mRNA差异显示技术的应用与改进
作者：周宁新 张效东 卢柏松 贾熙华 黄培堂
单位：周宁新 张效东(解放军总医院肝胆外科，北京 100853)；卢柏松 贾熙华 黄培堂(军事医学科学院生物工程研究所，北京 100071)
关键词：差异显示反转录法；聚丙烯酰胺凝胶电泳；单碱基锚定引物；随机引物
军医进修学院学报000303 [摘要]目的：克隆和研究高低分化胆管癌间差异表达基因。方法：对mRNA差异显示PCR(DDRT-PCR)的一系列条件进行了探索和改进，建立了有效的DDRT-PCR法。结果：在高、低分化胆管癌差异分化基因的研究方面获得了满意的结果，共获得 9 个有显著差异的cDNA片段，测序后进行同源序列比较，有一个与层粘连蛋白受体基因高度同源，还有一个可能是一个新基因的部分序列。结论：通过对传统方法的改进，大大提高了工作效率，降低了实验成本和工作量并对相关问题进行了探讨，为进一步的研究奠定了基础。
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中图号：R730.261 文献标识码：A
文章编号：1005-1139(2000)03-0168-04
Applications and improvements to the differential display method for gene analysis
ZHOU Ning-xin, ZHANG Xiao-dong, LU Bai-song, JIA Xi-hua, HUANG Pei-tang
(Department of Hepatobiliary Pancreatic Surgery, PLA general hospital, Beijing 100853, China)
Objective:Clone the differentially expressed genes between the well and poorly differentiated cholangiocarcinoma. Methods:A simple modification of primers and PCR conditions that gives rise to a more powerful mRNA differential display. A reverse Northern analysis that effectively eliminates the false positives isolated from differential display of mRNAs is applied. Preparation of probe by one-step labeling in reverse transcription reaction is found to be more effective and specific. Results: there are 9 fragments cloned. Conclusion:Analysis of multiple fragments of single slot blot, and requirement of RNA only in small amounts as compared to conventional Northern makes the protocol quick, effective, and economic.
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Key words:Differential display of mRNA; Reverse Northern blot; One base anchored primer; Arbitrary primer
分离及克隆组织不同发育阶段差异表达基因，对于了解组织的发育、分化及其相关疾病的发病机制及疾病的演化过程均具有重要意义。基于临床研究[1]的结果，我们采用Liang Peng[2] 1992 年建立的差异显示法(DDRT-PCR)，来寻找高、低分化胆管癌间差异表达基因的cDNA。根据我们实验设计的要求，在建立该方法的同时，对其实验流程及技术条件进行了探索、优化及改进，并结合我们的实验对该方法中的一些具体问题提出讨论。
1 材料和方法
1.1 组织来源 胆管癌组织取自解放军总医院肝胆外科临床手术标本，所有标本离体后立即置于液氮中，后转入 -80 ℃ 保存，同时取部分组织送病理科检查，以决定病理分型及分化等级。
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1.2 引物 锚定引物 3 条，分别是 T15A、 T15G、 T15C。随机引物 11 条。所有引物均为军科院生物工程研究所张京生合成。引物序列见附表。
1.3 总RNA的提取 采用GBICOL公司的TRIzol总RNA提取试剂盒。分别从高分化、低分化胆管癌组织中提取总RNA，测OD260、OD280值，用甲醛变性凝胶电泳检测RNA分子的完整性。
1.4 逆转录单链cDNA的合成 每个样品分三管进行逆转录，反应体积为 20 μl，每管分别加入： 1 μg total RNA, 5 μmol/L T15M, 0.5 mmol/L 4dNTPs, 20 U RNasin, 100 U MMLV reverse transcriptase (Premega公司)， 70 ℃ 温育 5 min 后，立即冰上，加入酶， 37 ℃ 温育 60 min， 95 ℃ 变性 5 min，置 -20 ℃ 保存。
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附表 DDRT-PCR引物序列 锚定引物
随机引物
T15G:5′TTTTTTTTTTTTTTTG3′
P1:5′CAAGCGAGGT3′
