类风湿关节炎中尿激酶型纤溶酶原激活物及其受体蛋白和基因的表达
作者：杨春花 黄烽
单位：杨春花(100853 北京，解放军总医院风湿科)；黄烽(100853 北京，解放军总医院风湿科)
关键词：关节炎，类风湿；骨关节炎；尿激酶；原位杂交；免疫组织化学
中华风湿病学杂志000309 【摘 要】 目的 检测尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及其受体(uPAR)蛋白和mRNA在类风湿关节炎(RA)的表达，探讨uPA、uPAR基因在RA细胞外基质降解中的作用。方法 采用免疫组化和cDNA-mRNA原位分子杂交技术分别检测了24例RA、18例骨关节炎(OA)和6例正常滑膜组织中uPA、uPAR蛋白和mRNA的分布及表达情况。结果 24例RA滑膜组织均呈uPA、uPAR蛋白和mRNA的阳性表达，uPA、uPAR蛋白的强阳性率高于mRNA。uPA、uPAR蛋白和mRNA阳性信号主要分布在RA滑膜衬里细胞、滑膜下层单核细胞、巨噬细胞样细胞及血管内皮细胞；18例OA滑膜组织中，uPA、uPAR蛋白和mRNA的表达部位类似于RA，但阳性率、阳性程度及分布范围均明显低于RA滑膜组织，两组之间蛋白和mRNA表达的差异均有显著性(P0.01或P0.001)。6例正常滑膜组织呈阴性反应。结论 RA滑膜组织存在高水平uPA、uPAR蛋白和mRNA的表达，提示在RA的发生发展过程中，uPA和uPAR基因起着重要作用；RA和OA中uPA、uPAR基因表达水平的差异，可能与这两种疾病软骨和骨基质降解的程度及进程等临床表现密切相关。
, 百拇医药
Expression of urokinase-type plasminogen activator and its receptor in rheumatoid arthritis
YANG Chunhua,HUANG Feng
(Department of Rheumatology,General Hospital of PLA,Beijing 100853,China)
【Abstract】 Objective To study the expression of urokinase-type plasminogen activator (uPA) and its receptor (uPAR) in protein and gene levels ,and the significance of uPA and uPAR gene in degradation of extracellular matrices in rheumatoid arthritis (RA).Methods Immunohistochemical analysis and in situ hybridization technique were used to detect uPA and uPAR expression and distribution in protein and gene levels in synovial tissues from 24 patiens with RA,18 with osteoarthritis (OA) and 6 from normal synovial tissues.Results Positive staining of uPA and uPAR proteins and mRNA were seen in all 24 cases of RA synovial tissuses,but strong positive rates of uPA and uPAR proteins were higher than their mRNA.Positive expression of uPA and uPAR proteins and mRNA were found in synovial lining cells,mononuclear cells,macrophage-like cells and endothelial cells;In 18 cases of OA synovial tissuse,the sites of positive expression of uPA and uPAR proteins and mRNA were similar to RA,but its positive rate,degree and distribution were significantly lower than RA synovial tissues (P0.01 or P0.001),and 6 cases of normal synovial tissues was negative.Conclusion There are high expressions of uPA and uPAR protein and mRNA in RA synovial tissues,indicating that uPA and uPAR genes may play an important role in the genesis and development of RA;There are different expressions between RA and OA of uPA and uPAR genes,suggesting that the difference may have a closely relation with some clinical manifestations such as the degree and progress of degradation of articular cartilage and bone matrix in RA and OA.
