广西HIV－1流行毒株膜蛋白基因的扩增与纯化
作者：梁绍伶 刘伟 陈杰 梁富雄 李荣健
单位：广西壮族自治区卫生防疫站 南宁 530021
关键词：HIV；1Env基因Nested；PCR
广西预防医学000301
[摘要] 目的扩增广西HIV 1感染者的HIV 1膜蛋白基因C2 V3区核酸片段并提纯回收，进行核苷酸序列测定与亚型分析。方法用淋巴细胞分离液从HIV 1感染者的静脉血中分离PBMCs，然后用多组不同的内外侧引物进行Nested PCR扩增HIV 1膜蛋白基因C2 V3区核酸片段，后用琼脂糖电泳进行提纯，用荧光标记末端终止物循环测序试剂盒进行测序，反应物用自动DNA序列分析仪进行序列测定和分析。结果经琼脂糖凝胶电泳检测，获得26份DNA阳性产物，阳性率为86.67%。不同引物的阳性率相差较大，根据扩增结果可以推断广西HIV 1流行毒株的基因变异程度。14份HIV 1核苷酸序列测定与亚型分析结果，9份为B亚型，5份为E亚型。结论广西存在E和B亚型HIV 1毒株的流行。
, http://www.100md.com
中图分类号：R373.9 文献标识码：A 文章编号：1007-158X(2000)03-0129-04
Amplification and purification of amplified fragments of
env genes of HIV 1 strains in Guangxi.
LIANG Shaoling,LIU Wei,CHEN Jie， et al.Center for Prevention and Control of HIV/AIDS of Guangxi Anti epidemic Station,Nanning 530021
[Abstract] Objectives HIV 1 C2 V3 region of env genes from sero positive people in Guangxi were amplified by nested PCR. The amplified fragments were purified by agarose gel electrophoresis and sequenced to identify the subtypes of HIV 1.Methods Firstly, PBMCs were isolated from peripheral blood samples from HIV 1 infected persons by lymphocytes separation medium. Secondly, nested PCR was used to amplify the gene of C2 V3 region of HIV 1 with different primers and agarose gel electrophoresis to purify the products. Sequencing was performed with fluorescence labeled terminal cycling sequencing kit. Results 26 out of 30 samples are positive, with a total positive rate of 86.67% . Positive rates are different from each other for different primers, which may deduce the variation degree of HIV 1 gene. Purified genes fragments amplified by nested PCR of C2 V3 region were used for sequencing and detection of the subtypes of HIV 1. 9 of 14 samples from blood donors were subtype B strains and the other 5 from injecting drug users subtype E. Conclusion The amplified fragments of HIV 1 env gene by nested PCR were able to be purified and sequenced. Positive rates of amplified fragments for different primers varied each other. There is a recent epidemic of both B and E subtype HIV 1 strains in Guangxi.
