狼疮肾炎患者外周血单个核细胞内白细胞介素-6 gp80与gp130基因表达的研究
作者：曾丽霞 孙林 叶任高 许韩师 陆才生 李幼姬 周飞宇 尹培达
单位：曾丽霞(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾内科)；孙林(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾内科)；叶任高(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾内科)；许韩师(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾内科)；陆才生(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾内科)；李幼姬(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾内科)
关键词：狼疮肾炎；白细胞，单核；白细胞介素6；gp80；gp130；聚合酶链反应，逆转录
中华风湿病学杂志000305 【摘 要】 目的 了解狼疮肾炎(LN)患者外周血单个核细胞(PBMCs)白细胞介素-6(IL-6)与IL-6受体(gp80与gp130)的mRNA表达情况，并分析它们之间及其与自身抗体的关系。方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测18例活动期LN患者、16例非活动期LN患者和10名正常人PBMCs内IL-6、gp80与gp130的mRNA表达水平。结果 ①活动期LN患者、非活动期LN患者及正常人PBMCs IL-6 mRNA检出阳性率各为72.2%、37.5%和10.0%，前者显著高于后两者，而后两者PBMCs IL-6 mRNA的检出阳性率差异则无显著性；这三组人群PBMCs内gp80 mRNA与gp130 mRNA的检出阳性率均无统计学差异。②活动期LN患者PBMCs中IL-6 mRNA表达水平高于非活动期LN患者，后者又高于正常人；活动期LN患者PBMCs中有较高水平的gp80 mRNA与gp130 mRNA表达，而非活动期LN患者PBMCs gp80 mRNA与gp130 mRNA表达水平，与正常对照比较则无统计学差异。③活动期LN患者PBMCs内IL-6 mRNA、gp80 mRNA和gp130 mRNA相对表达水平互呈正相关，但在非活动期LN患者中则未见这种正相关关系。活动期LN患者PBMCs内IL-6、gp80和gp130基因表达水平与血清ANA、抗ds-DNA抗体和抗Sm抗体均无显著的相关性。结论 活动期LN患者PBMCs内IL-6及其受体gp80和gp130的mRNA表达均上调，且受体gp80和gp130的mRNA表达上调可能是其PBMCs内源性过多产生IL-6所致。
, 百拇医药
Overexpression of interleukin-6,gp80 and gp130 genes in PBMCs from patients with active lupus nephritis
ZENG Lixia,SUN Lin,YE Rengao
(Institute of Kidney,First Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080,China)
【Abstract】 Objective To clarify whether in vivo IL-6-IL-6 receptor system is up-regulated in patients with lupus nephritis (LN).The relationship between this system and serum autoantibody levels was also studied.Method IL-6 mRNA,gp80 mRNA and gp130 mRNA in freshly-isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from 18 active and 16 inactive LN patients,as well as 10 healthy subjects were measured by quantitative reverse transcriptive polymerase chain reaction (RT-PCR).Results Significant levels of IL-6 mRNA were expressed in 13 (72.2%) of 18 active cases,whereas in 6 (37.5%) of 16 inactive cases and in 1 (10.0%) of 10 normal subjects.There was a higher positive rate of IL-6 mRNA in active cases than in inactive cases or normal subjects (P0.05 or P0.01).There were no differences in the positive rates of gp80 mRNA and gp130 mRNA by RT-PCR among the three groups (P0.05).Higher than normal mRNA levels of IL-6,gp80 and gp130 were observed in the PBMCs from active LN patients.Moreover,a positive relationship among the levels of IL-6 mRNA,gp80 mRNA and gp130 mRNA in the PBMCs from active LN patients was found.However,the mRNA levels of IL-6,gp80 and gp130 were not correlated with the autoantibodies (ANA,anti-dsDNA and anti-Sm).Conclusion The IL-6-IL-6 receptor system in blood is up-regulated in active LN patients.Up-regulation of the gp80 and gp130 mRNA levels in vivo may be caused by endogeneously PBMC-derived IL-6.
