当前位置: 首页 > 期刊 > 《中华外科杂志》 > 2000年第3期
编号:10240314
Fas配体在泌尿生殖肿瘤细胞系及肾癌组织中的表达
http://www.100md.com 《中华外科杂志》 2000年第3期
     作者:李宏军 俞莉章 郭应禄 丁义 刘漓波

    单位:100034 北京医科大学第一医院泌尿外科

    关键词:泌尿生殖系肿瘤;配体;癌,肾细胞

    中华外科杂志000313摘 要:目的 明确Fas配体在泌尿生殖肿瘤细胞系及肾癌组织中的表达情况。 方法 采用免疫细胞化学和反转录PCR(RT-PCR)法检测膀胱癌(T24、BIU-87、EJ)、肾癌(GRC-1、RCC-949)、前列腺癌(PC-3M)及10例肾癌组织中Fas配体的表达。 结果 免疫细胞化学方法检测细胞系中Fas配体表达于BIU-87、RCC-949和GRC-1细胞,而以BIU-87和RCC-949细胞系表达较强,在T24、EJ和PC-3M细胞系中未检测到Fas配体的表达;在6种泌尿生殖肿瘤细胞系中用RT-PCR方法证明Fas配体mRNA表达于4种肿瘤细胞系(GRC-1、RCC-949、BIU-87、PC-3M),而EJ与T24未检测到Fas配体mRNA的表达;RT-PCR检测10例肾癌组织中有8例存在FasL mRNA的表达。 结论 Fas配体在泌尿生殖肿瘤细胞系及肾癌组织中表达可能参与了恶性肿瘤的形成和进展。
, http://www.100md.com
    Expression of Fas ligand in urogenital malignant cell lines and renal cell carcinoma

    LI Hongjun, YU Lizhang, GUO Yinglu

    (Urological Department, First Hospital, Beijing Medical University,Beijing 100034, China.)

    Abstract:Objective To explore the expression of Fas ligand in urogenital malignant cell lines and renal cell carcinoma. Methods With immunocytochemistry and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), we detected the expression of Fas ligand (FasL) in 6 urogenital malignant cell lines, bladder carcinoma cell lines (T24, EJ, BIU-87), renal cell carcinoma cell lines (GRC-1, RCC-949),prostatic carcinoma cell line (PC-3M), and 10 cases of renal cell carcinoma. Results The expression of FasL was detected in 3 (BIU-87, RCC-949, GRC-1) of the 6 urogenital maligant cell lines with immunocytochemistry, and 4 (BIU-87, RCC-949, GRC-1, PC-3M) of 6 urogenital maligant cell lines with RT-PCR method. No expression of FasL was detected in bladder carcinoma cell lines T24 and EJ. Eight of 10 renal cell carcinoma tissues positively expressed FasL mRNA. Conclusions FasL can express in urogenital malignant cell lines and renal cell carcinoma.
, 百拇医药
    Key words:Urogenital neoplasms; Ligands; Carcinoma, renal cell

    Fas是近年发现的细胞凋亡信号受体,当与其特异性配体(Fas ligand, FasL)结合后,可以传导凋亡信号,诱导Fas所在细胞的凋亡[1]。Fas系统(包括Fas分子和FasL及其信号传导分子)在恶性疾病中的生物学作用还没有完全了解,但它在凋亡中的作用表明了它可以做为肿瘤生长的抑制因子。Fas分子的自然形式配体FasL是一个跨膜蛋白,主要表达于活化的T淋巴细胞膜上,也可以可溶性形式存在。近年发现FasL在淋巴系统外的一些组织细胞中也有表达,如睾丸、眼、脑、肾、结肠、肺、卵巢及某些上皮细胞,具有特殊意义,并与某些病理改变有关。在小鼠、大鼠和人类中均已证明Fas/FasL系统介导的凋亡作用的缺陷在自身免疫性疾病及肿瘤的病理发具有重要作用[1]。我们对6种泌尿生殖肿瘤细胞系及10例肾癌组织中FasL的表达进行了检测。
, 百拇医药
    资料和方法