, http://www.100md.com
[Key Words] HIV 1 Env gene Nested PCR
近年来，在广西一些地区的不同人群中出现了人类免疫缺陷病毒(HIV 1)的流行。测定和分析感染人群中HIV 1的核苷酸序列和亚型分布对于弄清广西HIV感染的来源、传播途径和预测发展趋势，采取有效的预防和控制措施是十分重要的。研究表明[1]，根据HIV 1基因组中变异最大，同时也被研究得最多的膜蛋白基因(env)的核酸和氨基酸序列的同源性已确定了A J10种HIV 1亚型，各亚型的分布有明显的地区差异。应用套式聚合酶链反应(nested PCR)扩增HIV 1env基因C2-V3区并提纯回收是HIV 1核酸序列测定和亚型分析的前提。我们最近收集了30例HIV 1感染者的PBMCs采用nested PCR对其HIV 1的env基因C2 V3区扩增并提纯回收，用于序列测定和亚型分析。现将实验结果报告如下。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1对象和样品检测对象为广西30名经血液途径感染的经WB确认HIV 1抗体阳性的HIV 1感染者。其中12名为有到外省流动卖血史的职业卖血者，18名为静脉吸毒者。采集每名对象静脉血3～5ml，用肝素抗凝(2u/ml)，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞(PBMCs)提取DNA。
1.2PBMCsDNA制备用Qingen公司的QIAampBlood试剂盒提取PMBCsDNA，试剂由中国预防医学科学院病毒学研究所提供，具体方法按试剂说明进行。
1.3Nested PCR扩增HIV 1env基因及产物提纯回收按Nested PCR方法设计合成多对PCR产物，扩增HIV 1env基因。引物由中国预防医学科学院病毒学研究所提供，见表1。
用3组不同的引物在PE公司9600型PCR仪上分别进行3次扩增。先用引物envL～envI和envC～envK扩增。由于扩增产物阳性率低,改用引物B1-k和E7-1～E8-1进行第2次扩增，对第2次扩增阴性的标本用内侧引物E7～E8-1最后一次扩增。PCR反应混合物及反应条件见表2。
, 百拇医药
1.4PCR产物检测与纯化PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，与Marker对照判定无误后，切下特异扩增带，用Qiaegen公司的Qiaex试剂，按说明书提纯扩增的HIV 1DNA片段，回收得的DNA溶于10mM/LTris-HclpH8.7，经琼脂糖凝胶电泳后与分子量标准比较估算核酸浓度。所得到的提纯产物用于核苷酸序列测定和亚型分析，具体方法另文报告。
2 结果
2.1HIV 1env基因扩增30份标本用3组
表1 Nested-PCR引物 引物
序列
在B亚型国际标准株env基因的定位
(5'-3')
envL
, http://www.100md.com
TGGGGTACCTGTGTGGAAA
192
envI
AATAGAGTTAGGCAGGGTAT
2056
envC
CCAATTCCCATACATTATTG
480
envK
GGACAGCAGGAAGCACTATGGC
1536
, http://www.100md.com E7-1
TGTAAAACGACGGCCAGTCTCAA
770
CTACTGTTAAATGGTAGG
E8-1
CAGGAAACAGTCATGACCAT
1250
GGGAGGGGCATACATTGC
E7
TGTAAACGACGGCCAGTCTGT
823
, http://www.100md.com
AAATGGCAGTCTAGC
B1
ATGGGATCAAAGCCTAAAGCCATGTGT
335
k
GCGCCCATAGTGCTTCCTGCTGCTGCTCC