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【Key words】 Lupus nephritis; Leucocytes,mononuclear; Interleukin-6; gp80; gp130; Polymerase chain reaction,reverse transcription
白细胞介素-6(IL-6)可由外周血T、B淋巴细胞、单核细胞等单个核细胞产生，又可促进B淋巴细胞的终末分化及T淋巴细胞活化与增生[1]。已证实系统性红斑狼疮(SLE)患者B淋巴细胞可在体外自发性产生IL-6，在外源性重组IL-6作用下也能直接分化并合成IgG型抗ds-DNA自身抗体[2]，我们的研究亦证实外周血单个核细胞(PBMCs)在狼疮肾炎(LN)患者体内过度表达IL-6 mRNA与分泌过量的IL-6蛋白[3]。可见，在SLE发病机制中IL-6具有重要作用，但目前对于LN患者PBMCs IL-6受体成分gp80与gp130的mRNA表达情况的研究，国内外尚未见报道。本研究采用定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测34例LN患者PBMCs IL-6、gp80、gp130 mRNA水平，并分析它们之间及其与自身抗体的关系，从另一角度确定LN患者体内IL-6自/旁分泌机制的存在情况。
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1 资料与方法
1.1 研究对象：选择符合1982年美国风湿病协会制定的SLE诊断标准且伴有肾炎表现、按SLEDAI判断为活动期LN患者18例，男1例，女17例，平均年龄(27±3)岁；非活动期LN患者16例，男1例，女15例，平均年龄(29±4)岁。采血前1个月均未服用免疫抑制剂，其中28例口服强的松(龙)0～20 mg/d，另6例口服强的松(龙)40～60 mg/d，但采血前均已停服24 h。另选体检正常者10名为对照组，男1名，女9名，平均年龄(28±5)岁。该三组人群年龄、性别基本匹配。
1.2 引物序列：根据文献[4]资料，委托中科院上海细胞生物研究所合成下列引物：IL-6：上游5′-ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGC-3′，下游5′-GAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-3′；gp80：上游5′-CATTGCCATTGTTCTGAGGTTC-3′，下游5′-AGTAGTCTGTATTGCTGATGTC-3′；gp130：上游5′-ACAGATGAAGGTGGGAAGGAT-3′，下游5′-AGATGACATGCATGAAGACCC-3′；β-actin：上游5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，下游5′-GTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。
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1.3 新鲜PBMCs制备：取清晨空腹静脉血5 ml，预先加入2% EDTA抗凝，采用Ficoll密度离心法制备PBMCs，以经0.1%焦碳酸二乙酯(EDPC)处理后的PBS洗涤3次后悬浮于PBS调制成细胞悬液1×106/ml，用于PBMCs总RNA的提取。
1.4 RNA的提取与纯化：采用异硫氰酸胍一步法提取和纯化PBMCs总RNA[5]，用紫外分光光度计(日本岛津UV2200)测定各例总RNA量，吸光度260/280 nm比值在1.782～1.898，取3 μl总RNA用1.1%琼脂糖变性凝胶电泳带28 s与18 s之比约为2∶1来鉴定所提取RNA的完整性。
1.5 RT-PCR：利用逆转录试剂盒(Promega)严格按说明书操作，以Oligo(dT)15为引物合成cDNA，以不加入逆转录酶为阴性对照。再以上述各对引物在DNA合成仪(USA)上进行PCR扩增(PCR试剂盒，上海华美公司)，反应条件及循环次数参照文献[4]，反应总体积为50 μl，90 ℃热启动7 min后，以94 ℃变性60 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸60 s进行循环，最后延伸7 min，产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳。
