系统性红斑狼疮患者红细胞补体受体一型分子基因型与数量的测定及其意义
作者：王海滨 郭峰 惠小阳 许育
单位：王海滨(200433 上海，第二军医大学长海医院免疫室)；郭峰(200433 上海，第二军医大学长海医院免疫室)；惠小阳(200433 上海，第二军医大学长海医院免疫室)；许育(200433 上海，第二军医大学长海医院免疫室)
关键词：红斑狼疮，系统性 受体，补体；红细胞；基因；定量测定
中华风湿病学杂志000303 【摘 要】 目的 研究系统性红斑狼疮(SLE)患者红细胞补体受体一型分子(CR1)基因型及数量表达与病情发展的关系。方法 采用PCR和Hind Ⅲ酶切技术以及酶联法定量测定红细胞CR1分子的数量。结果 SLE患者红细胞CR1分子密度相关基因型高表达较正常人明显下降，中、低表达明显升高(P0.05)：SLE患者CR1分子的数量表达全部低于正常健康人平均水平(P0.000 1)，并且CR1分子数量表达的变化与病情恶化程度明显相关。结论 对SLE患者进行红细胞CR1分子的定量测定，对临床诊断和病情判断有重要的参考价值。
, 百拇医药
Significance of ECR1 genomic density polymorphism and quantitative expression in patients with SLE
WANG Haibin,GUO Feng,HUI Xiaoyang
(Department of Immunology,Changhai Hospital,Second Military University,Shanghai 200433,China)
【Abstract】 Objective To study the significance of type 1 complement receptor on erythrocytes (ECR1) genomic density polymorphism and quantitative expression in patients with SLE.Methods Polymerase chain reaction (PCR),Hind Ⅲ restriction enzyme digestion and the quantitative assay of ECR1 were used.Results The spot mutation rate (62.5%) of ECR1 density gene in patients with SLE was higher than that (42.5%) of healthy individuals (P<0.05).The number of ECR1 in patients with SLE was all significantly lower than that of healthy individuals (P<0.000 1).There was a good relationship between the expression of ECR1 and the activity of SLE.Conclusion The number of ECR1 plays an important role in the pathogeny and the development of SLE.
, 百拇医药
【Key words】 Lupus erythematosus,systemic;Receptors,complement;Erythrocyte;Gene;Quantitative assay
影响系统性红斑狼疮(SLE)患者病程发展的因素，目前尚不清楚。但循环中ds-DNA的数量以及影响ds-DNA数量变化的影响因子，在SLE患者病情发展中占有非常重要的地位。国内外众多文献报道，SLE患者红细胞补体受体一型分子(CR1)的数量及粘附活性都明显低下[1-3]。我们随SLE患者的疾病发展对红细胞CR1分子数量进行动态测定，发现SLE患者红细胞CR1分子数量表达的变化与其病情的发展有明显的相关性。现将具体情况报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
24例SLE患者均来自长海医院住院病人，平均年龄25.8岁，男3例，女21例。40名正常人为长海医院健康体检的中年人，男5名，女35名；男女比例与病人构成相同。
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1.2 研究方法
1.2.1 红细胞CR1分子基因型测定：根据红细胞CR1分子结构基因中一个内含子有点突变，可产生新的Hind Ⅲ位点，这种突变可使红细胞CR1分子表达数量降低。据文献[4]设计引物1：5′-CCTTCAATGGAATGGTGCAT-3′(4415-4435)；引物2：5′-CCCTTGTAAGGCAAGTCTGG-3′(引物3′端距结构基因内含子Hind Ⅲ酶切位点25～55 bp)建立PCR技术加Hind Ⅲ酶切技术。取EDTA抗凝全血提取DNA，进行PCR扩增，然后进行Hind Ⅲ酶切，可将CR1分子密度相关基因分为高表达(HH，1.8 kb一条带)、中表达(HL，1.8、1.3、0.5 kb三条带)和低表达(LL，1.3、0.5 kb两条带)三种基因表达形式(见图1)。