T15C:5′TTTTTTTTTTTTTTTC3′
P2:5′AACGCGCAAC3′
T15A:5′TTTTTTTTTTTTTTTA3′
P3:5′GTGGAAGCGT3′
P4:5′GGAAGCAGCT3′
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P5:5′CAGTGAGCGT3′
P6:5′G(C)TCACGGACG3′
P7:5′G(C)CCATGCACG3′
P8:5′GAGCTATGGC3′
P9:5′AGCCTGTGTC3′
P10:5′GAGCTATGGCATG3′
P11:5′AGCCTGTGTCTGA3′
1.5 cDNA鉴定 为了检验cDNA的质量(也间接体现总RNA的质量)，用管家基因β-肌动蛋白基因的一对特异引物P1：ATGTACGTAGCCATCCAGGC；P2：AAGGAAGGCTGGAAAAGAGC，以新合成的cDNA为模板，建立 20 μl 反应体系，PCR循环参数： 94 ℃， 3 min→(94 ℃， 30 s → 53 ℃， 60 s → 72 ℃， 60s)× 30 cycles → 72 ℃， 5 min → 4 ℃。取 5 μl PCR产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳，可观察到一条亮带(约 400 bp)。
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1.6 DDRT-PCR 在 20 μl 体系中对 2 μl 逆转录产物进行扩增， 2 μmol/L 4 dNTPs, 5 μmol/L 锚定引物T15M， 1 μmol/L 随机引物， 37 kBq (1 μCi) α-32P-dCTP(北京亚辉公司)， 1.5 U Taq酶(华美公司)。PCR循环参数： 94 ℃， 3 min → (94 ℃， 30 s → 38 ℃， 30 s → 68 ℃， 1 min)×2 cycles → (94 ℃，20 s → 48 ℃, 30 s → 68 ℃， 40 s) × 28 cycles → 68 ℃， 5 min → 4℃。
1.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影 取6 μl DD-PCR产物进行 6% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒定功率 50 W，电泳约 3 h，直至二甲苯氰接近凝胶底部，滤纸揭胶，覆保鲜膜后压X线片， -70 ℃ 曝光 14 h，显影。
1.8 差异片段的切取及再扩增 电泳后压片时就要定好位，显影后将X线片重新复位，用无菌刀片切下感兴趣的差异片段，并将凝胶及滤纸一起浸入 100 μl 去离子水中 10 min，煮沸 15 min，离心后上清移入一新管，加入 10 μl 3mol/L NaOAc, 5 μl (10 mg/ml) 糖元和 450 μl 100% 乙醇，混匀， -80 ℃ 放置 30 min， 4 ℃ 离心 10min，弃上清， 75% 乙醇洗涤沉淀 1 次，凉干后溶于 10 μl 去离子水中， -20 ℃ 保存。再扩增时，使用同样的引物组和PCR条件，只是提高 4 dNTPs浓度 (2 mmol/L)，无需同位素，PCR循环条件： 94 ℃， 3 min → (94 ℃， 30 s → 40 ℃， 60 s → 72 ℃， 40 s) × 35 cycles → 72 ℃， 5 min → 4 ℃。
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1.9 反向Northern blot鉴定 以混合纤维素膜作为支持物，先进行印迹，点样后，用化学变性及热变性法交联， 80 ℃ 烤 2 h 后，室温保存。标记探针基本上按照文献[9]进行。常规方法 68 ℃ 杂交 12 h，中等强度洗膜后放射自显影， -80 ℃ 压片 22 h，显影。
2 结 果
DDRT-PCR共切取了 32 个有差异的片段，见图 1 (放射自显影)。将此 32 个差异片段再扩增后点膜，进行反向Northern blot，共得到 9 个有显著差异的片段，见图 2 (放射自显影)。目前仅将其中的两个片段纯化后直接测序，测得的序列在Genbank数据库中进行同源序列比较，其中一个与Laminin Receptor基因高度同源，另一个与已知基因无同源，而与大量的EST序列高度同源(另文发表)。
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图1 左图。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
1、3泳道-高分化胆管癌；2、4泳道-低分化胆管癌；1、2泳道代表在同一对引物扩增后比较，有一条差异条带，见图中“D”所示；3、4泳道代表在另一对引物扩增后比较，无差异条带
图2 右图。反向Northern blont杂交结果
两张混合纤维素膜各有32个点，相同位置是同一PCR产物。H膜是用高分化胆管癌样品总RNA合成的探针进行杂交，L膜是用低分化胆管癌样品总RNA合成的探针进行杂交，杂交后，两张膜上共有9个有显著差异的片段，如图中箭头所示
3 讨 论
自从差异显示法发明以来，已有众多的实验室将其应用于生物医学研究的各个领域，方法上也有了很多改进，结合我们实验中的一些体会，在如下几方面进行讨论。
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3.1 比较系统的设计 正如Liang Peng[3]所述：DD-PCR中，基因表达差异越小，则假阳性率越低，分离的基因的相关性越强。因此，相对而言，实验设计时背景差异越小，越能分离出相关性强的cDNA片段。但背景差异大小是相对的，根据实验设计要求和研究的目的设计一个具有内对照的严密的比较系统是实验成功的前提条件。由于本实验是基于临床研究的结果，是对高、低分化胆管癌间差异表达基因进行分析，其比较系统内表型间差异明显，具有可比性。但从DD-PCR分离到的片段的相关性及其功能，尚需进一步鉴定及研究才能明确。
