L-甲状腺素诱导心肌肥厚模型下电压依赖性钾通道信使核糖核酸的表达
作者：曹文 孙胜利 凌树森 戴德哉 王自正
单位：曹文 凌树森(210002 江苏省南京市,中国人民解放军南京军区总医院 临床药理科)；孙胜利(中国人民解放军第二军医大学 实习生)；戴德哉(中国药科大学 药理研究室)；王自正(南京市第一人民医院 放免中心)
关键词：心肌肥厚；电压依赖性钾通道；逆转录多聚酶链反应
中国循环杂志000328 摘要
目的：探讨心肌肥厚易致心律失常的机制。
方法：SD大鼠实验组9只,对照组7只,用L-甲状腺素诱导法制备大鼠心肌肥厚模型,用逆转录多聚酶链反应方法(RT-PCR)半定量分析肥厚心肌内电压依赖性K+通道信使核糖核酸(mRNA)水平。
, http://www.100md.com
结果：实验组与对照组相比,实验组即肥厚心肌内电压依赖性K+通道mRNA的表达水平显著下降(P<0.05)。
结论：电压依赖性K+通道是心肌电活动的主要离子通道,心肌肥厚时电压依赖性K+通道基因表达水平下降,可能会导致动作电位复极化时间延长,与易诱发心律失常有关。
中图分类号:R541.7 文献标识码:A
文章编号:1000-3614(2000)03-0182-02
Voltage-Gated K+ Channels mRNA Expression in L-Thyroxine-Induced Cardiomyocyte Hypertrophy
Cao Wen,Sun Shengli,Ling Shusen,et al.
, 百拇医药
(Department of Clinical Pharmacology,General Hospital of Nanjing Command,Nanjing 210002,Jiangsu)
Abstract
Objective:To understand molecular mechanisms of electrophysiological alterations underlying cardiomyocyte hypertrophy.
Methods:Expression of cardiac voltage-gated K+ channel genes was examined in ventricles of L-thyroxin-induced cardiac hypertrophy rats.This study quantified of voltage-gated K+ channel messenger ribonucleic acid(mRNA) by reverse transcription and polymerase chain reaction amplification(RT-PCR).
, 百拇医药
Result:Compared with the control group,the expressions of voltage-gated K+ channels mRNA were significantly decreased by 42% (p<0.05).
Conclusion:These showed that the electrophysiological alterations may be associated with transcriptional regulation of voltage-gated K+ channels.These findings provide,at least in part,the molecular basis for electrophysiological alterations under hypertrophy.
Key words Hypertrophy;Voltage-gated K+ channels;Reverse transcription and polymerase chain reaction amplification
, 百拇医药
电压依赖性K+通道在心肌动作电位复极化过程中起着很大作用,K+内流的变化,直接影响心肌复极化时间,复极化时间延长易导致心律失常。在高负荷、高盐、血管紧张素Ⅱ、肾上腺素等方法诱导的心肌肥厚模型中,电压依赖性K+电流减小[1],K+通道基因表达下降[2,3];而L-甲状腺素诱导的心肌肥厚模型K+通道变化国内未见报道。甲状腺机能亢进(甲亢)是临床较常见的疾病,其主要并发症是心血管系统疾病,因此本文拟用L-甲状腺素诱导的心肌肥厚模型进行电压依赖性K+通道信使核糖核酸(mRNA)表达的研究,探讨甲亢状态下心律失常的机制。
1 材料与方法