A为患者住院时测得的A405平均值，B、C为疾病活动期测得平均值，D、E为疾病转为静止期的A405平均值。
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图1 系统性红斑狼疮患者CR1分子的动态变化
1.2.2 红细胞CR1分子定量测定方法：根据文献[5]建立红细胞CR1分子定量测定方法，取EDTA抗凝血用PBS洗涤3次，用戊二醛固定，用PBS配成2%的红细胞悬液。取25 μl红细胞悬液加入V型板，分别加抗红细胞CR1分子一抗(晶美生物公司)、碱性磷酸酶标记的二抗(宝灵曼公司)和相应底物。离心、吸取上层显色液于另一个干净U型板测定A405值。空白对照组用无一抗的稀释液代替一抗，其余相同。实验组A405值与空白对照组值之差即为测定值。
1.3 统计学处理
采用Student检验和χ2检验。
2 结果
2.1 SLE患者红细胞CR1分子基因型与数量的变化：SLE患者红细胞CR1分子的基因型，高表达人群明显低于正常人，而中、低表达者则明显较正常人升高(P<0.05)。CR1分子的数量表达显著低于正常人(P<0.000 1)。以上两研究结果表明，SLE患者的CR1分子数量变化比其基因型变化更为明显。可初步推理，SLE患者的CR1分子数量表达的缺陷，主要是后天获得性。这一研究结果与国外研究报道完全相同。数据见表1。
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表1 SLE患者红细胞CR1分子基因型与数量表达的变化 组别
例数
基因型
CR1数量
HH(%)
HL(%)
LL(%)
(3×106个RBC) A405
正常人组
40
23(57.5%)
, http://www.100md.com 16(40.0%)
2(2.5%)
1.22±0.31
SLE组
24
9(37.5%)
11(45.8%)
4(16.7%)
0.42±0.16*
注：与正常人比较*P<0.000 1；基因型χ2检验，χ2＝4.498，P<0.05
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2.2 SLE患者红细胞CR1分子动态测定与其病情发展：我们对2例SLE患者的CR1分子随其病情变化进行动态测定，结果发现，SLE患者的CR1分子表达随病情的活动而发生变化，当疾病活动时，患者红细胞CR1分子表达明显下降。在疾病恢复或好转期则明显回升，见图1。
2.3 红细胞CR1分子测定在SLE辅助诊断中的价值：24例确诊SLE患者的CR1分子A405测定值，无1例高于1.0，此点明显不同于正常人和其他疾病患者。我们对初步诊断为SLE，而其CR1分子数量表达处于正常人水平的3例患者进行临床随访，最终证实3例患者皆是误诊。该研究结果初步表明，对SLE患者进行红细胞CR1分子的定量测定，对辅助诊断有重要的参考价值。
2.4 红细胞CR1分子基因型与数量表达对SLE患者治疗效果的影响：临床观察发现，基因型为LL和CR1分子数量表达极低的SLE患者，明显较基因型为HH和CR1分子数量表达较高的SLE患者累及的系统多、病情较重，而且对免疫抑制剂治疗的效果反应不明显，这部分患者的预后亦很差。因此可以认为，对SLE患者进行红细胞CR1分子基因型和数量测定，对治疗方案的研究和预后判断具有重要的指导意义。
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3 讨论
SLE是一种累及多器官的、具有多种自身抗体的自身免疫性疾病，其确切的病因尚不清楚。但自身免疫复合物的形成与沉积，是其最主要的发病机制。红细胞膜广泛表达成簇分布的CR1分子，主要担负粘附补体C3b/C4b调理的循环免疫复合物并将其带至脾脏彻底销毁的重要功能[6]。因此，红细胞CR1分子的表达状况，对循环免疫复合物的清除具有至关重要的影响。
本研究发现，SLE患者红细胞CR1基因型和数量都较正常人有明显下降。SLE患者这种高表达基因型的下降和低表达基因型的明显升高，或许是导致CR1分子数量下降的重要因素。但我们测定的24例SLE患者，无1例患者的CR1分子定量值(A405)大于1.0。由此可推测，CR1分子基因型的变化可能不是导致红细胞CR1分子数量下降的主要原因。
SLE患者红细胞CR1分子的数量，随疾病的活动或病情的恶化而发生相应改变，并且其变化的幅度与疾病活动或病情恶化程度有明显的相关性。此外，尤其值得注意的是，CR1分子数量表达极少的SLE患者，相应治疗效果较差，病情易活动、易恶化。因此，SLE患者红细胞CR1分子的低下，主要是获得性，并且这种获得性CR1分子低下的程度，与SLE患者疾病的发生、发展以及治疗和预后皆有极为重要的关系；对SLE进行红细胞CR1分子的数量测定，对鉴别诊断有重要帮助。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670754)
参 考 文 献
1,Csipo I,Kavai M,Kiss E,et al.Serum complement activation of SLE patients during plasmapheresis.Autoimmunity,1997,25:139-146.