3.2 引物的设计 Liang Peng[2]最初建议使用 12 种不同类型的引物T11VN，其中V代表A、G或C，N代表四种核苷酸中的任何一种，使用这些引物，可以产生 12 个cDNA亚组分，它们应该几乎同等地代表某一特定细胞表达基因的 1/12，但也需做 12 次逆转录，去合成各自不同的cDNA组。后又建议使用T12MN引物，从而将cDNA亚组分的数量减少到 4 个，其中M代表A、G或C的简并混合物。其后，Liang Peng[5]等又将cDNA分组的数量减少到只有 3 个，他们证明使用 3 个单碱基锚定oligo(dT)引物可以解决与使用双核苷酸丰余引物相关的大部分问题，该方法亦被大家普遍使用。有人[6]也建议用较长的引物。但一般认为，较长的引物用来扩增特异的基因片段，而较短的引物用来扩增多个基因片段，尽管较长的引物也能产生复杂的cDNA谱，但实际上，许多条带代表的是同一mRNA片段，这是因为较长的引物在低严谨的条件下出现的“粘性”作用。
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3.3 PCR扩增条件的优化 有人[7]已观察到PCR的热力学框架很显著地改变简并PCR的成功率，选择的简并PCR扩增框架先在非严谨退火温度 (35 ～ 45 ℃) 下进行 2～5 个循环，随后在较严谨的退火温度下进行 25 ～ 40 个循环，缓和的退火条件使得引物的短互补区域与靶序列杂交，扩增两个循环以后，5′端延伸部分掺入扩增产物内作为后续扩增循环的模板，通过转换到较严谨的退火温度，可达到提高特异性的目的，而且，若在退火和延伸温度间安排 4～5 min 的爬升时间可获得更高的特异性。
我们采用低严谨及高严谨相结合的方法以求获得更多，更清晰的差异比较图谱。我们改变了常规的扩增方案，在头二个循环，用低严谨的条件，退火温度 36 ℃，这样可以有更多的不同丰度的cDNA的合成，在随后的 33 个循环中，用高严谨的条件，退火温度提高到 45 ℃，这样可获得更清晰的电泳图谱，没有背景拖尾。我们用此改进的PCR方案，每一泳道均有 100 多条带，且条带规整，无明显背景拖影，差异条带的比较一目了然。
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Liang Peng[8]等发现大部分 10-mer随机引物在第一次循环中和与其 3′ 末端完全配对的仅 5 个或 7 个核苷酸退火，但在下一个循环中，就会作为完整的 10-mer引物起作用。我们在摸索DD-PCR反应条件时，发现 10-mer随机引物的退火时间亦不需太长，采用相对较短的退火时间，同样能得到良好的结果。通常提高退火温度，降低退火和延伸时间可以提高PCR的特异性。
3.4 PCR反应体系中各成分的浓度 我们在摸索中，逐渐优化PCR条件，最后才获得满意结果。按我们条件合成的单链cDNA，最好稀释 10 倍使用，较浓则电泳后背景模糊一片，较淡则条带稀少。较低的 4 dNTPs浓度是为了保证同位素的充分结合。在 20 μl 反应体系中， 37 kBq α-32P-dCTP足够反应所需，多了浪费且使背景增高，而从公司定购的同位素往往是 370 MBq (10mCi)/ml，最好用前稀释成 37 MBq/ml，便于吸取。锚定引物与随机引物浓度基本保持 4∶1 或 5∶1。关于Mg2+浓度及Taq酶在其它文献中多有论述。总之，在DD-PCR中，由于实验设计的要求及引物设计的原因，往往没有固定不变的条件，要根据具体情况进行摸索及调整。
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3.5 假阳性的鉴定 DD-PCR易产生假阳性的原因有：①PCR时，用较短的引物及较低的退火温度。②电泳时，由于凝胶分辨率的限制而不能精确的切带。③污染的DNA。目前，至少有三种方法来鉴定DD-PCR结果中的假阳性片段。Liang Peng最开始建议用Northern印迹分析，但由于其工作量大，最近有人[9]提出反向Northern blot法(reverse Northern analysis)。我们在实验中采用了该方法并加以改进。我们基本采用其一步法标记探针的方法，未用尼龙膜，而用混合纤维素膜作为支持物，用常规杂交法，同样得到了很好的结果。我们认为与传统的Northern blot法相比，此方法更迅速、有效且经济实用。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970724)
作者简介：周宁新(1952-)，男，江苏省南京市人， 1985 年军医进修学院硕士毕业，解放军总医院肝胆外科主任医师、教授，科室副主任；发表论文 30 篇。电话：(010)66939817
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[参考文献]
[1]周宁新，王大东，黄志强胆管癌的病理学特征对手术后远期效果的影响[J].中国普通外科杂志，1998，7(4)：216219.
[2]Liang P, Pardee AB. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction [J]. Science, 1992,257:5072,967971.
[3]Peng Liang. Factors ensuring successful use of differential display [J]. METHODS, 1998,16:361364.