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1.6 半定量分析：取10 μl反应产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳后，凝胶浸入0.5 μg/ml的溴化乙锭水溶液染色10 min，紫外灯下观察结果并照相，负片用图像分析仪对目的条带进行密度扫描，分别计算IL-6/β-actin、gp80/β-actin和gp130/β-actin的密度相对值，以代表mRNA的相对表达水平。
1.7 统计学处理：计数资料采用确切概率法进行检验；计量资料以
±s表示，采用配对t检验与直线相关分析对实验数据进行处理。
2 结果
2.1 LN患者及正常人外周血单个核细胞IL-6、gp80和gp130的mRNA检出阳性率。表1示，18例活动期LN患者PBMCs中可见明显的IL-6 mRNA表达有13例，而16例PBMCs中只有6例可见明显的IL-6 mRNA表达，正常对照组10名只有1名可见明显的IL-6 mRNA表达，余者几乎未见IL-6 mRNA表达条带。确切概率法分析，结果活动期LN患者PBMCs IL-6 mRNA的检出阳性率显著高于非活动期LN患者及正常人，后两者PBMCs IL-6 mRNA的检出阳性率差异则无显著性。类似的分析可得出，活动期LN患者、非活动期LN患者及正常人PBMCs gp80 mRNA与gp130 mRNA的检出阳性频率差异均无统计学意义。
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表1 三组外周血单个核细胞IL-6 gp80和
gp130 mRNA的检出阳性率 组别
例数
IL-6
gp80
gp130
阳性数
%
阳性数
%
阳性数
%
, 百拇医药 活动组
18
13*Δ
72.2
16
88.9
16
88.9
非活动组
16
6
37.5
11
, 百拇医药
68.8
13
81.3
正常组
10
1
10.0
8
80.0
7
70.0
注：与正常组比较*P<0.01；与非活动组比较，ΔP<0.05
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2.2 LN患者及正常人外周血单个核细胞IL-6、gp80和gp130 mRNA的相对表达水平。表2示，外周血单个核细胞IL-6 mRNA表达水平，活动期LN患者高于非活动期LN患者，后者又高于正常人；活动期LN患者PBMCs中有较高水平的gp80 mRNA与gp130 mRNA表达，与非活动期LN患者及正常对照比较差异有显著性，非活动期LN患者PBMCs gp80 mRNA与gp130 mRNA表达水平与正常对照比较差异则无统计学意义。
表2 外周血单个核细胞IL-6 gp80和gp130mRNA的相对表达水平 组别
例数
IL-6
gp80
gp130
活动组
, 百拇医药
18
0.545**ΔΔ
0.753*Δ
0.820**Δ
非活动组
16
0.180*
0.345
0.544
正常组
10
0.004
, 百拇医药
0.350
0.477
注：与正常组比较*P<0.05，**P<0.001；与非活动组比较ΔP<0.05，ΔΔP<0.01
2.3 LN患者外周血单个核细胞IL-6、gp80和gp130 mRNA表达量之间及其与自身抗体的相关分析。活动期LN患者PBMCs IL-6 mRNA分别与gp80 mRNA和gp130 mRNA相对表达水平呈正相关(r1＝0.612，P<0.01；r2＝0.537，P<0.05)，后两者亦呈正相关(r3＝0.576，P<0.05)；但它们与血清ANA、抗ds-DNA和抗Sm抗体无显著的相关性(P>0.05)。非活动期LN患者PBMCs中IL-6、gp80与gp130的mRNA相对表达水平彼此之间均无显著相关性(P>0.05)。
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3 讨论
IL-6的受体系统由两个功能不同的成分即配体结合部分gp80(α亚基)和非配体结合部分gp130(β亚基)所组成，后者与IL-6-gp80结合形成高亲合力性复合体，传递IL-6信号到细胞内，导致细胞分化增生等反应[6]。本研究结果即活动期或非活动期LN患者PBMCs IL-6 mRNA的表达强度均上调，活动期LN患者PBMCs gp80 mRNA与gp130 mRNA的检出阳性率虽与非活动期LN患者及正常人无异，但其表达强度上调，提示LN患者PBMCs不仅存在IL-6转录增强，活动期LN患者PBMCs对IL-6反应敏感性亦可能增强。