2,Cohen JH,Lutz HU,Pennaforte JL,et al.Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor,CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE).Clin Exp Immunol,1992,87:422-428.
, 百拇医药
3,Corvetta A,Pomponio G,Bencivenga R,et al.Low number of complement C3b/C4b receptors (CR1) on erythrocytes from patients with essential mixed cryoglobulinemia,systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis:relationship with disease activity,anticardiolipin antibodies,complement activation and therapy.J Rheumatol,1991,18:1021-1025.
4,Cornillet P,Philbert F,Kazatchkine MD,et al.Genomic determination of the CR1 (CD35) density polymorphism on erythrocytes using polymerase chain reaction and Hind Ⅲ restriction enzyme digestion.J Immunol Methods,1991,136:193-197.
, http://www.100md.com
5,Jones DRE,Thompson S,Amirchetty S,et al.An enzyme-linked immunosorbent assay for complement regulatory proteins and membrane-bound immunoglobulins on intact red blood cells.J Immunol Methods,1994,177:235-242.
6,Inada Y,Kamiyama M,Kanemitsu T,et al.In vivo binding of circulating immune complexes by C3b receptors (CR1) of transfused erythrocytes.Ann Rheum Dis,1989,48:287-294.
(收稿日期：1999-08-25), 百拇医药
单位：王海滨(200433 上海，第二军医大学长海医院免疫室)；郭峰(200433 上海，第二军医大学长海医院免疫室)；惠小阳(200433 上海，第二军医大学长海医院免疫室)；许育(200433 上海，第二军医大学长海医院免疫室)
关键词：红斑狼疮，系统性 受体，补体；红细胞；基因；定量测定
中华风湿病学杂志000303 【摘 要】 目的 研究系统性红斑狼疮(SLE)患者红细胞补体受体一型分子(CR1)基因型及数量表达与病情发展的关系。方法 采用PCR和Hind Ⅲ酶切技术以及酶联法定量测定红细胞CR1分子的数量。结果 SLE患者红细胞CR1分子密度相关基因型高表达较正常人明显下降，中、低表达明显升高(P0.05)：SLE患者CR1分子的数量表达全部低于正常健康人平均水平(P0.000 1)，并且CR1分子数量表达的变化与病情恶化程度明显相关。结论 对SLE患者进行红细胞CR1分子的定量测定，对临床诊断和病情判断有重要的参考价值。
, 百拇医药
Significance of ECR1 genomic density polymorphism and quantitative expression in patients with SLE
WANG Haibin,GUO Feng,HUI Xiaoyang
(Department of Immunology,Changhai Hospital,Second Military University,Shanghai 200433,China)
【Abstract】 Objective To study the significance of type 1 complement receptor on erythrocytes (ECR1) genomic density polymorphism and quantitative expression in patients with SLE.Methods Polymerase chain reaction (PCR),Hind Ⅲ restriction enzyme digestion and the quantitative assay of ECR1 were used.Results The spot mutation rate (62.5%) of ECR1 density gene in patients with SLE was higher than that (42.5%) of healthy individuals (P<0.05).The number of ECR1 in patients with SLE was all significantly lower than that of healthy individuals (P<0.000 1).There was a good relationship between the expression of ECR1 and the activity of SLE.Conclusion The number of ECR1 plays an important role in the pathogeny and the development of SLE.
