia after balloon angioplasty of large arteries in hypercholesterolaemic rabbits. Clinical Science, 1993,85:183-188.
, http://www.100md.com
4，Foegh ML, Asotra S, Conte JV, et al. Early inhibition of myointimal proliferation by angiopeptin after balloon catheter injury in the rabbits. J Vasc Surge, 1994,10:1084-1091.
5，Diglio CA, Grammas P. In vitro response of vascular smooth muscle cells to angiopeptin. FASEB J, 1990,4:A334-A335.
6，Simons M, Morgan KG, Parker C, et al. The protooncogene c-myb mediates an intracellular calcium rise during the late G1 phase of the cell cycle. J Biol Chem, 1993,268:627-632.
(收稿:1999-03-20), 百拇医药
单位：郗永安(天坛医院CCU工作)；汪丽蕙 唐朝枢(北京大学第一医院心内科 100034)
关键词：血管平滑肌细胞；血管肽；癌基因
中国介入心脏病学杂志000315 【摘要】 目的 观察了血管肽(angiopeptim，AP)对血小板源性生长因子刺激下离体大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和c-myb mRNA表达的影响，从分子生物学水平探讨其抗增殖作用机制。方法 采用细胞计数确定VSMC增殖状态。以Nothern印迹法测定c-myb mRNA表达水平。结果 各组细胞计数分别为(5.45±0.57)×104，对照组；(4.12±0.13)×104,30 nmol/L；(3.13±0.20)×104,60 nmol/L和(2.03±0.05)×104，120 nmol/L；(q=10.50,10.32和27.01，P<0.01)。抑制率分别为29%，52%和77%。其对VSMC c-myb mRNA表达的抑制也具剂量依赖性。c-myb mRNA/GAPDH比值分别为1.12±0.02(对照组)；0.61±0.01,30 nmol/L;0.34±0.01,60 nmol/L和0.16±0.01,120 nmol/L;q=39.23,60.00和73.85,P<0.01)。结论 血管肽显著抑制VSMC增殖及c-myb原癌基因表达，作用呈剂量依赖性。提示AP抗增殖作用与抑制晚期生长调节基因表达有关。
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Effects of angiopeptin on expression of c-myb mRNA in rat vascular smooth muscle cells
Xi Yongan, Wang Lihui, Tang Chaoshu.
(Department of Cardiology, First Hospital of Beijing Medical University, Beijing 100034)
【Abstract】 Objective Oncogenes play an important role in cell growth and differentiation. Angiopeptin (AP) has been shown to be a potent antiproliferative agent for various cell types. The mechanism of AP on the VSMC proliferation is unclear. The aim of this study was to analyze the effects of AP on proliferation and expression of c-myb protooncogene in cultured rat VSMC treated with platelet-derived growth factor (PDGF). Methods Cell proliferation was determined by cell counting. The expression of c-myb mRNA of VSMC was detected by Northern blot. Results AP produced a dose-dependent inhibition of VSMC proliferation compared with control group. The number of VSMC were (5.45±0.57)×104 (for control group,
±s)； (4.12±0.13)×104, 30 nmol/L； (3.13±0.20)×104, 60 nmol/L; and (2.03±0.05)×104， 120 nmol/L；(q=10.50, 10.32 and 27.01; P<0.01) respectively. The inhibitory rates were in turn 29%， 52% and 77%, compared with control group. The c-myb mRNA expression of VSMC was also inhibited by AP in a dose-dependent manner. The relative densitometric units were 1.12±0.02 (for control); 0.61±0.01, 30 nmol/L; 0.34±0.01, 60 nmol/L and 0.16±0.01, 120 nmol/L; (q=39.23, 60.00, and 73.85; P<0.01). Conclusions AP strongly inhibits both VSMC proliferation and c-myb mRNA expression, suggesting that the mechanism of AP on VSMC proliferation is related to suppressing the late growth regulated gene expression., 百拇医药
【Key words】 Smooth muscle cells; Angiopeptin; Oncogene
血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和表型改变是动脉粥样硬化及其他闭塞性血管疾病的主要病理基础[1]。血管肽(angiopeptin,AP)系一人工合成环八肽生长激素释放抑制因子类似物，对多种细胞具有抗增殖作用，并能抑制大鼠，家兔，猪和非人灵长类血管内皮损伤后肌内膜增殖[2]。其作用机理尚不完全清楚，一般认为与抑制VSMC活化所需生长因子有关。新近，AP对VSMC增殖基因表达的影响受到学者们关注。有证据表明，AP能抑制损伤家兔动脉c-fos和c-jun的表达。迄今，AP对c-myb mRNA表达的作用尚少报道。为此，我们探讨了AP对血小板源性生长因子(PDGF)刺激的体外大鼠胸主动脉VSMC表达c-myb mRNA的作用，从分子生物学角度研究AP抗细胞增殖的作用机理。