尽管有报道gp130几乎普遍存在于各种体外培养的细胞株、早期胚胎和人体各种组织中，但给小鼠注射外源性IL-6时，却能导致gp130 mRNA短暂性上调[6]。gp130除参与IL-6信号传递外，还参与白细胞介素-11(IL-11)、白血病抑制因子(LIF)、抑瘤素M(OSM)、睫状神经营养因子(CNTF)与cardiotrophin-1(CT-1)等细胞因子的高亲合性受体的形成。由于这些细胞因子共用gp130作为信号传导链，因而它们具有部分交叉生物活性，通称为IL-6家族[7]。最近有报道，除IL-6在所有SLE患者外周血显著增高外，在部分SLE患者外周血中尚可检测出低水平的LIF、OSM和CNTF，且与狼疮活动有关[8]，IL-11和CT-1与SLE的关系尚未见报道。本文作者观察到活动期LN患者PBMCs内IL-6 mRNA、gp80 mRNA与gp130 mRNA同时被上调，且三者关系密切，故可推测IL-6是诱导LN患者PBMCs gp130 mRNA表达上调的主要因素之一。IL-6可能通过自分泌或旁分泌机制(即局部作用)诱导活动期LN患者PBMCs内gp130基因表达增强。
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gp130基因的活化是诱导细胞增生的信号，其机制已初步探明：通过gp130同/异二聚体的形成，促使细胞质内的相应蛋白发生磷酸化反应并通过两条信号传导途径：一条是通过细胞质内Jak-Tyk家族中Jak1、Jak2和Tyk3以及STAT3/APRF等的活化；另一条是通过酪氨酸激酶与Ras-MAP激酶链的相继活化，随后活化NF-IL-6，两者最终均导致相应靶基因的激活和细胞功能应答[7，9]。故活动期LN患者PBMCs gp130基因表达增强，可能导致PBMCs内一系列酶的改变，促进PBMCs中某些自身反应性淋巴细胞增生活化并分泌多种自身抗体，促使狼疮活动性发作。拮抗或阻断淋巴细胞内IL-6信号传递，可能对LN的治疗有益。本研究未能证实活动期LN患者PBMCs内IL-6、gp80和gp130基因表达与血清ANA、抗ds-DNA和抗Sm抗体的直接相关性，可能与血清自身抗体的水平除受淋巴细胞分泌IL-6的速率影响外，还可能与患者受累的器官如肾脏局部产生IL-6的速率有关[10]。Kibred给MRL-Lpr/Lpr狼疮小鼠静脉注射抗IL-6R α抗体，可明显改善该小鼠的肾小球结构与肾小球滤过功能，并伴有血清抗ds-DNA下降[11]，似乎证实上述推断，并提示抗IL-6的系列疗法在SLE及LN中具有较好的应用前景。
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作者单位：周飞宇(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾内科)
尹培达(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾内科)
参 考 文 献
1,van Snick J.Interleukin 6:an overview.Annu Rev Immunol,1990,8:253-278.
2,Linker-Israeli M,Deans RJ,Wallace DJ,et al.Elevated levels of endogenous IL-6 in SLE:a putatine role in pathogenesis.J Immunol,1991,147:117-123.
3,曾丽霞，叶任高，孙林，等.外周血单个核细胞在狼疮肾炎患者体内高效表达IL-6的观察.中华微生物和免疫学杂志，1997，17：442-445.
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4,Inoue X,Sugiyama H,Ogawa H,et al.Expression of the inter-leukin-6 (IL-6),IL-6 receptor,and gp130 genes in acute leukemia.Blood,1994,8:2672-2680.
5,Chomczynski P,Sicchi N.Spngle-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal Biochem,1987,162:156-159.