, 百拇医药
【Key words】 Arthritis,rheumatoid;Osteoarthritis;Urokinase;In situ hybridization;Immunohistochemistry
类风湿关节炎(RA)是一种慢性炎性疾病，其主要病理特征是滑膜细胞高度增生并伴有大量淋巴细胞浸润形成血管翳，血管翳向邻近软骨和骨组织侵袭，导致软骨和骨的破坏，而软骨和骨组织破坏的首要步骤和分子基础则是软骨基质的降解，最终导致进行性的关节软骨和骨的破坏。研究表明，尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)介导的细胞外基质蛋白裂解作用与炎性关节疾病中关节软骨和骨的破坏密切相关[1]。国内对uPA系统与RA的关系研究甚少，国外已有一些该方面报道，但尚未达成共识。为此，本文应用免疫组织化学和原位杂交技术对24例RA和18例骨关节炎(OA)滑膜组织中uPA、uPAR蛋白和mRNA的分布及表达情况进行了研究，旨在从蛋白和mRNA表达两方面探讨RA发生发展过程中，uPA、uPAR基因的作用及其临床意义，为寻找新的RA治疗途径提供依据。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 一般资料：24例RA和18例OA滑膜组织均取自解放军总医院手术切除标本，经常规甲醛固定，石蜡包埋，均经病理组织学检查确诊。RA诊断均符合美国风湿病协会1987年RA诊断标准。OA诊断均符合1991年Altman诊断标准[2]。正常滑膜组织均取自无关节病变的截肢患者。
1.2 组织学检测：用常规苏木素-伊红(HE)染色。
1.3 免疫组织化学检测：主要试剂为SP试剂盒(ZYMED公司)，抗uPA、uPAR鼠单克隆抗体工作浓度分别为1∶100和1∶200(抗体购自上海医科大学分子遗传学研究室)，磷酸缓冲液(PBS)0.01 mol/L，pH 7.4，DAB显色液0.04%。采用常规SP法。结果判断：①结合HE切片，根据苏木素复染后的细胞形态，请病理学专家鉴别滑膜组织中的不同细胞类型；②凡细胞质和(或)细胞膜中出现明显的棕色或棕黄色颗粒为uPA或uPAR蛋白阳性细胞；③参照Szekanecz等[3]的方法根据400倍的高倍镜视野下滑膜组织中的阳性细胞占全部细胞(包括：滑膜衬里细胞，滑膜下层单核细胞、巨噬细胞样细胞及血管内皮细胞)的比例分为：阴性(-)：无阳性细胞或阳性细胞数<10%；阳性(+)：阳性细胞占10%～40%；阳性(
)：40%～70%；阳性(
)>70%。
, 百拇医药
1.4 探针制备：实验所用的uPA和uPAR cDNA探针分别来自载有人uPA cDNA 387 bp Acc I-Bg L Ⅱ片段的PGEM-4Z重组质粒和载有人uPAR cDNA 585 bp BamH Ⅰ片段的PGEM-3Z重组质粒(澳大利亚国立大学王耀教授惠赠)。制备重组质粒DNA，经相应酶切，纯化uPA及uPAR cDNA片段，应用光敏生物素标记。标记方法按军事医学科学院放射医学研究所提供的光敏生物素标记试剂盒操作说明实施。
1.5 原位杂交：按文献[4]方法实施原位杂交检测，BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐)-NBT(硝基四氮唑蓝)显色，光学显微镜下观察，凡细胞质中出现紫蓝色颗粒为阳性杂交信号。阳性强度判断同uPA、uPAR蛋白免疫组织化学的标准。原位杂交实验中，每份标本同时做阴性对照检测，包括杂交液内不加探针进行杂交及先经RNase处理后再进行杂交。
1.6 统计学处理：采用两样本构成比(率)比较的χ2检验。
, 百拇医药
2 结果
2.1 免疫组织化学结果：uPA蛋白阳性反应定位于细胞质，呈黄色或棕黄色颗粒，24例RA中均检测出了uPA蛋白阳性表达，其中()19例(79.2%)；()3例(12.5%)；(+)2例(8.3%)。uPA蛋白阳性细胞主要分布在滑膜衬里层和滑膜下层。其中滑膜衬里细胞、巨噬细胞样细胞、单核细胞和部分浸润的浆细胞细胞质中呈明显的阳性染色；大部分滑膜下层的小血管内皮细胞亦呈阳性染色(图1)。18例OA中，uPA蛋白阳性13例，其中()5例(27.7%)；(+)8例(44.4%)；(-)5例(27.7%)。呈阳性染色的主要是滑膜衬里细胞及滑膜下层单核细胞(图2)。uPAR蛋白阳性信号主要定位于细胞质，少部分定位于细胞膜上，24例RA滑膜组织均出现了uPAR蛋白阳性染色信号，其中，()17例(70.8%)；()6例(25.0%)；(+)1例(4.2%)。阳性信号主要分布在滑膜衬里细胞及滑膜深层的一些单核细胞和血管内皮细胞上(图3)。18例OA中，(+)5例(27.8%)，且阳性信号主要定位在间质的单核细胞，其余组织均末检出阳性染色信号。正常滑膜组织中未检测到阳性蛋白反应。