[4]Renu Wadhwa, Emma Duncan, Sunil C Kaul, et al. An effective elimination of false positives isolated from differential display of mRNAs [J]. Mol Biotech, 1996,6:213217.
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[5]Liang P, Zhu W, Zhang X, et al. Differential display using onebase anchored oligodT primers [J]. Nucleic Acids Res, 1995,22:57635764.
[6]Diachenko LB, Ledesma J, Chenchik AA, et al. Combining the technique of RNA fingerprinting and differential display to obtain differentially expressed mRNA [J]. Biochem Biophys Res Commun, 1996,219,3:824828.
[7]Compton T. Degenerate primers for DNA amplification. In: PCR protocls: A guide to methods and applications. Innis MA eds. San Diego, lifornia: Academic Press,3945
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[8]Liang PL, Averboukh AB Pardee. Method of differential display [J]. Methods Mol Genet, 1994,5:316.
[9]Lohmann J, Schickle H, Bosch TCG. REN display, a rapid and efficient method for monradioactive differential display and mRNA isolation [J]. Bio Techniques, 1995,18:2,200202.
收稿日期：2000-02-19； 修回日期：2000-03-04, 百拇医药
单位：周宁新 张效东(解放军总医院肝胆外科，北京 100853)；卢柏松 贾熙华 黄培堂(军事医学科学院生物工程研究所，北京 100071)
关键词：差异显示反转录法；聚丙烯酰胺凝胶电泳；单碱基锚定引物；随机引物
军医进修学院学报000303 [摘要]目的：克隆和研究高低分化胆管癌间差异表达基因。方法：对mRNA差异显示PCR(DDRT-PCR)的一系列条件进行了探索和改进，建立了有效的DDRT-PCR法。结果：在高、低分化胆管癌差异分化基因的研究方面获得了满意的结果，共获得 9 个有显著差异的cDNA片段，测序后进行同源序列比较，有一个与层粘连蛋白受体基因高度同源，还有一个可能是一个新基因的部分序列。结论：通过对传统方法的改进，大大提高了工作效率，降低了实验成本和工作量并对相关问题进行了探讨，为进一步的研究奠定了基础。
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中图号：R730.261 文献标识码：A
文章编号：1005-1139(2000)03-0168-04
Applications and improvements to the differential display method for gene analysis
ZHOU Ning-xin, ZHANG Xiao-dong, LU Bai-song, JIA Xi-hua, HUANG Pei-tang
(Department of Hepatobiliary Pancreatic Surgery, PLA general hospital, Beijing 100853, China)
Objective:Clone the differentially expressed genes between the well and poorly differentiated cholangiocarcinoma. Methods:A simple modification of primers and PCR conditions that gives rise to a more powerful mRNA differential display. A reverse Northern analysis that effectively eliminates the false positives isolated from differential display of mRNAs is applied. Preparation of probe by one-step labeling in reverse transcription reaction is found to be more effective and specific. Results: there are 9 fragments cloned. Conclusion:Analysis of multiple fragments of single slot blot, and requirement of RNA only in small amounts as compared to conventional Northern makes the protocol quick, effective, and economic.