6,Satio M,Yoshida K,Hibi M,et al.Molecular cloning of a murine IL-6 receptor-associated singal transducer,gp130,and its regulated expression in vivo.J Immunol,1992,148:4066-4071.
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7,Hibi M,Nakajima K,Hirano T.IL-6 cytokine family and singal transduction:a model of the cytokine system.J Mol Med,1996,74:1-12.
8,Robak E,Sysa-Jedrzejowska A,Stepien H,et al.Circulating interleukin-6 type cytokines in patients with systemic lupus erythematosus.Eur Cytokine Netw,1997,8:281-286.
9,Natazzki M,Witthuhn BA,Yoshida K,et al.Activation of JAK2 kinase mediated by the interleukin 6 singal transducer gp130.Proc Natl Aead Sci USA,1994,91:2285-2289.
10,曾丽霞，孙林，李幼姬，等.白细胞介素-6在狼疮肾炎患者小管间质的表达及其意义.中国肾脏病杂志，1997，13：140-143.
11,Kiberd BA.Interleukin-6 receptor blockage ampeliorates murine lupus nephritis.J Am Soc Nephrol,1993,4:58-61.
(收稿日期：1999-09-27), http://www.100md.com
单位：曾丽霞(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾内科)；孙林(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾内科)；叶任高(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾内科)；许韩师(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾内科)；陆才生(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾内科)；李幼姬(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾内科)
关键词：狼疮肾炎；白细胞，单核；白细胞介素6；gp80；gp130；聚合酶链反应，逆转录
中华风湿病学杂志000305 【摘 要】 目的 了解狼疮肾炎(LN)患者外周血单个核细胞(PBMCs)白细胞介素-6(IL-6)与IL-6受体(gp80与gp130)的mRNA表达情况，并分析它们之间及其与自身抗体的关系。方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测18例活动期LN患者、16例非活动期LN患者和10名正常人PBMCs内IL-6、gp80与gp130的mRNA表达水平。结果 ①活动期LN患者、非活动期LN患者及正常人PBMCs IL-6 mRNA检出阳性率各为72.2%、37.5%和10.0%，前者显著高于后两者，而后两者PBMCs IL-6 mRNA的检出阳性率差异则无显著性；这三组人群PBMCs内gp80 mRNA与gp130 mRNA的检出阳性率均无统计学差异。②活动期LN患者PBMCs中IL-6 mRNA表达水平高于非活动期LN患者，后者又高于正常人；活动期LN患者PBMCs中有较高水平的gp80 mRNA与gp130 mRNA表达，而非活动期LN患者PBMCs gp80 mRNA与gp130 mRNA表达水平，与正常对照比较则无统计学差异。③活动期LN患者PBMCs内IL-6 mRNA、gp80 mRNA和gp130 mRNA相对表达水平互呈正相关，但在非活动期LN患者中则未见这种正相关关系。活动期LN患者PBMCs内IL-6、gp80和gp130基因表达水平与血清ANA、抗ds-DNA抗体和抗Sm抗体均无显著的相关性。结论 活动期LN患者PBMCs内IL-6及其受体gp80和gp130的mRNA表达均上调，且受体gp80和gp130的mRNA表达上调可能是其PBMCs内源性过多产生IL-6所致。
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ZENG Lixia,SUN Lin,YE Rengao
(Institute of Kidney,First Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080,China)
【Abstract】 Objective To clarify whether in vivo IL-6-IL-6 receptor system is up-regulated in patients with lupus nephritis (LN).The relationship between this system and serum autoantibody levels was also studied.Method IL-6 mRNA,gp80 mRNA and gp130 mRNA in freshly-isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from 18 active and 16 inactive LN patients,as well as 10 healthy subjects were measured by quantitative reverse transcriptive polymerase chain reaction (RT-PCR).Results Significant levels of IL-6 mRNA were expressed in 13 (72.2%) of 18 active cases,whereas in 6 (37.5%) of 16 inactive cases and in 1 (10.0%) of 10 normal subjects.There was a higher positive rate of IL-6 mRNA in active cases than in inactive cases or normal subjects (P0.05 or P0.01).There were no differences in the positive rates of gp80 mRNA and gp130 mRNA by RT-PCR among the three groups (P0.05).Higher than normal mRNA levels of IL-6,gp80 and gp130 were observed in the PBMCs from active LN patients.Moreover,a positive relationship among the levels of IL-6 mRNA,gp80 mRNA and gp130 mRNA in the PBMCs from active LN patients was found.However,the mRNA levels of IL-6,gp80 and gp130 were not correlated with the autoantibodies (ANA,anti-dsDNA and anti-Sm).Conclusion The IL-6-IL-6 receptor system in blood is up-regulated in active LN patients.Up-regulation of the gp80 and gp130 mRNA levels in vivo may be caused by endogeneously PBMC-derived IL-6.