1530
表2PCR反应混合物及反应条件 反应混合物(μl)
第1次PCR
第2次PCR
10×缓冲液
, 百拇医药
3
5
25mMMg2+
0.6
1
2mMdNTP
3
5
20uM/L引物1
0.5
2
引物2
0.5
, http://www.100md.com
2
0.4uM/LTaq酶
0.5
1
H2O
11.9
29
标本
10
5
反应条件
变性
94℃2′
, 百拇医药
94℃2′
退火
53℃1′
53℃1′
延伸
72℃4′
72℃2′
循环数
30
30
72℃10′
72℃10′
不同的内外侧引物进行3轮Nested PCR。env基因扩增后，共检出26份DNA阳性，阳性率为86.67%，3轮Nested PCR扩增结果的阳性率差异有统计学意义，不同的引物敏感性明显不同，见表3。表3不同引物的HIV-1env基因扩增阳性率 NestedPCR
, http://www.100md.com
引物
阳性数
扩增数
阳性率(%)
第1轮
envL，envI
7
30
22.58
envC，envK
第2轮
B1，k
16
, http://www.100md.com
30
53.33
E7-1，E8-1
第3轮
B1，k
10
17
71.42
E7，E8-1
χ2=10.50,P<0.01
2.2enc基因扩增产物的纯化与回收26份env基因扩增产物，经纯化回收后有14份可用于HIV 1核苷酸序列测定和亚型分析，这些标本均是扩增产物量较大的，其DNA产物条带在琼脂糖凝胶上看得比较清晰。
, 百拇医药
2.3HIV 1核苷酸序列测定和亚型分析14份测序样品中9份来自职业供血员，为泰国B亚型，与包括泰国、缅甸及云南德宏在内的B亚型毒株序列十分接近，相互之间基因离散率在3.0%～4.4%的范围内；另5份来自静脉吸毒者，属于E亚型；与国际E亚型毒株的基因离散率最近,为5.6%。
3 讨论
目前根据HIV 1gag和env基因的序列的差异将HIV 1分为M群和O群。由于env基因的高度变异又将HIV 1M群分成A J10个亚型。各亚型之间的序列差异达30%，同一亚型之内也有3%～23%的差别，而O型间的差异高达50%[1～3]。用30份HIV 1抗体阳性的PBMCs，进行了3次nested PCR扩增HIV 1膜蛋白基因，扩增中使用了3组不同的内外侧引物，共扩增到26份DNA产物，阳性率为86.67%，尚有13.37%的标本未能扩增到envDNA产物。另外，3组引物的扩增结果相差明显，敏感性不同。从这些结果可以推断广西HIV 1的膜蛋白基因核苷酸序列有差异，至少有一个以上的亚型，env基因C2 V3区产物序列测定与亚型分析结果证实了这一点，广西HIV-1流行株至少有B和E两种亚型的流行[4]。有报道，HIV 1各亚型env基因核苷酸序列差异较大，A H亚型间的变异一般在22%～35%，而O亚型间的差异高达50%以上[3～5]。因此，在用nested PCR扩增env基因进行序列测定与亚型分析时必须考虑env基因的高度变异性，设计多组引物，提高敏感性。从本实验结果看出引物B1，k,E7,E7 1及E8 1的敏感性较高，可以考虑使用。HIV基因PCR检测在HIV感染的早期诊断，婴儿HIV感染的诊断等方面有重要意义[5～6]。但从本实验结果来看，不同的引物的敏感性不一样，在解释检测结果时应注意假阴性问题。设计引物时应选择HIV相对保守且缺乏二级结构的序列为扩增靶序列。在26份PCR产物中获得14份纯化物用于序列测定与亚型分析，其中9份标本为B亚型，5份为E亚型。从基因离散率比较结果看出，广西B亚型毒株的传入与流行在云南德宏州的相同亚型HIV 1毒株密切相关，而E亚型毒株则可能是由泰国经越南传入广西的。影响产物纯化回收效果的因素主要是env基因扩增产物含量的高低，如何提高Nested PCR产物的产量值得进一步研究。