    1.细胞和培养条件:6种泌尿生殖恶性肿瘤细胞系:膀胱癌(T24、EJ、 BIU-87)、肾细胞癌 (GRC-1、RCC-949 )和前列腺癌(PC-3M)取自本所免疫室。PC-3M是PC-3细胞系的一个变异体[2]。BIU-87、GRC-1和RCC-949分别来自膀胱癌和肾癌,这些细胞系的建株及其特性描述见文献[3-5]。所有的细胞系均用RPMI-1640(含有16% FCS,10 mmol Hepes和2 mmol谷氨酰胺)培养液培养于37℃的CO2孵箱内。培养细胞复苏后在4周内用于实验研究。

    2.肾癌组织的来源及贮存:10例肾癌组织新鲜标本来源于1997年1月至1998年1月本院泌尿外科肾细胞癌手术肾全切患者,并经病理确诊,标本离体后立刻置入液氮中保存备用。

    3.免疫细胞化学检测试剂与方法:检测FasL表达用一抗为亲和纯化的兔抗人FasL多克隆抗体(购自美国Santa Cruz Biotechnology)。生物素标记的羊抗兔IgG和LSAB复合物为美国Vector生物试剂公司产品,DAB为瑞士Fluka生化试剂公司产品。
, 百拇医药
    所有标本均在同一条件下采用链菌素亲生物素蛋白-过氧化酶连接法(LSAB)进行免疫细胞化学染色,一抗稀释度为1:100。各步骤间均用PBS洗片,用PBS代替一抗为阴性对照。阳性对照选用经病理确诊为淋巴瘤的病理石腊切片。

    用含16% FCS的RPMI-1640培养液常规方法进行细胞传代培养。当细胞生长状态稳定,呈对数生长期时,用0.25%胰酶和0.02% EDTA消化细胞,用培养液将消化下来的细胞重新悬浮,计数并调整到适当浓度后滴在预先经严格清洗(浸酸、无水乙醇)并消毒的载玻片上,放入湿盒内37℃、5% CO2孵箱内恒温培养约4~6 h,待细胞贴壁后将载玻片取出,PBS冲洗3次,冷丙酮固定10 min后自然干燥,放入4 ℃冰箱内保存,1周内进行免疫细胞化学染色。细胞膜出现棕黄色染色为阳性细胞。

    4.组织细胞总RNA的提取:应用异硫氰酸胍二步法(略加改进)从新鲜组织/液氮冻存组织和培养细胞中提取总RNA。
, http://www.100md.com
    5.RT-PCR法检测FasL的表达:2 μg总RNA(1 μl)+Oligod (T)0.1 μg(1 μl), 65℃,10 min后迅速冰浴1~2 min;25 μl的反转录体系包括5×buffer,dNTP,Rnasin,AMV的平衡体系,经42℃ 30~60 min反转录,经95℃ 5~10 min灭活后迅速冰浴1~2 min,-20℃保存用做PCR的模板(cDNA);50 μl的PCR体系包括10Xbuffer,dNTP,MgCl2,正反向引物各0.5 μl(50 pmol/μl),Taq酶0.2 μl (5 U/μl) cDNA模板2 μl的平衡体系,石蜡油30~50 μl。FasL引物序列[7]:sense (5′-CCCCTCCAGGCACAGTTCTTC-3′),antisense (5′-GTACAGCCCAGTTTCATTGAT-3′)。β-actin引物序列:sense (5′-GTTTGAGACCTTCAACACCCC-3′),antisense (5′-GTGGCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3' )。PCR扩增条件:94℃预变性5 min;循环条件94℃1 min,60℃,1 min,72 ℃,3 min, 40个循环,接72℃后延伸10 min。预先扩增β-actin来证明反转录模板的有效性。
, http://www.100md.com
    6.RT-PCR产物的分析:1%琼脂糖凝胶电泳,EB染色,采用IBM586计算机的分子分析软件的Gel Doc 1000成像系统进行图象分析和扫描。

    结果

    1.免疫细胞化学方法检测细胞系中FasL的表达:FasL表达于BIU-87、RCC-949和GRC-1细胞系,而以BIU-87和RCC-949细胞系表达较强。在T24、EJ和PC-3M细胞系中未检测到FasL的表达。