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【Key words】 Lupus nephritis; Leucocytes,mononuclear; Interleukin-6; gp80; gp130; Polymerase chain reaction,reverse transcription
白细胞介素-6(IL-6)可由外周血T、B淋巴细胞、单核细胞等单个核细胞产生，又可促进B淋巴细胞的终末分化及T淋巴细胞活化与增生[1]。已证实系统性红斑狼疮(SLE)患者B淋巴细胞可在体外自发性产生IL-6，在外源性重组IL-6作用下也能直接分化并合成IgG型抗ds-DNA自身抗体[2]，我们的研究亦证实外周血单个核细胞(PBMCs)在狼疮肾炎(LN)患者体内过度表达IL-6 mRNA与分泌过量的IL-6蛋白[3]。可见，在SLE发病机制中IL-6具有重要作用，但目前对于LN患者PBMCs IL-6受体成分gp80与gp130的mRNA表达情况的研究，国内外尚未见报道。本研究采用定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测34例LN患者PBMCs IL-6、gp80、gp130 mRNA水平，并分析它们之间及其与自身抗体的关系，从另一角度确定LN患者体内IL-6自/旁分泌机制的存在情况。
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1 资料与方法
1.1 研究对象：选择符合1982年美国风湿病协会制定的SLE诊断标准且伴有肾炎表现、按SLEDAI判断为活动期LN患者18例，男1例，女17例，平均年龄(27±3)岁；非活动期LN患者16例，男1例，女15例，平均年龄(29±4)岁。采血前1个月均未服用免疫抑制剂，其中28例口服强的松(龙)0～20 mg/d，另6例口服强的松(龙)40～60 mg/d，但采血前均已停服24 h。另选体检正常者10名为对照组，男1名，女9名，平均年龄(28±5)岁。该三组人群年龄、性别基本匹配。
1.2 引物序列：根据文献[4]资料，委托中科院上海细胞生物研究所合成下列引物：IL-6：上游5′-ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGC-3′，下游5′-GAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-3′；gp80：上游5′-CATTGCCATTGTTCTGAGGTTC-3′，下游5′-AGTAGTCTGTATTGCTGATGTC-3′；gp130：上游5′-ACAGATGAAGGTGGGAAGGAT-3′，下游5′-AGATGACATGCATGAAGACCC-3′；β-actin：上游5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，下游5′-GTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。
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1.3 新鲜PBMCs制备：取清晨空腹静脉血5 ml，预先加入2% EDTA抗凝，采用Ficoll密度离心法制备PBMCs，以经0.1%焦碳酸二乙酯(EDPC)处理后的PBS洗涤3次后悬浮于PBS调制成细胞悬液1×106/ml，用于PBMCs总RNA的提取。
1.4 RNA的提取与纯化：采用异硫氰酸胍一步法提取和纯化PBMCs总RNA[5]，用紫外分光光度计(日本岛津UV2200)测定各例总RNA量，吸光度260/280 nm比值在1.782～1.898，取3 μl总RNA用1.1%琼脂糖变性凝胶电泳带28 s与18 s之比约为2∶1来鉴定所提取RNA的完整性。