, 百拇医药
2.2 原位杂交结果：uPA、uPAR mRNA原位杂交信号均出现在细胞质中，呈蓝色或紫蓝色颗粒，弥漫分布。对照样本均未出现阳性杂交信号。24例RA中均检出uPA、uPAR mRNA阳性杂交信号，其中uPA mRNA()14例(58.3%)；()6例(25.0%)；(+)4例(16.7%)。uPAR mRNA()13例(54.2%)；()5例(20.8%)；(+)6例(25.0%)。18例OA中，呈uPA、uPAR mRNA阳性反应的分别有()7例(38.8%)和(+)3例(16.7%)。在RA和OA中uPA、uPAR mRNA阳性细胞的分布与其相应蛋白分布基本一致(图4、5)。正常滑膜组织中未检测到阳性杂交信号。
, 百拇医药
图1 RA滑膜呈uPA蛋白阳性反应 SP免疫组织化学法×200
图2 OA滑膜呈uPA蛋白阳性反应 SP免疫组织化学法×200
图3 RA滑膜呈uPAR蛋白阳性反应 SP免疫组织化学法×200
图4 原位杂交检测显示RA滑膜组织呈uPAmRNA阳性染色×400
图5 原位杂交检测显示RA滑膜组织呈uPAmRNA阳性染色 ×400
, 百拇医药
2.3 uPA、uPAR蛋白和mRNA阳性结果比较：由表1可见，uPA、uPAR蛋白和mRNA的表达在RA和OA两组中差异均显示出极显著性(P<0.01或P<0.001)；此外，本实验还观察到凡在uPA、uPAR mRNA表达阳性的病例，uPA、uPAR蛋白亦阳性，但uPA、uPAR mRNA表达的强阳性率均低于uPA、uPAR蛋白表达的强阳性率。
表1 uPA uPAR在RA OA滑膜组织中蛋白和
mRNA阳性例数(阳性率)比较 组别
例数
uPA
uPAR
蛋白
mRNA
, 百拇医药
蛋白
mRNA
RA
24
24(100%)
24(100%)
24(100%)
24(100%)
OA
18
13(72%)*
7(39%)**
, http://www.100md.com
5(28%)**
3(17%)**
注：*P<0.01，**P<0.001
3 讨论
关节炎研究领域的最新进展已经受到广泛关注的是与细胞外基质成分降解相关的几种酶系统。目前在RA病理生理过程中发挥重要作用的两种蛋白酶为金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶系统。研究表明，uPA介导的纤维蛋白溶解系统与此密切相关[5]。uPA是一种丝氨酸蛋白酶，通常是以无活性的单链形式uPA前体(pro-uPA)从细胞中释放出来，再转变成有活性的双链分子。细胞表面的uPAR是uPA的特异性受体，对无活性的pro-uPA及有活性的uPA均有高度亲合力。uPAR与uPA高效结合后，将uPA浓集于细胞表面，参与细胞外基质(ECM)和基底膜成分的蛋白水解过程[6]。
, 百拇医药
多种方法己被用来揭示RA中uPA、uPAR的作用，在体外培养的细胞和组织移植实验中均已证实RA中的滑膜细胞、成纤维细胞、软骨细胞、内皮细胞、单核细胞和多形核白细胞均能合成uPA、uPAR等多种成分[7，8]。本文从mRNA和蛋白两种水平检测了RA和OA滑膜组织中uPA、uPAR的表达水平、定位和分布，结果显示，滑膜衬里细胞、滑膜下层单核细胞、巨噬细胞样细胞及血管内皮细胞均呈现uPA、uPAR蛋白和mRNA的表达，但RA滑膜组织中的表达水平明显高于OA，其中RA滑膜衬里细胞呈明显的强阳性表达，这说明构成RA血管翳的滑膜细胞具有高表达uPA、uPAR基因的能力，使降解细胞外基质和基底膜成分的能力明显增强，导致关节软骨和骨的破坏。同时，RA和OA中uPA、uPAR基因表达水平的差异，可能与这两种疾病的发病机制不同有关。国外学者通过ELISA方法分析发现RA患者滑液和血浆中uPA、uPAR的蛋白含量明显高于OA，并且滑液中uPA、uPAR的抗原活性的增高程度与临床上RA的病情活动性和软骨及骨破坏的放射线表现密切相关[9]。进一步支持了uPA系统在RA基质降解的重要作用。
, 百拇医药
