冠心病患者血细胞和粥样硬化动脉壁中巨细胞病毒的检出
作者：胡文立 刘敬忠 牛世芹 刘旻 石怀银 韦立新
单位：胡文立(首都医科大学附属北京红十字朝阳医院神经内科，北京 100020)；刘敬忠(北京市基因诊断中心)；牛世芹(首都医科大学附属北京红十字朝阳医院神经内科，北京 100020)；刘旻(首都医科大学附属北京红十字朝阳医院神经内科，北京 100020)；石怀银(解放军总医院病理科)；韦立新(解放军总医院病理科)
关键词：巨细胞病毒；动脉粥样硬化；冠状动脉；颈动脉；血细胞；病人
中国动脉硬化杂志000320[摘 要] 为了研究巨细胞病毒和动脉粥样硬化的关系, 用聚合酶链反应方法检查了巨细胞病毒在颈内动脉、冠状动脉和血中的分布，并与健康人作了对照。 发现83.3%～86.7%的动脉粥样硬化病人的动脉壁中存在巨细胞病毒，而非动脉粥样硬化病人的动脉壁中只有6.7%的标本中见巨细胞病毒，两者相比有非常显著性差异(P<0.001)；在 42.4%的动脉粥样硬化病人的血细胞中查见巨细胞病毒，而对照组中只有3%查见了巨细胞病毒，两者相比有非常显著性差异(P<0.01)。因此认为巨细胞病毒在动脉粥样硬化、 冠心病和动脉粥样硬化性脑梗塞的病理过程中起着重要的作用。
, 百拇医药
[中图分类号] R541.4 [文献标识码] A
[文章编号] 1007-3949(2000)-03-0263-03
Prevalence of Present Cytomegalovirus in the Atherosclerosis Arterial Walls and Leucocytes of the Patients with Coronary Heart Disease
HU Wen-Li，NU Shi-Qin，LIU Min
(Department of Neurology, Beijing Red Cross Chaoyang Hospital, Capital University of Medical Science, Beijing 100020, China)
, 百拇医药
ABSTRACT Aim To study the association of cytomegalovirus (CMV) with atherosclerosis. Methods The present of cytomegalovirus (CMV) nucleic acids was demonstrated in carotid artery and coronary artery of patients with and without atherosclerosis by polymerase chain reaction (PCR), and detected CMV by PCR in the blood of cerebral infarction patients with and without atherosclerosis. Results 83.3%-86.7% of the samples obtained from atherosclerotic patients' arterial wall were shown to contain viral nucleic acids (CMV), among 6.6% of patients' arterial wall without atherosclerosis CMV could be found, significant deference can be found between them (P<0.01). In blood CMV could be found in 42.4% of patients with atherosclerosis, in the comparison only 3% of samples had CMV (P<0.01). Conclusion CMV plays an important role in the pathologic process of the atherosclerosis and the atherosclerotic cerebral infarction.
, http://www.100md.com
MeSH Cytomegalovirus； Atherosclerosis； Coronary Vessels; Carotid Arteries； Blood Cells； Patients