材料与方法
, 百拇医药
一、细胞培养
选用6周龄雄性SD大鼠活杀，取胸主动脉中膜以贴块法培养于含10%胎牛血清(FCS,GIBCO产品)，20 mmol/L HEPES(Sigma产品)，2 mmol/L L-谷氨酸，100 IU/ml青霉素，100 μg/ml链霉素的DMEM培养基中，置培养箱(37℃)培养。待细胞半融合后以0.01%胰蛋白酶消化传代，取第3代细胞进行实验处理。
二、细胞增殖抑制分析
单细胞悬液种植于含2.5%FCS-DMEM 24孔培养板中(5×103细胞/孔)，24 h后换含PDGF及不同剂量AP(HBI-USA惠赠)的2.5%FCS-DMEM培养基，每剂量组4孔。对照组以PBS代替AP。于第4日行酶消化悬浮细胞，以计数板进行细胞计数。每孔重复4次，以均值行统计分析。
三、c-myb mRNA表达分析
, 百拇医药
1.细胞同步与AP应用：VSMC种植于含2.5%FCS-DMEM的150 mm组织培养皿中(Falcon Labware产品)，每皿9×105细胞。采用血清饥饿法同步细胞，即4 h后换0.1%FCS-DMEM。4日后换2.5%FCS-DMEM。换液前1 h,各皿分别加入AP(30,60和120 nmol/L)与PDGF(30 ng/mL)。每2 h补加等量AP一次，14 h收获细胞。对照组以等量PBS代替AP。
2.RNA提取与Northern印迹，杂交：采用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA，紫外分光光度计定量，行1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，每泳道上样20 μg,按标准方法转于尼龙膜(GIBCO产品)。以随机引物法标记v-myb,GAPDH探针，所用试剂盒为Promega产品。10%硫酸葡聚糖，40%甲酰胺，42℃杂交16 h,标准SSC洗膜，于-70℃行放射自显影。进行光密度扫描分析。
四、统计学分析
, 百拇医药
资料以
±s表示，行Newman-Keuls检验分析。结 果
一、AP对VSMC增殖的抑制作用
观察了不同剂量AP对PDGF刺激下VSMC增殖的抑制作用。结果表明，AP能显著抑制VSMC增殖，作用呈剂量依赖性。抑制率分别为29%(30 nmol/L),52%(60 nmol/L)和77%(120 nmol/L)(图1)。高剂量时(120 nmol/L)细胞依然铺展，未见细胞死亡，表明细胞处于静止状态。
二、AP对VSMC c-myb mRNA表达的影响
为探讨AP抗增殖作用的分子生物学机制，本研究观察了AP对VSMC c-myb mRNA表达的作用。结果表明，AP能明显抑制VSMC c-myb mRNA的表达，作用呈剂量依赖性(表1，图2)。提示，AP对VSMC增殖的抑制作用至少部分与阻遏c-myb原癌基因表达有关。
, 百拇医药
表1 AP对培养VSMC c-myb mRNA表达的作用(
±s) 分组mRNA
GAPDH
mrNA/GAPDH
对照组
29.3±80.51*
26.27±0.06**
1.12±0.02*
AP1组(30 nmol/L)
, 百拇医药
16.0±50.06
26.40±0.11
0.61±0.01
AP2组(60 nmol/L)
8.94±0.07
26.37±0.09
0.34±0.01
AP3组(120 nmol/L)
4.09±0.12
26.34±0.13
, 百拇医药
0.16±0.01
*与其他组比较P<0.01，**与其他组比较P>0.05讨 论
AP为生长激素释放抑制因子样肽类家系成员之一，晚近被开发用作防止肌内膜增殖的新制剂[3]。最初发现AP能抑制淋巴细胞增生，推测其具有免疫抑制功能。随后研究证实AP对多种肿瘤细胞也有同样效应。新近，其抗增殖作用已扩展至抑制VSMC增殖和动脉外植块的3H掺入[4]。其抗增殖作用机理尚不清楚，推测AP与细胞表面受体结合能产生抑制信号或阻止G1期中期关键丝裂原衍生信号的正常传号。AP能进入VSMC，有可能防止诸如胰岛素样生长因子-1,表皮生长因子，成纤维细胞生长因子的合成与释放。AP能减少生长因子受体表达，如血管紧张素Ⅱ,后者为VSMC增生，肥大的促进物及PDGF的协同剂。最近发现，AP尚能减少VSMC表面血管紧张素Ⅱ受体[5]。AP抑制早期即刻反应原癌基因如c-fos,c-jun的表达，它们编码与生长因子有关的转录调节子，促进导致肌内膜肥厚的VSMC增殖与细胞外基质分泌。AP也可能通过上调受体而增加生长因子表达。c-myb原癌基因同源于禽类髓母细胞瘤病毒转化基因，在细胞分化增殖中起关键作用[6]。本研究AP对PDGF刺激下大鼠离体培养VSMC c-myb mRNA表达的作用。结果表明，AP显著抑制PDGF刺激的VSMC增殖，作用呈剂量依赖性。AP对VSMC c-myb mRNA表达也具有同样效应。提示，AP可能通过抑制G1期中期关键mRNA产生而发挥其抗增殖作用。如果受抑mRNA系随后细胞周期演进所必需，那么G1期中期相应基因表达不足就可能导致细胞生长受抑。
, 百拇医药
本课题为国家自然科学基金资助项目
参 考 文 献
1，Miano JM, Tota RR, Viasic N, et al. Early protooncogene expression in rat aortic smooth muscle cells following endothelial removal. Am J Pathol, 1990,137:761-765.
2，Santoian EC, Schneider JE, Gravanis MB, et al. Angiopeptin inhibits intimal hyperplasia after angioplasty in porcine coronary arteries. Circulation, 1993,88:11-14.
3，Howell MH, Adams MM, Wolfe MS, et al. Angiopeptin inhibition of myointimal hyperplasia after balloon angioplasty of large arteries in hypercholesterolaemic rabbits. Clinical Science, 1993,85:183-188.
, http://www.100md.com
4，Foegh ML, Asotra S, Conte JV, et al. Early inhibition of myointimal proliferation by angiopeptin after balloon catheter injury in the rabbits. J Vasc Surge, 1994,10:1084-1091.
5，Diglio CA, Grammas P. In vitro response of vascular smooth muscle cells to angiopeptin. FASEB J, 1990,4:A334-A335.
6，Simons M, Morgan KG, Parker C, et al. The protooncogene c-myb mediates an intracellular calcium rise during the late G1 phase of the cell cycle. J Biol Chem, 1993,268:627-632.
(收稿:1999-03-20), 百拇医药