uPA可以通过多种途径来调节滑膜炎症、血管生成和关节破坏，并且uPA还与炎性细胞进入滑膜组织的再循环过程有关，因为uPA作为炎性细胞的趋化因子能够刺激细胞因子依赖性的单核细胞附着。uPAR被认为是单核细胞的激活抗原，它与巨噬细胞分化、细胞外蛋白水解、粘附ECM和刺激基质金属蛋白酶(MMP)的产生有关。uPA和uPAR与其他炎性介质在关节滑膜上相互作用，共同促进其表达，uPA本身就可以增加单核细胞上uPAR的数量，导致滑膜局部炎症的长期存在、蛋白裂解和血管生成。本研究发现，RA滑膜组织中的uPA、uPAR蛋白和mRNA的表达水平具有良好的协同性，在uPA表达强阳性的病例，uPAR表达亦呈强阳性，这进一步支持了uPA、uPAR在炎症部位具有相互促进作用，这可能是因为在uPA系统介导的纤溶降解过程中，uPA和uPAR基因的协同高表达可促使滑膜细胞等具有免疫活性的细胞具有更高的增生活性和更大的破坏力，以适应其蛋白溶解活动的需要。
(本文图1～5见插页图第4页)
, 百拇医药 参 考 文 献
1,Ronday HK,Smits HH,Quax PH,et al.Bone matrix degradation by the plasminogen activator system:possible mechanism of bone destruction in arthritis.Br J Rheumatol,1997,36:9-15.
2,Altman RD.Criteria for classification of clinical osteoarthritis.J Rheumatol,1991,18:10-12.
3,Szekanecz Z,Haines GK,Koch AE.Differential expression of the urokinase receptor (CD87) in arthritic and normal synovial tissues.J Clin Pathol,1997,50:314-319.
, http://www.100md.com
4,谷志远，宋海静，谈代明，等.原位杂交法检测女阴尖锐湿疣中HPV-DNA及其定位.中华皮肤科杂志，1992，25：389-391.
5,Kikuchi H,Shinmada W,Nonaka T,et al.Significance of serine proteinase and matrix metalloproteinase systems in the destruction of human articular artilage.Clin Exp Pharmacol Physiol,1996,23:885-889.
6,Wang Y,Dang J,Johnson IK,et al.Structure of the human urokinase receptor gene and its similiarity to CD59 and the LY-6 family.Eur J Biochem,1995,227:116-122.
, 百拇医药
7,Kirchheimer JC,Remold HG,Wanivenhaus A,et al.Increased proteolytic on the surface of monocytes from patients with rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum,1991,34:1430-1433.
8,Hamilton JA,Hart PH,Leizer T,et al.Regulation of plasminogen activator activity in arthritic joints.J Reumatol,1991,18(Suppl 27):106-109.
9,Brommer EJ,Dooijeward G,Dijkmans BA,et al.Depression of tissue-type plasminogen activator and enhancement of urokinase-type plasminogen activator as an expression of local inflammation.Thrombosis Haemostasis,1992,68:180-184.