动物试验:1998年4月～6月购16只雄性2月龄SD大鼠,体重235±30.5 g,由南京军区南京总医院动物实验中心提供。随机分成两组,实验组9只,对照组7只。每日早晨进食前实验组用羧甲基纤维素混悬的L-甲状腺素灌胃,剂量为每天1 mg/kg(每天给药前称体重,根据体重确定给药量);对照组根据体重给予相同体积的空白的羧甲基纤维素混悬液,连续10天,处死前禁食12小时,眼眶取血2 ml,用放射免疫标记法测定T3、T4的含量(由南京第一人民医院放射免疫中心测定),然后断头处死,迅速取心脏,蘸干血液后称重,取心室肌放入液氮中,瞬间冷却后转入-70℃冰箱中冷冻待用。
, 百拇医药
总核糖核酸(RNA)的提取 取100 mg左右的心肌组织,加入RNA提取专用试剂TRIzol(美国GIBCO公司),按试剂说明书进行操作,最后加入灭活RNA酶的去离子水10 μl重新溶解RNA,待用。
引物设计 为了得到扩增产物是总的电压依赖性K+通道,把引物设计在电压依赖性K+通道高度保守区的S4和H5链上[4],其引物序列分别为:5′-TTT-CAAGTTGTCCAGACACTC-3′,5′-TGTCTCCA-TAGCCTACAGTTG-3′,扩增片断长度为230 bp。根据文献报道核糖体蛋白S16与待检测K+通道mRNA具有相同的扩增动力学和相重合的指数扩增期[4,5],故选用其作内标准,其引物序列为5′引物5′-AGGAGCGATTTGCTGGTGTGGA-3′,3′引物5′-GCTACCAGGCCTTGAGATGGA-3′,扩增的片段长度为102 bp。
, 百拇医药
逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) 逆转录：取总RNA1～2 μg,加入MgCl25 mmol/L、1×反应缓冲液、三磷酸脱氧核苷(dNTP)1 mmol/L、rRNasin0.5 U、逆转录酶AMV15 U、引物为oligo(dT18)0.5 μg,总体积20 μ1。逆转录条件为:45℃60 min,99℃5 min,4℃5 min。
多聚酶链反应(PCR) 各成份浓度为:dNTP 1 mmol/L、MgCl21 mmol/L、Tag酶1 U、引物各加2 μ1,总体积为50 μ1。循环条件为:94℃30 s,53℃45 s,72℃1 min,循环30圈(美国PE2400PCR仪)。反应完毕,每管中加入溴酚蓝指示剂1 μl后上样,电泳完毕后,用即刻成像系统(GEL DOC 1000BIORAD)留取照片,进行密度扫描,将K+通道的扩增产物光密度值与内标准的光密度值相比,以比值计量。
, 百拇医药 统计学方法：试验结果用均数±标准差(
±s)表示,以单侧方差分析(ANOVA)检验组间差异,P<0.05有显著意义。
2 结果
2.1 实验组与对照组大鼠体重无明显差异
实验组心脏与体重指数比明显高于对照组,其分别为0.34±0.15和0.30±0.12(P<0.05),血浆T3浓度两组无显著性差异,T4浓度实验组明显高于对照组,分别为14.57±5.08 mmol/L和4.31±0.72 mmol/L(P<0.01)。
2.2 选择合适的扩增循环数
在32个循环数以前,循环数与产物量(密度值)成正比,本实验选择循环数为30圈,确保产物量不受循环数影响,只与模板量相关。在上述条件下,PCR扩增产物条带清晰,无杂带干扰。
, 百拇医药
2.3 K+通道RT-PCR产物光密度扫描分析
K+通道与内标准RT-PCR扩增产物的电泳条带进行光密度扫描,以二者比值作半定量分析,结果可见:K+通道mRNA表达水平明显下降,实验组比对照组降低了42%(P<0.05)。(附图)
附图 多聚酶链反应分析大鼠心肌钾通道互补脱氧核糖核酸图。实验组：标准差为0.53，对照组：标准差为0.99。RT-PCR：逆转录多聚酶链反应
3 讨论
mRNA的测定是在分子水平上研究基因表达的常用方法,RT-PCR则以其灵敏度高,专一性好,快速简单的特点日益得到认可[5]。用RT-PCR进行mRNA定量需解决两个关键问题:引物与模板的结合效率和不同管扩增引起的“管效应”。用扩增动力学曲线寻找合适的扩增循环圈数,可有效地避免因结合效率不同而引起的误差。内标准与待测物在同一管中扩增,可以克服“管效应”以及随后样品处理所带来的误差,保证了方法的准确性。L-甲状腺素能提高人体的基础代谢率,增强交感神经的活动,增加心率与心脏的负荷,本研究结果表明L-甲状腺素灌胃(每天1mg/kg)，持续10天,可致大鼠心肌肥厚。
, http://www.100md.com
心肌肥厚常常伴随着心律失常,K+通道在心肌电生理中起着关键作用,本实验的结论认为L-甲状腺素诱导的心肌肥厚模型K+通道mRNA表达降低,细胞膜上K+通道减少,导致K+电流减小,K+电流的减小使心肌细胞复极化时间延长,易致心律失常。
曹文(1963-)女,主管药师,博士,主要从事心血管药理学研究
参考文献
1，Rozanski GJ,Xu Z,Zhang K,et al.Altered K+ current of ventricular myocytes in rats with chronic myocardial infarction.Am J Physiol,1998,43:H259—H265.