近几年国外有资料证实动脉粥样硬化与巨细胞病毒(cytomegalovirus， CMV)感染有关[1～3]，国内仅见个别报道动脉粥样硬化病人的血液中巨细胞病毒的抗体浓度偏高,尚未见直接检测病毒的报道[4]。我们这篇报道主要研究巨细胞病毒在动脉粥样硬化病人的血管壁、血液中的分布情况，并与非动脉粥样硬化病人做了对照研究。
1 对象与方法
1.1 对象与分组
动脉粥样硬化病人死亡后12 h内行尸体解剖，取30个病人的冠状动脉壁和30个病人的颈内动脉壁用作研究资料；另取30例意外死亡者的颈内动脉壁作为正常对照。随机抽取210例动脉粥样硬化性脑梗塞病人的血白细胞用于CMV检查，动脉粥样硬化的诊断根据颈内动脉彩色B型多普勒超声检查来确定，有纤维斑块和钙化斑块者为Ⅲ级动脉粥样硬化。100例健康检查者的白细胞作为对照。
, 百拇医药
1.2 血细胞及组织样本的制备
1.2.1 血细胞 用淋巴细胞分离液分离沉淀白细胞, 然后加入50 μL DNA 提取液充分混匀, 沸水浴10 min，10 000 r/min 离心 5 min，去上清后备用。
1.2.2 组织 取液氮中冻存的组织约10 g，用锡纸包好，迅速砸碎，倒入研钵中，加液态氮，研成粉，将细粉加入50 mL试剂A (10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mmol/L EDTA pH 8.0, 10 mmol/L NaCl ), 在50℃轻轻搅拌并保温。4～5 h后将溶液冷却至4℃，加等体积的饱和酚，反复抽洗离心，取上清DNA再经反复抽提，离心、消化及透析，即得DNA溶液，储于4℃备用。
1.3 巨细胞病毒的检出方法——聚合酶链反应
取30 mL DNA提取物进行扩增。反应物包括10 mL Tris-HCl (pH 9.6), 10 mol/g MgCl2, 0.2 g/L BSA缓冲液，50 mmol NaCl, 1 mmol dATP, 1 mmol dGTP (Promeya 公司提供)，0.5 mg各种引物， 1 u热稳定聚合酶，2.5～5 mg DNA标本，反应物用20 mL石蜡油覆盖以防蒸发。93℃预热3 min，然后按93℃ 45 s → 55℃ 45 s → 72℃ 1 min，共做35个循环，最后置72℃保温5 min。从扩增的反应管中取10 mL下层兰色液体加样，经2%琼脂凝胶电泳20～30 min (5 V/cm) 后于紫外分光光度仪上观察，若在244 bp处出现橙黄色条带，则为CMV阳性。
, 百拇医药
1.4 统计学方法
用χ2和t检验, 如P<0.05则认为有显著性差异。
2 结 果
2.1 血细胞中巨细胞病毒的检出结果
从表1 (Table 1)可见，42.4%的Ⅲ级动脉粥样硬化病人的血中CMV阳性，与健康对照组比较有非常显著性差异(P<0.01)。
表1 血细胞中巨细胞病毒的分布情况
Table 1 Prevalence of CMV in the blood cells
Groups
Total
, http://www.100md.com
number
Positive
number
Positive
rate (%)
Control
100
3
3
As
210
89
42.4b
, http://www.100md.com
b: compared with control group, P<0.01.
2.2 动脉壁中巨细胞病毒的检出结果
从表2 (Table 2)中可见86.7%的粥样硬化颈动脉标本中发现CMV，83.3%的粥样硬化冠状动脉标本中发现CMV，两者之间相比尽管无差异，但与健康对照组6.7%的阳性率相比都有非常显著性差异(P<0.001)。表2 动脉壁中巨细胞病毒的分布情况
Table 2 Prevalence of CMV in the arterial wall Groups
Total
number
Positive
, http://www.100md.com
number
Positive
rate (%)
Control CA
30
2
6.7
As carotid A
30
26
86.7c
As coronary A
, http://www.100md.com
30
25
83.3c
CA： carotid arteries； A：arteries. c: compared with control carotid arteries group, P<0.001.