(收稿日期：1999-12-15), 百拇医药
单位：杨春花(100853 北京，解放军总医院风湿科)；黄烽(100853 北京，解放军总医院风湿科)
关键词：关节炎，类风湿；骨关节炎；尿激酶；原位杂交；免疫组织化学
中华风湿病学杂志000309 【摘 要】 目的 检测尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及其受体(uPAR)蛋白和mRNA在类风湿关节炎(RA)的表达，探讨uPA、uPAR基因在RA细胞外基质降解中的作用。方法 采用免疫组化和cDNA-mRNA原位分子杂交技术分别检测了24例RA、18例骨关节炎(OA)和6例正常滑膜组织中uPA、uPAR蛋白和mRNA的分布及表达情况。结果 24例RA滑膜组织均呈uPA、uPAR蛋白和mRNA的阳性表达，uPA、uPAR蛋白的强阳性率高于mRNA。uPA、uPAR蛋白和mRNA阳性信号主要分布在RA滑膜衬里细胞、滑膜下层单核细胞、巨噬细胞样细胞及血管内皮细胞；18例OA滑膜组织中，uPA、uPAR蛋白和mRNA的表达部位类似于RA，但阳性率、阳性程度及分布范围均明显低于RA滑膜组织，两组之间蛋白和mRNA表达的差异均有显著性(P0.01或P0.001)。6例正常滑膜组织呈阴性反应。结论 RA滑膜组织存在高水平uPA、uPAR蛋白和mRNA的表达，提示在RA的发生发展过程中，uPA和uPAR基因起着重要作用；RA和OA中uPA、uPAR基因表达水平的差异，可能与这两种疾病软骨和骨基质降解的程度及进程等临床表现密切相关。
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Expression of urokinase-type plasminogen activator and its receptor in rheumatoid arthritis
YANG Chunhua,HUANG Feng
(Department of Rheumatology,General Hospital of PLA,Beijing 100853,China)
【Abstract】 Objective To study the expression of urokinase-type plasminogen activator (uPA) and its receptor (uPAR) in protein and gene levels ,and the significance of uPA and uPAR gene in degradation of extracellular matrices in rheumatoid arthritis (RA).Methods Immunohistochemical analysis and in situ hybridization technique were used to detect uPA and uPAR expression and distribution in protein and gene levels in synovial tissues from 24 patiens with RA,18 with osteoarthritis (OA) and 6 from normal synovial tissues.Results Positive staining of uPA and uPAR proteins and mRNA were seen in all 24 cases of RA synovial tissuses,but strong positive rates of uPA and uPAR proteins were higher than their mRNA.Positive expression of uPA and uPAR proteins and mRNA were found in synovial lining cells,mononuclear cells,macrophage-like cells and endothelial cells;In 18 cases of OA synovial tissuse,the sites of positive expression of uPA and uPAR proteins and mRNA were similar to RA,but its positive rate,degree and distribution were significantly lower than RA synovial tissues (P0.01 or P0.001),and 6 cases of normal synovial tissues was negative.Conclusion There are high expressions of uPA and uPAR protein and mRNA in RA synovial tissues,indicating that uPA and uPAR genes may play an important role in the genesis and development of RA;There are different expressions between RA and OA of uPA and uPAR genes,suggesting that the difference may have a closely relation with some clinical manifestations such as the degree and progress of degradation of articular cartilage and bone matrix in RA and OA.