1.5 RT-PCR：利用逆转录试剂盒(Promega)严格按说明书操作，以Oligo(dT)15为引物合成cDNA，以不加入逆转录酶为阴性对照。再以上述各对引物在DNA合成仪(USA)上进行PCR扩增(PCR试剂盒，上海华美公司)，反应条件及循环次数参照文献[4]，反应总体积为50 μl，90 ℃热启动7 min后，以94 ℃变性60 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸60 s进行循环，最后延伸7 min，产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳。
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1.6 半定量分析：取10 μl反应产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳后，凝胶浸入0.5 μg/ml的溴化乙锭水溶液染色10 min，紫外灯下观察结果并照相，负片用图像分析仪对目的条带进行密度扫描，分别计算IL-6/β-actin、gp80/β-actin和gp130/β-actin的密度相对值，以代表mRNA的相对表达水平。
1.7 统计学处理：计数资料采用确切概率法进行检验；计量资料以
±s表示，采用配对t检验与直线相关分析对实验数据进行处理。2 结果
2.1 LN患者及正常人外周血单个核细胞IL-6、gp80和gp130的mRNA检出阳性率。表1示，18例活动期LN患者PBMCs中可见明显的IL-6 mRNA表达有13例，而16例PBMCs中只有6例可见明显的IL-6 mRNA表达，正常对照组10名只有1名可见明显的IL-6 mRNA表达，余者几乎未见IL-6 mRNA表达条带。确切概率法分析，结果活动期LN患者PBMCs IL-6 mRNA的检出阳性率显著高于非活动期LN患者及正常人，后两者PBMCs IL-6 mRNA的检出阳性率差异则无显著性。类似的分析可得出，活动期LN患者、非活动期LN患者及正常人PBMCs gp80 mRNA与gp130 mRNA的检出阳性频率差异均无统计学意义。
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表1 三组外周血单个核细胞IL-6 gp80和
gp130 mRNA的检出阳性率 组别
例数
IL-6
gp80
gp130
阳性数
%
阳性数
%
阳性数
%
, 百拇医药 活动组
18
13*Δ
72.2
16
88.9
16
88.9
非活动组
16
6
37.5
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68.8
13
81.3
正常组
10
1
10.0
8
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7
70.0
注：与正常组比较*P<0.01；与非活动组比较，ΔP<0.05
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2.2 LN患者及正常人外周血单个核细胞IL-6、gp80和gp130 mRNA的相对表达水平。表2示，外周血单个核细胞IL-6 mRNA表达水平，活动期LN患者高于非活动期LN患者，后者又高于正常人；活动期LN患者PBMCs中有较高水平的gp80 mRNA与gp130 mRNA表达，与非活动期LN患者及正常对照比较差异有显著性，非活动期LN患者PBMCs gp80 mRNA与gp130 mRNA表达水平与正常对照比较差异则无统计学意义。
表2 外周血单个核细胞IL-6 gp80和gp130mRNA的相对表达水平 组别
例数
IL-6
gp80
gp130
活动组
, 百拇医药
18
0.545**ΔΔ
0.753*Δ
0.820**Δ
非活动组
16
0.180*
0.345
0.544
正常组
10
0.004
, 百拇医药
0.350
0.477
注：与正常组比较*P<0.05，**P<0.001；与非活动组比较ΔP<0.05，ΔΔP<0.01
2.3 LN患者外周血单个核细胞IL-6、gp80和gp130 mRNA表达量之间及其与自身抗体的相关分析。活动期LN患者PBMCs IL-6 mRNA分别与gp80 mRNA和gp130 mRNA相对表达水平呈正相关(r1＝0.612，P<0.01；r2＝0.537，P<0.05)，后两者亦呈正相关(r3＝0.576，P<0.05)；但它们与血清ANA、抗ds-DNA和抗Sm抗体无显著的相关性(P>0.05)。非活动期LN患者PBMCs中IL-6、gp80与gp130的mRNA相对表达水平彼此之间均无显著相关性(P>0.05)。