, 百拇医药
卫生部全国协作课题
梁绍伶(1963-)，男，广西横县人，主要从事艾滋病的分子生物学研究和艾滋病/性病的现场干预预防控制工作。
参考文献
1 李敬云编著.艾滋病的病原学诊断.北京：军事医学科学出版社1995：14
2 WenigerBG,TakebeY,OuCY,etal.The molecularepidemiologyofHIVinAsia.AIDS,1994,8(suppl2):S1 S14
3 JansonsW.Geneticandphylogeneticanalysis ofen vsubtypes Gand Hincentral Africa.
AIDS Res Hum Retroviruses,1994,10:877-879 Guang xi Prev Med,June2000,Vol6No.3
, 百拇医药
4 陈杰，苏玲,梁绍伶,等.广西壮族自治区HIV 1流行毒株的基因序列测定与亚型分析.病毒学
报，1998，14(3)240-245
5 BrownAE,JacksonB,FullerSA,etal.Viral RNA in there solution of humanimmunodefi
ciency virus type1 diagnost icserology.Transfu sion,1997,37:926-929
6 Owens DK,Holodniy M,Garber AM,etal.Polymerase chain reaction for the diagnosis of
HIV infection inadults;Ameta analysiswithre commend at ions for clinical practice and study design.AnnIntern Med,1996,124:803-813
2000-03-22收稿，2000-04-15修回, 百拇医药
单位：广西壮族自治区卫生防疫站 南宁 530021
关键词：HIV；1Env基因Nested；PCR
广西预防医学000301
[摘要] 目的扩增广西HIV 1感染者的HIV 1膜蛋白基因C2 V3区核酸片段并提纯回收，进行核苷酸序列测定与亚型分析。方法用淋巴细胞分离液从HIV 1感染者的静脉血中分离PBMCs，然后用多组不同的内外侧引物进行Nested PCR扩增HIV 1膜蛋白基因C2 V3区核酸片段，后用琼脂糖电泳进行提纯，用荧光标记末端终止物循环测序试剂盒进行测序，反应物用自动DNA序列分析仪进行序列测定和分析。结果经琼脂糖凝胶电泳检测，获得26份DNA阳性产物，阳性率为86.67%。不同引物的阳性率相差较大，根据扩增结果可以推断广西HIV 1流行毒株的基因变异程度。14份HIV 1核苷酸序列测定与亚型分析结果，9份为B亚型，5份为E亚型。结论广西存在E和B亚型HIV 1毒株的流行。
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中图分类号：R373.9 文献标识码：A 文章编号：1007-158X(2000)03-0129-04
Amplification and purification of amplified fragments of
env genes of HIV 1 strains in Guangxi.
LIANG Shaoling,LIU Wei,CHEN Jie， et al.Center for Prevention and Control of HIV/AIDS of Guangxi Anti epidemic Station,Nanning 530021
[Abstract] Objectives HIV 1 C2 V3 region of env genes from sero positive people in Guangxi were amplified by nested PCR. The amplified fragments were purified by agarose gel electrophoresis and sequenced to identify the subtypes of HIV 1.Methods Firstly, PBMCs were isolated from peripheral blood samples from HIV 1 infected persons by lymphocytes separation medium. Secondly, nested PCR was used to amplify the gene of C2 V3 region of HIV 1 with different primers and agarose gel electrophoresis to purify the products. Sequencing was performed with fluorescence labeled terminal cycling sequencing kit. Results 26 out of 30 samples are positive, with a total positive rate of 86.67% . Positive rates are different from each other for different primers, which may deduce the variation degree of HIV 1 gene. Purified genes fragments amplified by nested PCR of C2 V3 region were used for sequencing and detection of the subtypes of HIV 1. 9 of 14 samples from blood donors were subtype B strains and the other 5 from injecting drug users subtype E. Conclusion The amplified fragments of HIV 1 env gene by nested PCR were able to be purified and sequenced. Positive rates of amplified fragments for different primers varied each other. There is a recent epidemic of both B and E subtype HIV 1 strains in Guangxi.