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【Key words】 Arthritis,rheumatoid;Osteoarthritis;Urokinase;In situ hybridization;Immunohistochemistry
类风湿关节炎(RA)是一种慢性炎性疾病，其主要病理特征是滑膜细胞高度增生并伴有大量淋巴细胞浸润形成血管翳，血管翳向邻近软骨和骨组织侵袭，导致软骨和骨的破坏，而软骨和骨组织破坏的首要步骤和分子基础则是软骨基质的降解，最终导致进行性的关节软骨和骨的破坏。研究表明，尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)介导的细胞外基质蛋白裂解作用与炎性关节疾病中关节软骨和骨的破坏密切相关[1]。国内对uPA系统与RA的关系研究甚少，国外已有一些该方面报道，但尚未达成共识。为此，本文应用免疫组织化学和原位杂交技术对24例RA和18例骨关节炎(OA)滑膜组织中uPA、uPAR蛋白和mRNA的分布及表达情况进行了研究，旨在从蛋白和mRNA表达两方面探讨RA发生发展过程中，uPA、uPAR基因的作用及其临床意义，为寻找新的RA治疗途径提供依据。
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1 资料与方法
1.1 一般资料：24例RA和18例OA滑膜组织均取自解放军总医院手术切除标本，经常规甲醛固定，石蜡包埋，均经病理组织学检查确诊。RA诊断均符合美国风湿病协会1987年RA诊断标准。OA诊断均符合1991年Altman诊断标准[2]。正常滑膜组织均取自无关节病变的截肢患者。
1.2 组织学检测：用常规苏木素-伊红(HE)染色。
1.3 免疫组织化学检测：主要试剂为SP试剂盒(ZYMED公司)，抗uPA、uPAR鼠单克隆抗体工作浓度分别为1∶100和1∶200(抗体购自上海医科大学分子遗传学研究室)，磷酸缓冲液(PBS)0.01 mol/L，pH 7.4，DAB显色液0.04%。采用常规SP法。结果判断：①结合HE切片，根据苏木素复染后的细胞形态，请病理学专家鉴别滑膜组织中的不同细胞类型；②凡细胞质和(或)细胞膜中出现明显的棕色或棕黄色颗粒为uPA或uPAR蛋白阳性细胞；③参照Szekanecz等[3]的方法根据400倍的高倍镜视野下滑膜组织中的阳性细胞占全部细胞(包括：滑膜衬里细胞，滑膜下层单核细胞、巨噬细胞样细胞及血管内皮细胞)的比例分为：阴性(-)：无阳性细胞或阳性细胞数<10%；阳性(+)：阳性细胞占10%～40%；阳性(
)：40%～70%；阳性()>70%。, 百拇医药
1.4 探针制备：实验所用的uPA和uPAR cDNA探针分别来自载有人uPA cDNA 387 bp Acc I-Bg L Ⅱ片段的PGEM-4Z重组质粒和载有人uPAR cDNA 585 bp BamH Ⅰ片段的PGEM-3Z重组质粒(澳大利亚国立大学王耀教授惠赠)。制备重组质粒DNA，经相应酶切，纯化uPA及uPAR cDNA片段，应用光敏生物素标记。标记方法按军事医学科学院放射医学研究所提供的光敏生物素标记试剂盒操作说明实施。
1.5 原位杂交：按文献[4]方法实施原位杂交检测，BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐)-NBT(硝基四氮唑蓝)显色，光学显微镜下观察，凡细胞质中出现紫蓝色颗粒为阳性杂交信号。阳性强度判断同uPA、uPAR蛋白免疫组织化学的标准。原位杂交实验中，每份标本同时做阴性对照检测，包括杂交液内不加探针进行杂交及先经RNase处理后再进行杂交。
1.6 统计学处理：采用两样本构成比(率)比较的χ2检验。
, 百拇医药
2 结果
2.1 免疫组织化学结果：uPA蛋白阳性反应定位于细胞质，呈黄色或棕黄色颗粒，24例RA中均检测出了uPA蛋白阳性表达，其中(
)19例(79.2%)；()3例(12.5%)；(+)2例(8.3%)。uPA蛋白阳性细胞主要分布在滑膜衬里层和滑膜下层。其中滑膜衬里细胞、巨噬细胞样细胞、单核细胞和部分浸润的浆细胞细胞质中呈明显的阳性染色；大部分滑膜下层的小血管内皮细胞亦呈阳性染色(图1)。18例OA中，uPA蛋白阳性13例，其中()5例(27.7%)；(+)8例(44.4%)；(-)5例(27.7%)。呈阳性染色的主要是滑膜衬里细胞及滑膜下层单核细胞(图2)。uPAR蛋白阳性信号主要定位于细胞质，少部分定位于细胞膜上，24例RA滑膜组织均出现了uPAR蛋白阳性染色信号，其中，()17例(70.8%)；()6例(25.0%)；(+)1例(4.2%)。阳性信号主要分布在滑膜衬里细胞及滑膜深层的一些单核细胞和血管内皮细胞上(图3)。18例OA中，(+)5例(27.8%)，且阳性信号主要定位在间质的单核细胞，其余组织均末检出阳性染色信号。正常滑膜组织中未检测到阳性蛋白反应。, 百拇医药