3 讨 论
已经证实脑梗塞和动脉粥样硬化有非常密切的关系，引起动脉粥样硬化发生的因素很多，如脂质代谢障碍，脂质浸润，动脉壁的功能异常，血流动力学因素，神经内分泌因素，吸烟及年龄、性别等，但至今仍未发现导致动脉粥样硬化的原发因素及可能机制。近几年国外有资料证实动脉粥样硬化与巨细胞病毒感染有关[1～3]，为此我们利用PCR技术系统地检查CMV在国人血和血管壁的分布情况，并证实巨细胞病毒和动脉粥样硬化有着密切的相关性。我们用PCR—一种非常敏感的方法在动脉粥样硬化病人的血细胞和动脉壁中检查CMV病毒，结果发现Ⅲ级动脉粥样硬化病人的血管壁中CMV的阳性率高达83.3%～86.7%，血细胞中也高达42.4%，此结果说明动脉粥样硬化性脑梗塞和CMV感染有非常密切的关系。通过表1和表2对比，动脉粥样硬化病人的血管壁中比血细胞中含CMV的比率更高，因此我们可以推论，CMV可能引起或参与了动脉粥样硬化的过程。CMV在血管壁中的活动可能导致反复的感染，引起血管壁结构和功能的改变，继发各种炎性细胞和脂质的浸润和沉积，最终导致动脉粥样硬化的形成。目前的证据已经证实这种假说，即CMV和动脉粥样硬化的病理过程有关，这包括： ①CMV在大众人群中广泛感染，在有损伤的血管壁中发现CMV；②承认CMV加速了动脉粥样硬化；③已证实CMV在鸡、人类单纯疮疹病毒在狒狒等动物脉血管壁平滑肌中可以诱发动脉粥样硬化，导致脂质沉积，因此CMV是动脉粥样硬化的诱发因素。
, 百拇医药
[作者简介] 胡立文，男，1964年出生，1988年青岛医学院医疗系毕业，1991年首都医科大学研究生班毕业，现任首都医科大学附属北京红十字朝阳医院神经内科主治医师。韦立新，男，河南省安阳县人，1957年12月出生，新乡医学院医疗系毕业，现任中国人民解放军总医院病理科主任医师、副主任，军医进修学院教授、中国病理生理学会动脉粥样硬化专业委员会委员、《中华病理学杂志》常务编委、《中国动脉硬化杂志》常务编委、《中国体视学及图像分析杂志》编委。
参考文献
[1] Lozinguez O, Arnard E, Velut JG, et al. Cytomegalovirus and arterial disease [J]. Arch Mal Coeur Vaiss, 1999, 92(9): 1 205-212
[2] Wanishsaward C, Zhou YF, Epstein SE. Chlamydia pneumoniae-induced transactivation of the major immediate early promoter of cytomegalovirus: potential synergy of infectious agents in the pathogenesis of atherosclerosis [J]. J Infect Dis, 2000, 181 (2): 787-790
, http://www.100md.com
[3] Zhou YF, Shou M, Harrell RF. Chronic non-vascular cytomegalovirus infection: effects on the neointimal response to experimental vascular injury [J]. Cardiovasc Res, 2000, 45(4): 1 019-025
[4] 郭福强, 黄开琼, 刘 杰. 动脉粥样硬化性脑梗塞和巨细胞病毒感染的关系[J]. 中国神经精神病杂志, 1997, 23(3)： 169-171
(此文2000-03-03收到，2000-07-16修回), 百拇医药
单位：胡文立(首都医科大学附属北京红十字朝阳医院神经内科，北京 100020)；刘敬忠(北京市基因诊断中心)；牛世芹(首都医科大学附属北京红十字朝阳医院神经内科，北京 100020)；刘旻(首都医科大学附属北京红十字朝阳医院神经内科，北京 100020)；石怀银(解放军总医院病理科)；韦立新(解放军总医院病理科)
关键词：巨细胞病毒；动脉粥样硬化；冠状动脉；颈动脉；血细胞；病人
中国动脉硬化杂志000320[摘 要] 为了研究巨细胞病毒和动脉粥样硬化的关系, 用聚合酶链反应方法检查了巨细胞病毒在颈内动脉、冠状动脉和血中的分布，并与健康人作了对照。 发现83.3%～86.7%的动脉粥样硬化病人的动脉壁中存在巨细胞病毒，而非动脉粥样硬化病人的动脉壁中只有6.7%的标本中见巨细胞病毒，两者相比有非常显著性差异(P<0.001)；在 42.4%的动脉粥样硬化病人的血细胞中查见巨细胞病毒，而对照组中只有3%查见了巨细胞病毒，两者相比有非常显著性差异(P<0.01)。因此认为巨细胞病毒在动脉粥样硬化、 冠心病和动脉粥样硬化性脑梗塞的病理过程中起着重要的作用。
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[中图分类号] R541.4 [文献标识码] A
[文章编号] 1007-3949(2000)-03-0263-03
Prevalence of Present Cytomegalovirus in the Atherosclerosis Arterial Walls and Leucocytes of the Patients with Coronary Heart Disease
HU Wen-Li，NU Shi-Qin，LIU Min
(Department of Neurology, Beijing Red Cross Chaoyang Hospital, Capital University of Medical Science, Beijing 100020, China)
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ABSTRACT Aim To study the association of cytomegalovirus (CMV) with atherosclerosis. Methods The present of cytomegalovirus (CMV) nucleic acids was demonstrated in carotid artery and coronary artery of patients with and without atherosclerosis by polymerase chain reaction (PCR), and detected CMV by PCR in the blood of cerebral infarction patients with and without atherosclerosis. Results 83.3%-86.7% of the samples obtained from atherosclerotic patients' arterial wall were shown to contain viral nucleic acids (CMV), among 6.6% of patients' arterial wall without atherosclerosis CMV could be found, significant deference can be found between them (P<0.01). In blood CMV could be found in 42.4% of patients with atherosclerosis, in the comparison only 3% of samples had CMV (P<0.01). Conclusion CMV plays an important role in the pathologic process of the atherosclerosis and the atherosclerotic cerebral infarction.