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Key words:Differential display of mRNA; Reverse Northern blot; One base anchored primer; Arbitrary primer
分离及克隆组织不同发育阶段差异表达基因，对于了解组织的发育、分化及其相关疾病的发病机制及疾病的演化过程均具有重要意义。基于临床研究[1]的结果，我们采用Liang Peng[2] 1992 年建立的差异显示法(DDRT-PCR)，来寻找高、低分化胆管癌间差异表达基因的cDNA。根据我们实验设计的要求，在建立该方法的同时，对其实验流程及技术条件进行了探索、优化及改进，并结合我们的实验对该方法中的一些具体问题提出讨论。
1 材料和方法
1.1 组织来源 胆管癌组织取自解放军总医院肝胆外科临床手术标本，所有标本离体后立即置于液氮中，后转入 -80 ℃ 保存，同时取部分组织送病理科检查，以决定病理分型及分化等级。
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1.2 引物 锚定引物 3 条，分别是 T15A、 T15G、 T15C。随机引物 11 条。所有引物均为军科院生物工程研究所张京生合成。引物序列见附表。
1.3 总RNA的提取 采用GBICOL公司的TRIzol总RNA提取试剂盒。分别从高分化、低分化胆管癌组织中提取总RNA，测OD260、OD280值，用甲醛变性凝胶电泳检测RNA分子的完整性。
1.4 逆转录单链cDNA的合成 每个样品分三管进行逆转录，反应体积为 20 μl，每管分别加入： 1 μg total RNA, 5 μmol/L T15M, 0.5 mmol/L 4dNTPs, 20 U RNasin, 100 U MMLV reverse transcriptase (Premega公司)， 70 ℃ 温育 5 min 后，立即冰上，加入酶， 37 ℃ 温育 60 min， 95 ℃ 变性 5 min，置 -20 ℃ 保存。
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附表 DDRT-PCR引物序列 锚定引物
随机引物
T15G:5′TTTTTTTTTTTTTTTG3′
P1:5′CAAGCGAGGT3′
T15C:5′TTTTTTTTTTTTTTTC3′
P2:5′AACGCGCAAC3′
T15A:5′TTTTTTTTTTTTTTTA3′
P3:5′GTGGAAGCGT3′
P4:5′GGAAGCAGCT3′
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P5:5′CAGTGAGCGT3′
P6:5′G(C)TCACGGACG3′
P7:5′G(C)CCATGCACG3′
P8:5′GAGCTATGGC3′
P9:5′AGCCTGTGTC3′
P10:5′GAGCTATGGCATG3′
P11:5′AGCCTGTGTCTGA3′
1.5 cDNA鉴定 为了检验cDNA的质量(也间接体现总RNA的质量)，用管家基因β-肌动蛋白基因的一对特异引物P1：ATGTACGTAGCCATCCAGGC；P2：AAGGAAGGCTGGAAAAGAGC，以新合成的cDNA为模板，建立 20 μl 反应体系，PCR循环参数： 94 ℃， 3 min→(94 ℃， 30 s → 53 ℃， 60 s → 72 ℃， 60s)× 30 cycles → 72 ℃， 5 min → 4 ℃。取 5 μl PCR产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳，可观察到一条亮带(约 400 bp)。
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1.6 DDRT-PCR 在 20 μl 体系中对 2 μl 逆转录产物进行扩增， 2 μmol/L 4 dNTPs, 5 μmol/L 锚定引物T15M， 1 μmol/L 随机引物， 37 kBq (1 μCi) α-32P-dCTP(北京亚辉公司)， 1.5 U Taq酶(华美公司)。PCR循环参数： 94 ℃， 3 min → (94 ℃， 30 s → 38 ℃， 30 s → 68 ℃， 1 min)×2 cycles → (94 ℃，20 s → 48 ℃, 30 s → 68 ℃， 40 s) × 28 cycles → 68 ℃， 5 min → 4℃。