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[Key Words] HIV 1 Env gene Nested PCR
近年来，在广西一些地区的不同人群中出现了人类免疫缺陷病毒(HIV 1)的流行。测定和分析感染人群中HIV 1的核苷酸序列和亚型分布对于弄清广西HIV感染的来源、传播途径和预测发展趋势，采取有效的预防和控制措施是十分重要的。研究表明[1]，根据HIV 1基因组中变异最大，同时也被研究得最多的膜蛋白基因(env)的核酸和氨基酸序列的同源性已确定了A J10种HIV 1亚型，各亚型的分布有明显的地区差异。应用套式聚合酶链反应(nested PCR)扩增HIV 1env基因C2-V3区并提纯回收是HIV 1核酸序列测定和亚型分析的前提。我们最近收集了30例HIV 1感染者的PBMCs采用nested PCR对其HIV 1的env基因C2 V3区扩增并提纯回收，用于序列测定和亚型分析。现将实验结果报告如下。
1 材料与方法
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1.1对象和样品检测对象为广西30名经血液途径感染的经WB确认HIV 1抗体阳性的HIV 1感染者。其中12名为有到外省流动卖血史的职业卖血者，18名为静脉吸毒者。采集每名对象静脉血3～5ml，用肝素抗凝(2u/ml)，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞(PBMCs)提取DNA。
1.2PBMCsDNA制备用Qingen公司的QIAampBlood试剂盒提取PMBCsDNA，试剂由中国预防医学科学院病毒学研究所提供，具体方法按试剂说明进行。
1.3Nested PCR扩增HIV 1env基因及产物提纯回收按Nested PCR方法设计合成多对PCR产物，扩增HIV 1env基因。引物由中国预防医学科学院病毒学研究所提供，见表1。
用3组不同的引物在PE公司9600型PCR仪上分别进行3次扩增。先用引物envL～envI和envC～envK扩增。由于扩增产物阳性率低,改用引物B1-k和E7-1～E8-1进行第2次扩增，对第2次扩增阴性的标本用内侧引物E7～E8-1最后一次扩增。PCR反应混合物及反应条件见表2。
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1.4PCR产物检测与纯化PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，与Marker对照判定无误后，切下特异扩增带，用Qiaegen公司的Qiaex试剂，按说明书提纯扩增的HIV 1DNA片段，回收得的DNA溶于10mM/LTris-HclpH8.7，经琼脂糖凝胶电泳后与分子量标准比较估算核酸浓度。所得到的提纯产物用于核苷酸序列测定和亚型分析，具体方法另文报告。
2 结果
2.1HIV 1env基因扩增30份标本用3组
表1 Nested-PCR引物 引物
序列
在B亚型国际标准株env基因的定位
(5'-3')
envL
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TGGGGTACCTGTGTGGAAA
192
envI
AATAGAGTTAGGCAGGGTAT
2056
envC
CCAATTCCCATACATTATTG
480
envK
GGACAGCAGGAAGCACTATGGC
1536
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TGTAAAACGACGGCCAGTCTCAA
770
CTACTGTTAAATGGTAGG
E8-1
CAGGAAACAGTCATGACCAT
1250
GGGAGGGGCATACATTGC
E7
TGTAAACGACGGCCAGTCTGT
823
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AAATGGCAGTCTAGC
B1
ATGGGATCAAAGCCTAAAGCCATGTGT
335
k
GCGCCCATAGTGCTTCCTGCTGCTGCTCC
1530
表2PCR反应混合物及反应条件 反应混合物(μl)
第1次PCR
第2次PCR
10×缓冲液
, 百拇医药
3
5
25mMMg2+
0.6
1
2mMdNTP
3
5
20uM/L引物1
0.5
2
引物2
0.5
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2
0.4uM/LTaq酶
0.5
1
H2O
11.9
29
标本
10
5
反应条件
变性
94℃2′
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退火
53℃1′
53℃1′
延伸
72℃4′
72℃2′
循环数
30
30
72℃10′
72℃10′
不同的内外侧引物进行3轮Nested PCR。env基因扩增后，共检出26份DNA阳性，阳性率为86.67%，3轮Nested PCR扩增结果的阳性率差异有统计学意义，不同的引物敏感性明显不同，见表3。表3不同引物的HIV-1env基因扩增阳性率 NestedPCR