, http://www.100md.com
MeSH Cytomegalovirus； Atherosclerosis； Coronary Vessels; Carotid Arteries； Blood Cells； Patients
近几年国外有资料证实动脉粥样硬化与巨细胞病毒(cytomegalovirus， CMV)感染有关[1～3]，国内仅见个别报道动脉粥样硬化病人的血液中巨细胞病毒的抗体浓度偏高,尚未见直接检测病毒的报道[4]。我们这篇报道主要研究巨细胞病毒在动脉粥样硬化病人的血管壁、血液中的分布情况，并与非动脉粥样硬化病人做了对照研究。
1 对象与方法
1.1 对象与分组
动脉粥样硬化病人死亡后12 h内行尸体解剖，取30个病人的冠状动脉壁和30个病人的颈内动脉壁用作研究资料；另取30例意外死亡者的颈内动脉壁作为正常对照。随机抽取210例动脉粥样硬化性脑梗塞病人的血白细胞用于CMV检查，动脉粥样硬化的诊断根据颈内动脉彩色B型多普勒超声检查来确定，有纤维斑块和钙化斑块者为Ⅲ级动脉粥样硬化。100例健康检查者的白细胞作为对照。
, 百拇医药
1.2 血细胞及组织样本的制备
1.2.1 血细胞 用淋巴细胞分离液分离沉淀白细胞, 然后加入50 μL DNA 提取液充分混匀, 沸水浴10 min，10 000 r/min 离心 5 min，去上清后备用。
1.2.2 组织 取液氮中冻存的组织约10 g，用锡纸包好，迅速砸碎，倒入研钵中，加液态氮，研成粉，将细粉加入50 mL试剂A (10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mmol/L EDTA pH 8.0, 10 mmol/L NaCl ), 在50℃轻轻搅拌并保温。4～5 h后将溶液冷却至4℃，加等体积的饱和酚，反复抽洗离心，取上清DNA再经反复抽提，离心、消化及透析，即得DNA溶液，储于4℃备用。
1.3 巨细胞病毒的检出方法——聚合酶链反应
取30 mL DNA提取物进行扩增。反应物包括10 mL Tris-HCl (pH 9.6), 10 mol/g MgCl2, 0.2 g/L BSA缓冲液，50 mmol NaCl, 1 mmol dATP, 1 mmol dGTP (Promeya 公司提供)，0.5 mg各种引物， 1 u热稳定聚合酶，2.5～5 mg DNA标本，反应物用20 mL石蜡油覆盖以防蒸发。93℃预热3 min，然后按93℃ 45 s → 55℃ 45 s → 72℃ 1 min，共做35个循环，最后置72℃保温5 min。从扩增的反应管中取10 mL下层兰色液体加样，经2%琼脂凝胶电泳20～30 min (5 V/cm) 后于紫外分光光度仪上观察，若在244 bp处出现橙黄色条带，则为CMV阳性。
, 百拇医药
1.4 统计学方法
用χ2和t检验, 如P<0.05则认为有显著性差异。
2 结 果
2.1 血细胞中巨细胞病毒的检出结果
从表1 (Table 1)可见，42.4%的Ⅲ级动脉粥样硬化病人的血中CMV阳性，与健康对照组比较有非常显著性差异(P<0.01)。
表1 血细胞中巨细胞病毒的分布情况
Table 1 Prevalence of CMV in the blood cells
Groups
Total
, http://www.100md.com
number
Positive
number
Positive
rate (%)
Control
100
3
3
As
210
89
42.4b
, http://www.100md.com
b: compared with control group, P<0.01.