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3 讨论
IL-6的受体系统由两个功能不同的成分即配体结合部分gp80(α亚基)和非配体结合部分gp130(β亚基)所组成，后者与IL-6-gp80结合形成高亲合力性复合体，传递IL-6信号到细胞内，导致细胞分化增生等反应[6]。本研究结果即活动期或非活动期LN患者PBMCs IL-6 mRNA的表达强度均上调，活动期LN患者PBMCs gp80 mRNA与gp130 mRNA的检出阳性率虽与非活动期LN患者及正常人无异，但其表达强度上调，提示LN患者PBMCs不仅存在IL-6转录增强，活动期LN患者PBMCs对IL-6反应敏感性亦可能增强。
尽管有报道gp130几乎普遍存在于各种体外培养的细胞株、早期胚胎和人体各种组织中，但给小鼠注射外源性IL-6时，却能导致gp130 mRNA短暂性上调[6]。gp130除参与IL-6信号传递外，还参与白细胞介素-11(IL-11)、白血病抑制因子(LIF)、抑瘤素M(OSM)、睫状神经营养因子(CNTF)与cardiotrophin-1(CT-1)等细胞因子的高亲合性受体的形成。由于这些细胞因子共用gp130作为信号传导链，因而它们具有部分交叉生物活性，通称为IL-6家族[7]。最近有报道，除IL-6在所有SLE患者外周血显著增高外，在部分SLE患者外周血中尚可检测出低水平的LIF、OSM和CNTF，且与狼疮活动有关[8]，IL-11和CT-1与SLE的关系尚未见报道。本文作者观察到活动期LN患者PBMCs内IL-6 mRNA、gp80 mRNA与gp130 mRNA同时被上调，且三者关系密切，故可推测IL-6是诱导LN患者PBMCs gp130 mRNA表达上调的主要因素之一。IL-6可能通过自分泌或旁分泌机制(即局部作用)诱导活动期LN患者PBMCs内gp130基因表达增强。
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gp130基因的活化是诱导细胞增生的信号，其机制已初步探明：通过gp130同/异二聚体的形成，促使细胞质内的相应蛋白发生磷酸化反应并通过两条信号传导途径：一条是通过细胞质内Jak-Tyk家族中Jak1、Jak2和Tyk3以及STAT3/APRF等的活化；另一条是通过酪氨酸激酶与Ras-MAP激酶链的相继活化，随后活化NF-IL-6，两者最终均导致相应靶基因的激活和细胞功能应答[7，9]。故活动期LN患者PBMCs gp130基因表达增强，可能导致PBMCs内一系列酶的改变，促进PBMCs中某些自身反应性淋巴细胞增生活化并分泌多种自身抗体，促使狼疮活动性发作。拮抗或阻断淋巴细胞内IL-6信号传递，可能对LN的治疗有益。本研究未能证实活动期LN患者PBMCs内IL-6、gp80和gp130基因表达与血清ANA、抗ds-DNA和抗Sm抗体的直接相关性，可能与血清自身抗体的水平除受淋巴细胞分泌IL-6的速率影响外，还可能与患者受累的器官如肾脏局部产生IL-6的速率有关[10]。Kibred给MRL-Lpr/Lpr狼疮小鼠静脉注射抗IL-6R α抗体，可明显改善该小鼠的肾小球结构与肾小球滤过功能，并伴有血清抗ds-DNA下降[11]，似乎证实上述推断，并提示抗IL-6的系列疗法在SLE及LN中具有较好的应用前景。
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作者单位：周飞宇(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾内科)
尹培达(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾内科)
参 考 文 献
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(收稿日期：1999-09-27), http://www.100md.com