, 百拇医药
2，Takimoto K,Li DQ,Hershman KH,et al.Decreased expression of Kv4.2 and novel Kv4.3 K+ channel subunit mRNAs in ventricles of renovascular hyprtensive rats.Circ Res,1997,181:533—539.
3，Madhavi G,Boyu H,Praveer J.Nabil el-sherif.differential expression of voltage-gated K+ channel genes in left ventricular remodeled myocardium after experimental myocardial infarction.Circ Res,1996,79:669—675.
4，Zahradka P,Harris KD,Triggs—Raine B,et al.PCR-based analysis of voltage-gated K+ channels in vascular smooth muscle.Mol Cell Biol,1995,145:39—44.
5，Foley KP,Leonard MW,Engel JD.Quantitation of RNA using the polymerase chain reaction.Trends Genet,1993,9:380—385.
1999-11-14
2000-03-06, 百拇医药
单位：曹文 凌树森(210002 江苏省南京市,中国人民解放军南京军区总医院 临床药理科)；孙胜利(中国人民解放军第二军医大学 实习生)；戴德哉(中国药科大学 药理研究室)；王自正(南京市第一人民医院 放免中心)
关键词：心肌肥厚；电压依赖性钾通道；逆转录多聚酶链反应
中国循环杂志000328 摘要
目的：探讨心肌肥厚易致心律失常的机制。
方法：SD大鼠实验组9只,对照组7只,用L-甲状腺素诱导法制备大鼠心肌肥厚模型,用逆转录多聚酶链反应方法(RT-PCR)半定量分析肥厚心肌内电压依赖性K+通道信使核糖核酸(mRNA)水平。
, http://www.100md.com
结果：实验组与对照组相比,实验组即肥厚心肌内电压依赖性K+通道mRNA的表达水平显著下降(P<0.05)。
结论：电压依赖性K+通道是心肌电活动的主要离子通道,心肌肥厚时电压依赖性K+通道基因表达水平下降,可能会导致动作电位复极化时间延长,与易诱发心律失常有关。
中图分类号:R541.7 文献标识码:A
文章编号:1000-3614(2000)03-0182-02
Voltage-Gated K+ Channels mRNA Expression in L-Thyroxine-Induced Cardiomyocyte Hypertrophy
Cao Wen,Sun Shengli,Ling Shusen,et al.
, 百拇医药
(Department of Clinical Pharmacology,General Hospital of Nanjing Command,Nanjing 210002,Jiangsu)
Abstract
Objective:To understand molecular mechanisms of electrophysiological alterations underlying cardiomyocyte hypertrophy.
Methods:Expression of cardiac voltage-gated K+ channel genes was examined in ventricles of L-thyroxin-induced cardiac hypertrophy rats.This study quantified of voltage-gated K+ channel messenger ribonucleic acid(mRNA) by reverse transcription and polymerase chain reaction amplification(RT-PCR).