1.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影 取6 μl DD-PCR产物进行 6% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒定功率 50 W，电泳约 3 h，直至二甲苯氰接近凝胶底部，滤纸揭胶，覆保鲜膜后压X线片， -70 ℃ 曝光 14 h，显影。
1.8 差异片段的切取及再扩增 电泳后压片时就要定好位，显影后将X线片重新复位，用无菌刀片切下感兴趣的差异片段，并将凝胶及滤纸一起浸入 100 μl 去离子水中 10 min，煮沸 15 min，离心后上清移入一新管，加入 10 μl 3mol/L NaOAc, 5 μl (10 mg/ml) 糖元和 450 μl 100% 乙醇，混匀， -80 ℃ 放置 30 min， 4 ℃ 离心 10min，弃上清， 75% 乙醇洗涤沉淀 1 次，凉干后溶于 10 μl 去离子水中， -20 ℃ 保存。再扩增时，使用同样的引物组和PCR条件，只是提高 4 dNTPs浓度 (2 mmol/L)，无需同位素，PCR循环条件： 94 ℃， 3 min → (94 ℃， 30 s → 40 ℃， 60 s → 72 ℃， 40 s) × 35 cycles → 72 ℃， 5 min → 4 ℃。
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1.9 反向Northern blot鉴定 以混合纤维素膜作为支持物，先进行印迹，点样后，用化学变性及热变性法交联， 80 ℃ 烤 2 h 后，室温保存。标记探针基本上按照文献[9]进行。常规方法 68 ℃ 杂交 12 h，中等强度洗膜后放射自显影， -80 ℃ 压片 22 h，显影。
2 结 果
DDRT-PCR共切取了 32 个有差异的片段，见图 1 (放射自显影)。将此 32 个差异片段再扩增后点膜，进行反向Northern blot，共得到 9 个有显著差异的片段，见图 2 (放射自显影)。目前仅将其中的两个片段纯化后直接测序，测得的序列在Genbank数据库中进行同源序列比较，其中一个与Laminin Receptor基因高度同源，另一个与已知基因无同源，而与大量的EST序列高度同源(另文发表)。
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图1 左图。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
1、3泳道-高分化胆管癌；2、4泳道-低分化胆管癌；1、2泳道代表在同一对引物扩增后比较，有一条差异条带，见图中“D”所示；3、4泳道代表在另一对引物扩增后比较，无差异条带
图2 右图。反向Northern blont杂交结果
两张混合纤维素膜各有32个点，相同位置是同一PCR产物。H膜是用高分化胆管癌样品总RNA合成的探针进行杂交，L膜是用低分化胆管癌样品总RNA合成的探针进行杂交，杂交后，两张膜上共有9个有显著差异的片段，如图中箭头所示
3 讨 论
自从差异显示法发明以来，已有众多的实验室将其应用于生物医学研究的各个领域，方法上也有了很多改进，结合我们实验中的一些体会，在如下几方面进行讨论。
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3.1 比较系统的设计 正如Liang Peng[3]所述：DD-PCR中，基因表达差异越小，则假阳性率越低，分离的基因的相关性越强。因此，相对而言，实验设计时背景差异越小，越能分离出相关性强的cDNA片段。但背景差异大小是相对的，根据实验设计要求和研究的目的设计一个具有内对照的严密的比较系统是实验成功的前提条件。由于本实验是基于临床研究的结果，是对高、低分化胆管癌间差异表达基因进行分析，其比较系统内表型间差异明显，具有可比性。但从DD-PCR分离到的片段的相关性及其功能，尚需进一步鉴定及研究才能明确。