2.2 动脉壁中巨细胞病毒的检出结果
从表2 (Table 2)中可见86.7%的粥样硬化颈动脉标本中发现CMV，83.3%的粥样硬化冠状动脉标本中发现CMV，两者之间相比尽管无差异，但与健康对照组6.7%的阳性率相比都有非常显著性差异(P<0.001)。表2 动脉壁中巨细胞病毒的分布情况
Table 2 Prevalence of CMV in the arterial wall Groups
Total
number
Positive
, http://www.100md.com
number
Positive
rate (%)
Control CA
30
2
6.7
As carotid A
30
26
86.7c
As coronary A
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83.3c
CA： carotid arteries； A：arteries. c: compared with control carotid arteries group, P<0.001.
3 讨 论
已经证实脑梗塞和动脉粥样硬化有非常密切的关系，引起动脉粥样硬化发生的因素很多，如脂质代谢障碍，脂质浸润，动脉壁的功能异常，血流动力学因素，神经内分泌因素，吸烟及年龄、性别等，但至今仍未发现导致动脉粥样硬化的原发因素及可能机制。近几年国外有资料证实动脉粥样硬化与巨细胞病毒感染有关[1～3]，为此我们利用PCR技术系统地检查CMV在国人血和血管壁的分布情况，并证实巨细胞病毒和动脉粥样硬化有着密切的相关性。我们用PCR—一种非常敏感的方法在动脉粥样硬化病人的血细胞和动脉壁中检查CMV病毒，结果发现Ⅲ级动脉粥样硬化病人的血管壁中CMV的阳性率高达83.3%～86.7%，血细胞中也高达42.4%，此结果说明动脉粥样硬化性脑梗塞和CMV感染有非常密切的关系。通过表1和表2对比，动脉粥样硬化病人的血管壁中比血细胞中含CMV的比率更高，因此我们可以推论，CMV可能引起或参与了动脉粥样硬化的过程。CMV在血管壁中的活动可能导致反复的感染，引起血管壁结构和功能的改变，继发各种炎性细胞和脂质的浸润和沉积，最终导致动脉粥样硬化的形成。目前的证据已经证实这种假说，即CMV和动脉粥样硬化的病理过程有关，这包括： ①CMV在大众人群中广泛感染，在有损伤的血管壁中发现CMV；②承认CMV加速了动脉粥样硬化；③已证实CMV在鸡、人类单纯疮疹病毒在狒狒等动物脉血管壁平滑肌中可以诱发动脉粥样硬化，导致脂质沉积，因此CMV是动脉粥样硬化的诱发因素。
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[作者简介] 胡立文，男，1964年出生，1988年青岛医学院医疗系毕业，1991年首都医科大学研究生班毕业，现任首都医科大学附属北京红十字朝阳医院神经内科主治医师。韦立新，男，河南省安阳县人，1957年12月出生，新乡医学院医疗系毕业，现任中国人民解放军总医院病理科主任医师、副主任，军医进修学院教授、中国病理生理学会动脉粥样硬化专业委员会委员、《中华病理学杂志》常务编委、《中国动脉硬化杂志》常务编委、《中国体视学及图像分析杂志》编委。
参考文献
[1] Lozinguez O, Arnard E, Velut JG, et al. Cytomegalovirus and arterial disease [J]. Arch Mal Coeur Vaiss, 1999, 92(9): 1 205-212
[2] Wanishsaward C, Zhou YF, Epstein SE. Chlamydia pneumoniae-induced transactivation of the major immediate early promoter of cytomegalovirus: potential synergy of infectious agents in the pathogenesis of atherosclerosis [J]. J Infect Dis, 2000, 181 (2): 787-790
, http://www.100md.com
[3] Zhou YF, Shou M, Harrell RF. Chronic non-vascular cytomegalovirus infection: effects on the neointimal response to experimental vascular injury [J]. Cardiovasc Res, 2000, 45(4): 1 019-025
[4] 郭福强, 黄开琼, 刘 杰. 动脉粥样硬化性脑梗塞和巨细胞病毒感染的关系[J]. 中国神经精神病杂志, 1997, 23(3)： 169-171
(此文2000-03-03收到，2000-07-16修回), 百拇医药