, 百拇医药
Result:Compared with the control group,the expressions of voltage-gated K+ channels mRNA were significantly decreased by 42% (p<0.05).
Conclusion:These showed that the electrophysiological alterations may be associated with transcriptional regulation of voltage-gated K+ channels.These findings provide,at least in part,the molecular basis for electrophysiological alterations under hypertrophy.
Key words Hypertrophy;Voltage-gated K+ channels;Reverse transcription and polymerase chain reaction amplification
, 百拇医药
电压依赖性K+通道在心肌动作电位复极化过程中起着很大作用,K+内流的变化,直接影响心肌复极化时间,复极化时间延长易导致心律失常。在高负荷、高盐、血管紧张素Ⅱ、肾上腺素等方法诱导的心肌肥厚模型中,电压依赖性K+电流减小[1],K+通道基因表达下降[2,3];而L-甲状腺素诱导的心肌肥厚模型K+通道变化国内未见报道。甲状腺机能亢进(甲亢)是临床较常见的疾病,其主要并发症是心血管系统疾病,因此本文拟用L-甲状腺素诱导的心肌肥厚模型进行电压依赖性K+通道信使核糖核酸(mRNA)表达的研究,探讨甲亢状态下心律失常的机制。
1 材料与方法
动物试验:1998年4月～6月购16只雄性2月龄SD大鼠,体重235±30.5 g,由南京军区南京总医院动物实验中心提供。随机分成两组,实验组9只,对照组7只。每日早晨进食前实验组用羧甲基纤维素混悬的L-甲状腺素灌胃,剂量为每天1 mg/kg(每天给药前称体重,根据体重确定给药量);对照组根据体重给予相同体积的空白的羧甲基纤维素混悬液,连续10天,处死前禁食12小时,眼眶取血2 ml,用放射免疫标记法测定T3、T4的含量(由南京第一人民医院放射免疫中心测定),然后断头处死,迅速取心脏,蘸干血液后称重,取心室肌放入液氮中,瞬间冷却后转入-70℃冰箱中冷冻待用。
, 百拇医药
总核糖核酸(RNA)的提取 取100 mg左右的心肌组织,加入RNA提取专用试剂TRIzol(美国GIBCO公司),按试剂说明书进行操作,最后加入灭活RNA酶的去离子水10 μl重新溶解RNA,待用。
引物设计 为了得到扩增产物是总的电压依赖性K+通道,把引物设计在电压依赖性K+通道高度保守区的S4和H5链上[4],其引物序列分别为:5′-TTT-CAAGTTGTCCAGACACTC-3′,5′-TGTCTCCA-TAGCCTACAGTTG-3′,扩增片断长度为230 bp。根据文献报道核糖体蛋白S16与待检测K+通道mRNA具有相同的扩增动力学和相重合的指数扩增期[4,5],故选用其作内标准,其引物序列为5′引物5′-AGGAGCGATTTGCTGGTGTGGA-3′,3′引物5′-GCTACCAGGCCTTGAGATGGA-3′,扩增的片段长度为102 bp。
, 百拇医药
逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) 逆转录：取总RNA1～2 μg,加入MgCl25 mmol/L、1×反应缓冲液、三磷酸脱氧核苷(dNTP)1 mmol/L、rRNasin0.5 U、逆转录酶AMV15 U、引物为oligo(dT18)0.5 μg,总体积20 μ1。逆转录条件为:45℃60 min,99℃5 min,4℃5 min。
多聚酶链反应(PCR) 各成份浓度为:dNTP 1 mmol/L、MgCl21 mmol/L、Tag酶1 U、引物各加2 μ1,总体积为50 μ1。循环条件为:94℃30 s,53℃45 s,72℃1 min,循环30圈(美国PE2400PCR仪)。反应完毕,每管中加入溴酚蓝指示剂1 μl后上样,电泳完毕后,用即刻成像系统(GEL DOC 1000BIORAD)留取照片,进行密度扫描,将K+通道的扩增产物光密度值与内标准的光密度值相比,以比值计量。