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【Key words】 Lupus erythematosus,systemic;Receptors,complement;Erythrocyte;Gene;Quantitative assay
影响系统性红斑狼疮(SLE)患者病程发展的因素，目前尚不清楚。但循环中ds-DNA的数量以及影响ds-DNA数量变化的影响因子，在SLE患者病情发展中占有非常重要的地位。国内外众多文献报道，SLE患者红细胞补体受体一型分子(CR1)的数量及粘附活性都明显低下[1-3]。我们随SLE患者的疾病发展对红细胞CR1分子数量进行动态测定，发现SLE患者红细胞CR1分子数量表达的变化与其病情的发展有明显的相关性。现将具体情况报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
24例SLE患者均来自长海医院住院病人，平均年龄25.8岁，男3例，女21例。40名正常人为长海医院健康体检的中年人，男5名，女35名；男女比例与病人构成相同。
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1.2 研究方法
1.2.1 红细胞CR1分子基因型测定：根据红细胞CR1分子结构基因中一个内含子有点突变，可产生新的Hind Ⅲ位点，这种突变可使红细胞CR1分子表达数量降低。据文献[4]设计引物1：5′-CCTTCAATGGAATGGTGCAT-3′(4415-4435)；引物2：5′-CCCTTGTAAGGCAAGTCTGG-3′(引物3′端距结构基因内含子Hind Ⅲ酶切位点25～55 bp)建立PCR技术加Hind Ⅲ酶切技术。取EDTA抗凝全血提取DNA，进行PCR扩增，然后进行Hind Ⅲ酶切，可将CR1分子密度相关基因分为高表达(HH，1.8 kb一条带)、中表达(HL，1.8、1.3、0.5 kb三条带)和低表达(LL，1.3、0.5 kb两条带)三种基因表达形式(见图1)。
A为患者住院时测得的A405平均值，B、C为疾病活动期测得平均值，D、E为疾病转为静止期的A405平均值。
, 百拇医药
图1 系统性红斑狼疮患者CR1分子的动态变化
1.2.2 红细胞CR1分子定量测定方法：根据文献[5]建立红细胞CR1分子定量测定方法，取EDTA抗凝血用PBS洗涤3次，用戊二醛固定，用PBS配成2%的红细胞悬液。取25 μl红细胞悬液加入V型板，分别加抗红细胞CR1分子一抗(晶美生物公司)、碱性磷酸酶标记的二抗(宝灵曼公司)和相应底物。离心、吸取上层显色液于另一个干净U型板测定A405值。空白对照组用无一抗的稀释液代替一抗，其余相同。实验组A405值与空白对照组值之差即为测定值。
1.3 统计学处理
采用Student检验和χ2检验。
2 结果
2.1 SLE患者红细胞CR1分子基因型与数量的变化：SLE患者红细胞CR1分子的基因型，高表达人群明显低于正常人，而中、低表达者则明显较正常人升高(P<0.05)。CR1分子的数量表达显著低于正常人(P<0.000 1)。以上两研究结果表明，SLE患者的CR1分子数量变化比其基因型变化更为明显。可初步推理，SLE患者的CR1分子数量表达的缺陷，主要是后天获得性。这一研究结果与国外研究报道完全相同。数据见表1。
, 百拇医药
表1 SLE患者红细胞CR1分子基因型与数量表达的变化 组别
例数
基因型
CR1数量
HH(%)
HL(%)
LL(%)
(3×106个RBC) A405
正常人组
40
23(57.5%)
, http://www.100md.com 16(40.0%)
2(2.5%)
1.22±0.31
SLE组
24
9(37.5%)
11(45.8%)
4(16.7%)
0.42±0.16*
注：与正常人比较*P<0.000 1；基因型χ2检验，χ2＝4.498，P<0.05
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2.2 SLE患者红细胞CR1分子动态测定与其病情发展：我们对2例SLE患者的CR1分子随其病情变化进行动态测定，结果发现，SLE患者的CR1分子表达随病情的活动而发生变化，当疾病活动时，患者红细胞CR1分子表达明显下降。在疾病恢复或好转期则明显回升，见图1。
2.3 红细胞CR1分子测定在SLE辅助诊断中的价值：24例确诊SLE患者的CR1分子A405测定值，无1例高于1.0，此点明显不同于正常人和其他疾病患者。我们对初步诊断为SLE，而其CR1分子数量表达处于正常人水平的3例患者进行临床随访，最终证实3例患者皆是误诊。该研究结果初步表明，对SLE患者进行红细胞CR1分子的定量测定，对辅助诊断有重要的参考价值。