    2.RT-PCR方法检测细胞系中FasL mRNA的表达情况:在6种泌尿生殖肿瘤细胞系(T24、BIU-87、EJ、GRC-1、RCC-949和PC-3M)中用RT-PCR方法证明FasL mRNA表达于4种肿瘤细胞系(GRC-1、RCC-949、BIU-87、PC-3M),而EJ与T24未检测到FasL mRNA的表达。
, 百拇医药
    3.RT-PCR方法检测肾癌组织中FasL mRNA的表达情况: RT-PCR检测10例肾癌组织中有8例存在FasL mRNA的表达。

    讨论

    FasL存在于免疫系统活化的脾细胞和胸腺细胞表面,主要表达在活化的外周成熟T细胞及自然杀伤细胞表面。肿瘤细胞尚可能通过对活化的免疫系统细胞表面FasL表达的抑制作用或通过阻止膜结合形式FasL的有效切割与活性FasL的释放来抑制机体免疫活性细胞对肿瘤的排斥作用。

    某些恶性肿瘤细胞可以出现FasL的表达,如黑色素瘤、结肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、肾癌、头颈癌等,我们通过免疫细胞化学和RT-PCR方法检测的结果也证明了泌尿生殖系肿瘤细胞和肾癌组织中均可有FasL的表达[6]。执行免疫监视与清除机制的免疫活性细胞多数高表达Fas分子,局部表达的FasL可以诱导免疫活性细胞的凋亡作用,且对免疫活性细胞的杀伤作用比对其亲本细胞更敏感[7]。表达FasL的恶性肿瘤细胞尚可以通过可溶性FasL来对肿瘤以外远隔部位的免疫系统细胞免疫反应产生抑制作用,而且可溶性FasL的作用尚不仅局限于对免疫系统的影响,它还可以通过诱导周围组织的凋亡来加速肿瘤组织的浸润性生长[8],已在一些恶性肿瘤患者血清中证明了这种可溶性FasL的存在[9]。FasL的这些作用也可抑制机体的正常免疫监视与免疫清除机制,进一步促进了肿瘤的形成与进展,并可能参与恶性肿瘤的转移与种植过程[8]
, http://www.100md.com
    基金项目:国家自然科学基金资助项目(39770737)

    参考文献:

    [1]李宏军,俞莉章,郭应禄,等.Fas系统在肿瘤研究中的应用.中华外科杂志,1997,35:59-62.

    [2]Kozlowski JM, Fidler IJ, Campbell D, et al. Metastatic behavior of human tumor cell lines grown in the nude mouse. Cancer Res, 1984, 44:3522-3523.

    [3]俞莉章,黄雅丽,扬晨,等.人体膀胱移行细胞癌细胞系BIU-87的建立及其生物学特性.中华泌尿外科杂志,1989,10:131-135.

    [4]丁义,俞莉章,李鸣,等.人肾颗粒细胞癌细胞系(GRC-1)的建立及其生物学特性.中华泌尿外科杂志,1995,16:3-6.
, 百拇医药
    [5]侯建国,曹广文,李光辉,等.人肾透明细胞癌细胞系的建立及其生物学特性.中华实验外科杂志,1996,13:350-351.

    [6]Kong L, Ogawa N, Nakabayashi T, et al. Fas and Fas ligand expression in the salivary glands of patients with primary sjogren′s syndrome. Arthritis Rheum, 1997, 40: 87-97.

    [7]Seino K, Kayagaki N, Fukao K, et al. Rejection of Fas ligand-expres

    sing grafts. Transplatat Proc, 1997,29: 1092-1093.

, http://www.100md.com     [8]Shiraki K, Tsuji N, Shioda T, et al. Expression of Fas ligand in liver metastases of human colonic adenocarcinomas. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94: 6420-6425.

    [9]Tanaka M, Suda T, Takahashi T, et al. Expression of the functional so-luble form of human fas ligand in actived lymphocytes. EMBO J, 1995,14: 1129-1135.

    收稿日期:1999-08-27, 百拇医药