, 百拇医药 统计学方法：试验结果用均数±标准差(
±s)表示,以单侧方差分析(ANOVA)检验组间差异,P<0.05有显著意义。2 结果
2.1 实验组与对照组大鼠体重无明显差异
实验组心脏与体重指数比明显高于对照组,其分别为0.34±0.15和0.30±0.12(P<0.05),血浆T3浓度两组无显著性差异,T4浓度实验组明显高于对照组,分别为14.57±5.08 mmol/L和4.31±0.72 mmol/L(P<0.01)。
2.2 选择合适的扩增循环数
在32个循环数以前,循环数与产物量(密度值)成正比,本实验选择循环数为30圈,确保产物量不受循环数影响,只与模板量相关。在上述条件下,PCR扩增产物条带清晰,无杂带干扰。
, 百拇医药
2.3 K+通道RT-PCR产物光密度扫描分析
K+通道与内标准RT-PCR扩增产物的电泳条带进行光密度扫描,以二者比值作半定量分析,结果可见:K+通道mRNA表达水平明显下降,实验组比对照组降低了42%(P<0.05)。(附图)
附图 多聚酶链反应分析大鼠心肌钾通道互补脱氧核糖核酸图。实验组：标准差为0.53，对照组：标准差为0.99。RT-PCR：逆转录多聚酶链反应
3 讨论
mRNA的测定是在分子水平上研究基因表达的常用方法,RT-PCR则以其灵敏度高,专一性好,快速简单的特点日益得到认可[5]。用RT-PCR进行mRNA定量需解决两个关键问题:引物与模板的结合效率和不同管扩增引起的“管效应”。用扩增动力学曲线寻找合适的扩增循环圈数,可有效地避免因结合效率不同而引起的误差。内标准与待测物在同一管中扩增,可以克服“管效应”以及随后样品处理所带来的误差,保证了方法的准确性。L-甲状腺素能提高人体的基础代谢率,增强交感神经的活动,增加心率与心脏的负荷,本研究结果表明L-甲状腺素灌胃(每天1mg/kg)，持续10天,可致大鼠心肌肥厚。
, http://www.100md.com
心肌肥厚常常伴随着心律失常,K+通道在心肌电生理中起着关键作用,本实验的结论认为L-甲状腺素诱导的心肌肥厚模型K+通道mRNA表达降低,细胞膜上K+通道减少,导致K+电流减小,K+电流的减小使心肌细胞复极化时间延长,易致心律失常。
曹文(1963-)女,主管药师,博士,主要从事心血管药理学研究
参考文献
1，Rozanski GJ,Xu Z,Zhang K,et al.Altered K+ current of ventricular myocytes in rats with chronic myocardial infarction.Am J Physiol,1998,43:H259—H265.
, 百拇医药
2，Takimoto K,Li DQ,Hershman KH,et al.Decreased expression of Kv4.2 and novel Kv4.3 K+ channel subunit mRNAs in ventricles of renovascular hyprtensive rats.Circ Res,1997,181:533—539.
3，Madhavi G,Boyu H,Praveer J.Nabil el-sherif.differential expression of voltage-gated K+ channel genes in left ventricular remodeled myocardium after experimental myocardial infarction.Circ Res,1996,79:669—675.
4，Zahradka P,Harris KD,Triggs—Raine B,et al.PCR-based analysis of voltage-gated K+ channels in vascular smooth muscle.Mol Cell Biol,1995,145:39—44.
5，Foley KP,Leonard MW,Engel JD.Quantitation of RNA using the polymerase chain reaction.Trends Genet,1993,9:380—385.
1999-11-14
2000-03-06, 百拇医药