2.2 原位杂交结果：uPA、uPAR mRNA原位杂交信号均出现在细胞质中，呈蓝色或紫蓝色颗粒，弥漫分布。对照样本均未出现阳性杂交信号。24例RA中均检出uPA、uPAR mRNA阳性杂交信号，其中uPA mRNA(
)14例(58.3%)；()6例(25.0%)；(+)4例(16.7%)。uPAR mRNA()13例(54.2%)；()5例(20.8%)；(+)6例(25.0%)。18例OA中，呈uPA、uPAR mRNA阳性反应的分别有()7例(38.8%)和(+)3例(16.7%)。在RA和OA中uPA、uPAR mRNA阳性细胞的分布与其相应蛋白分布基本一致(图4、5)。正常滑膜组织中未检测到阳性杂交信号。, 百拇医药
图1 RA滑膜呈uPA蛋白阳性反应 SP免疫组织化学法×200
图2 OA滑膜呈uPA蛋白阳性反应 SP免疫组织化学法×200
图3 RA滑膜呈uPAR蛋白阳性反应 SP免疫组织化学法×200
图4 原位杂交检测显示RA滑膜组织呈uPAmRNA阳性染色×400
图5 原位杂交检测显示RA滑膜组织呈uPAmRNA阳性染色 ×400
, 百拇医药
2.3 uPA、uPAR蛋白和mRNA阳性结果比较：由表1可见，uPA、uPAR蛋白和mRNA的表达在RA和OA两组中差异均显示出极显著性(P<0.01或P<0.001)；此外，本实验还观察到凡在uPA、uPAR mRNA表达阳性的病例，uPA、uPAR蛋白亦阳性，但uPA、uPAR mRNA表达的强阳性率均低于uPA、uPAR蛋白表达的强阳性率。
表1 uPA uPAR在RA OA滑膜组织中蛋白和
mRNA阳性例数(阳性率)比较 组别
例数
uPA
uPAR
蛋白
mRNA
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蛋白
mRNA
RA
24
24(100%)
24(100%)
24(100%)
24(100%)
OA
18
13(72%)*
7(39%)**
, http://www.100md.com
5(28%)**
3(17%)**
注：*P<0.01，**P<0.001
3 讨论
关节炎研究领域的最新进展已经受到广泛关注的是与细胞外基质成分降解相关的几种酶系统。目前在RA病理生理过程中发挥重要作用的两种蛋白酶为金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶系统。研究表明，uPA介导的纤维蛋白溶解系统与此密切相关[5]。uPA是一种丝氨酸蛋白酶，通常是以无活性的单链形式uPA前体(pro-uPA)从细胞中释放出来，再转变成有活性的双链分子。细胞表面的uPAR是uPA的特异性受体，对无活性的pro-uPA及有活性的uPA均有高度亲合力。uPAR与uPA高效结合后，将uPA浓集于细胞表面，参与细胞外基质(ECM)和基底膜成分的蛋白水解过程[6]。
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多种方法己被用来揭示RA中uPA、uPAR的作用，在体外培养的细胞和组织移植实验中均已证实RA中的滑膜细胞、成纤维细胞、软骨细胞、内皮细胞、单核细胞和多形核白细胞均能合成uPA、uPAR等多种成分[7，8]。本文从mRNA和蛋白两种水平检测了RA和OA滑膜组织中uPA、uPAR的表达水平、定位和分布，结果显示，滑膜衬里细胞、滑膜下层单核细胞、巨噬细胞样细胞及血管内皮细胞均呈现uPA、uPAR蛋白和mRNA的表达，但RA滑膜组织中的表达水平明显高于OA，其中RA滑膜衬里细胞呈明显的强阳性表达，这说明构成RA血管翳的滑膜细胞具有高表达uPA、uPAR基因的能力，使降解细胞外基质和基底膜成分的能力明显增强，导致关节软骨和骨的破坏。同时，RA和OA中uPA、uPAR基因表达水平的差异，可能与这两种疾病的发病机制不同有关。国外学者通过ELISA方法分析发现RA患者滑液和血浆中uPA、uPAR的蛋白含量明显高于OA，并且滑液中uPA、uPAR的抗原活性的增高程度与临床上RA的病情活动性和软骨及骨破坏的放射线表现密切相关[9]。进一步支持了uPA系统在RA基质降解的重要作用。
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uPA可以通过多种途径来调节滑膜炎症、血管生成和关节破坏，并且uPA还与炎性细胞进入滑膜组织的再循环过程有关，因为uPA作为炎性细胞的趋化因子能够刺激细胞因子依赖性的单核细胞附着。uPAR被认为是单核细胞的激活抗原，它与巨噬细胞分化、细胞外蛋白水解、粘附ECM和刺激基质金属蛋白酶(MMP)的产生有关。uPA和uPAR与其他炎性介质在关节滑膜上相互作用，共同促进其表达，uPA本身就可以增加单核细胞上uPAR的数量，导致滑膜局部炎症的长期存在、蛋白裂解和血管生成。本研究发现，RA滑膜组织中的uPA、uPAR蛋白和mRNA的表达水平具有良好的协同性，在uPA表达强阳性的病例，uPAR表达亦呈强阳性，这进一步支持了uPA、uPAR在炎症部位具有相互促进作用，这可能是因为在uPA系统介导的纤溶降解过程中，uPA和uPAR基因的协同高表达可促使滑膜细胞等具有免疫活性的细胞具有更高的增生活性和更大的破坏力，以适应其蛋白溶解活动的需要。
(本文图1～5见插页图第4页)
, 百拇医药 参 考 文 献
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(收稿日期：1999-12-15), 百拇医药