2.4 红细胞CR1分子基因型与数量表达对SLE患者治疗效果的影响：临床观察发现，基因型为LL和CR1分子数量表达极低的SLE患者，明显较基因型为HH和CR1分子数量表达较高的SLE患者累及的系统多、病情较重，而且对免疫抑制剂治疗的效果反应不明显，这部分患者的预后亦很差。因此可以认为，对SLE患者进行红细胞CR1分子基因型和数量测定，对治疗方案的研究和预后判断具有重要的指导意义。
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3 讨论
SLE是一种累及多器官的、具有多种自身抗体的自身免疫性疾病，其确切的病因尚不清楚。但自身免疫复合物的形成与沉积，是其最主要的发病机制。红细胞膜广泛表达成簇分布的CR1分子，主要担负粘附补体C3b/C4b调理的循环免疫复合物并将其带至脾脏彻底销毁的重要功能[6]。因此，红细胞CR1分子的表达状况，对循环免疫复合物的清除具有至关重要的影响。
本研究发现，SLE患者红细胞CR1基因型和数量都较正常人有明显下降。SLE患者这种高表达基因型的下降和低表达基因型的明显升高，或许是导致CR1分子数量下降的重要因素。但我们测定的24例SLE患者，无1例患者的CR1分子定量值(A405)大于1.0。由此可推测，CR1分子基因型的变化可能不是导致红细胞CR1分子数量下降的主要原因。
SLE患者红细胞CR1分子的数量，随疾病的活动或病情的恶化而发生相应改变，并且其变化的幅度与疾病活动或病情恶化程度有明显的相关性。此外，尤其值得注意的是，CR1分子数量表达极少的SLE患者，相应治疗效果较差，病情易活动、易恶化。因此，SLE患者红细胞CR1分子的低下，主要是获得性，并且这种获得性CR1分子低下的程度，与SLE患者疾病的发生、发展以及治疗和预后皆有极为重要的关系；对SLE进行红细胞CR1分子的数量测定，对鉴别诊断有重要帮助。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670754)
参 考 文 献
1,Csipo I,Kavai M,Kiss E,et al.Serum complement activation of SLE patients during plasmapheresis.Autoimmunity,1997,25:139-146.
2,Cohen JH,Lutz HU,Pennaforte JL,et al.Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor,CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE).Clin Exp Immunol,1992,87:422-428.
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3,Corvetta A,Pomponio G,Bencivenga R,et al.Low number of complement C3b/C4b receptors (CR1) on erythrocytes from patients with essential mixed cryoglobulinemia,systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis:relationship with disease activity,anticardiolipin antibodies,complement activation and therapy.J Rheumatol,1991,18:1021-1025.
4,Cornillet P,Philbert F,Kazatchkine MD,et al.Genomic determination of the CR1 (CD35) density polymorphism on erythrocytes using polymerase chain reaction and Hind Ⅲ restriction enzyme digestion.J Immunol Methods,1991,136:193-197.
, http://www.100md.com
5,Jones DRE,Thompson S,Amirchetty S,et al.An enzyme-linked immunosorbent assay for complement regulatory proteins and membrane-bound immunoglobulins on intact red blood cells.J Immunol Methods,1994,177:235-242.
6,Inada Y,Kamiyama M,Kanemitsu T,et al.In vivo binding of circulating immune complexes by C3b receptors (CR1) of transfused erythrocytes.Ann Rheum Dis,1989,48:287-294.
(收稿日期：1999-08-25), 百拇医药