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引物
阳性数
扩增数
阳性率(%)
第1轮
envL，envI
7
30
22.58
envC，envK
第2轮
B1，k
16
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30
53.33
E7-1，E8-1
第3轮
B1，k
10
17
71.42
E7，E8-1
χ2=10.50,P<0.01
2.2enc基因扩增产物的纯化与回收26份env基因扩增产物，经纯化回收后有14份可用于HIV 1核苷酸序列测定和亚型分析，这些标本均是扩增产物量较大的，其DNA产物条带在琼脂糖凝胶上看得比较清晰。
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2.3HIV 1核苷酸序列测定和亚型分析14份测序样品中9份来自职业供血员，为泰国B亚型，与包括泰国、缅甸及云南德宏在内的B亚型毒株序列十分接近，相互之间基因离散率在3.0%～4.4%的范围内；另5份来自静脉吸毒者，属于E亚型；与国际E亚型毒株的基因离散率最近,为5.6%。
3 讨论
目前根据HIV 1gag和env基因的序列的差异将HIV 1分为M群和O群。由于env基因的高度变异又将HIV 1M群分成A J10个亚型。各亚型之间的序列差异达30%，同一亚型之内也有3%～23%的差别，而O型间的差异高达50%[1～3]。用30份HIV 1抗体阳性的PBMCs，进行了3次nested PCR扩增HIV 1膜蛋白基因，扩增中使用了3组不同的内外侧引物，共扩增到26份DNA产物，阳性率为86.67%，尚有13.37%的标本未能扩增到envDNA产物。另外，3组引物的扩增结果相差明显，敏感性不同。从这些结果可以推断广西HIV 1的膜蛋白基因核苷酸序列有差异，至少有一个以上的亚型，env基因C2 V3区产物序列测定与亚型分析结果证实了这一点，广西HIV-1流行株至少有B和E两种亚型的流行[4]。有报道，HIV 1各亚型env基因核苷酸序列差异较大，A H亚型间的变异一般在22%～35%，而O亚型间的差异高达50%以上[3～5]。因此，在用nested PCR扩增env基因进行序列测定与亚型分析时必须考虑env基因的高度变异性，设计多组引物，提高敏感性。从本实验结果看出引物B1，k,E7,E7 1及E8 1的敏感性较高，可以考虑使用。HIV基因PCR检测在HIV感染的早期诊断，婴儿HIV感染的诊断等方面有重要意义[5～6]。但从本实验结果来看，不同的引物的敏感性不一样，在解释检测结果时应注意假阴性问题。设计引物时应选择HIV相对保守且缺乏二级结构的序列为扩增靶序列。在26份PCR产物中获得14份纯化物用于序列测定与亚型分析，其中9份标本为B亚型，5份为E亚型。从基因离散率比较结果看出，广西B亚型毒株的传入与流行在云南德宏州的相同亚型HIV 1毒株密切相关，而E亚型毒株则可能是由泰国经越南传入广西的。影响产物纯化回收效果的因素主要是env基因扩增产物含量的高低，如何提高Nested PCR产物的产量值得进一步研究。
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卫生部全国协作课题
梁绍伶(1963-)，男，广西横县人，主要从事艾滋病的分子生物学研究和艾滋病/性病的现场干预预防控制工作。
参考文献
1 李敬云编著.艾滋病的病原学诊断.北京：军事医学科学出版社1995：14
2 WenigerBG,TakebeY,OuCY,etal.The molecularepidemiologyofHIVinAsia.AIDS,1994,8(suppl2):S1 S14
3 JansonsW.Geneticandphylogeneticanalysis ofen vsubtypes Gand Hincentral Africa.
AIDS Res Hum Retroviruses,1994,10:877-879 Guang xi Prev Med,June2000,Vol6No.3
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4 陈杰，苏玲,梁绍伶,等.广西壮族自治区HIV 1流行毒株的基因序列测定与亚型分析.病毒学
报，1998，14(3)240-245
5 BrownAE,JacksonB,FullerSA,etal.Viral RNA in there solution of humanimmunodefi
ciency virus type1 diagnost icserology.Transfu sion,1997,37:926-929
6 Owens DK,Holodniy M,Garber AM,etal.Polymerase chain reaction for the diagnosis of
HIV infection inadults;Ameta analysiswithre commend at ions for clinical practice and study design.AnnIntern Med,1996,124:803-813
2000-03-22收稿，2000-04-15修回, 百拇医药