3.2 引物的设计 Liang Peng[2]最初建议使用 12 种不同类型的引物T11VN，其中V代表A、G或C，N代表四种核苷酸中的任何一种，使用这些引物，可以产生 12 个cDNA亚组分，它们应该几乎同等地代表某一特定细胞表达基因的 1/12，但也需做 12 次逆转录，去合成各自不同的cDNA组。后又建议使用T12MN引物，从而将cDNA亚组分的数量减少到 4 个，其中M代表A、G或C的简并混合物。其后，Liang Peng[5]等又将cDNA分组的数量减少到只有 3 个，他们证明使用 3 个单碱基锚定oligo(dT)引物可以解决与使用双核苷酸丰余引物相关的大部分问题，该方法亦被大家普遍使用。有人[6]也建议用较长的引物。但一般认为，较长的引物用来扩增特异的基因片段，而较短的引物用来扩增多个基因片段，尽管较长的引物也能产生复杂的cDNA谱，但实际上，许多条带代表的是同一mRNA片段，这是因为较长的引物在低严谨的条件下出现的“粘性”作用。
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3.3 PCR扩增条件的优化 有人[7]已观察到PCR的热力学框架很显著地改变简并PCR的成功率，选择的简并PCR扩增框架先在非严谨退火温度 (35 ～ 45 ℃) 下进行 2～5 个循环，随后在较严谨的退火温度下进行 25 ～ 40 个循环，缓和的退火条件使得引物的短互补区域与靶序列杂交，扩增两个循环以后，5′端延伸部分掺入扩增产物内作为后续扩增循环的模板，通过转换到较严谨的退火温度，可达到提高特异性的目的，而且，若在退火和延伸温度间安排 4～5 min 的爬升时间可获得更高的特异性。
我们采用低严谨及高严谨相结合的方法以求获得更多，更清晰的差异比较图谱。我们改变了常规的扩增方案，在头二个循环，用低严谨的条件，退火温度 36 ℃，这样可以有更多的不同丰度的cDNA的合成，在随后的 33 个循环中，用高严谨的条件，退火温度提高到 45 ℃，这样可获得更清晰的电泳图谱，没有背景拖尾。我们用此改进的PCR方案，每一泳道均有 100 多条带，且条带规整，无明显背景拖影，差异条带的比较一目了然。
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Liang Peng[8]等发现大部分 10-mer随机引物在第一次循环中和与其 3′ 末端完全配对的仅 5 个或 7 个核苷酸退火，但在下一个循环中，就会作为完整的 10-mer引物起作用。我们在摸索DD-PCR反应条件时，发现 10-mer随机引物的退火时间亦不需太长，采用相对较短的退火时间，同样能得到良好的结果。通常提高退火温度，降低退火和延伸时间可以提高PCR的特异性。
3.4 PCR反应体系中各成分的浓度 我们在摸索中，逐渐优化PCR条件，最后才获得满意结果。按我们条件合成的单链cDNA，最好稀释 10 倍使用，较浓则电泳后背景模糊一片，较淡则条带稀少。较低的 4 dNTPs浓度是为了保证同位素的充分结合。在 20 μl 反应体系中， 37 kBq α-32P-dCTP足够反应所需，多了浪费且使背景增高，而从公司定购的同位素往往是 370 MBq (10mCi)/ml，最好用前稀释成 37 MBq/ml，便于吸取。锚定引物与随机引物浓度基本保持 4∶1 或 5∶1。关于Mg2+浓度及Taq酶在其它文献中多有论述。总之，在DD-PCR中，由于实验设计的要求及引物设计的原因，往往没有固定不变的条件，要根据具体情况进行摸索及调整。
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3.5 假阳性的鉴定 DD-PCR易产生假阳性的原因有：①PCR时，用较短的引物及较低的退火温度。②电泳时，由于凝胶分辨率的限制而不能精确的切带。③污染的DNA。目前，至少有三种方法来鉴定DD-PCR结果中的假阳性片段。Liang Peng最开始建议用Northern印迹分析，但由于其工作量大，最近有人[9]提出反向Northern blot法(reverse Northern analysis)。我们在实验中采用了该方法并加以改进。我们基本采用其一步法标记探针的方法，未用尼龙膜，而用混合纤维素膜作为支持物，用常规杂交法，同样得到了很好的结果。我们认为与传统的Northern blot法相比，此方法更迅速、有效且经济实用。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970724)
作者简介：周宁新(1952-)，男，江苏省南京市人， 1985 年军医进修学院硕士毕业，解放军总医院肝胆外科主任医师、教授，科室副主任；发表论文 30 篇。电话：(010)66939817
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收稿日期：2000-02-19； 修回日期：2000-03-04, 百拇医药