人脑挫伤后GFAP、PCNA的法医病理学研究
http://www.100md.com
法医学杂志 2000年第3期第16卷 论著
作者：陶陆阳 汪德文 刘萍 喻少波 郝春雨 吴旭
单位：陶陆阳(中国医科大学，辽宁沈阳 110001)；汪德文(中国医科大学，辽宁沈阳 110001)；刘萍(沈阳刑事科学技术研究所，辽宁 110002)；喻少波(辽宁中医学院，辽宁沈阳 110031)；郝春雨(辽宁中医学院，辽宁沈阳 110031)；吴旭(中国医科大学，辽宁沈阳 110001)
关键词：脑挫伤；免疫组织化学；图象分析
法医学杂志000304
[摘要]采用在实际工作中所遇到的脑挫伤案例标本，利用免疫组织化学染色，观察人脑挫伤后GFAP，PCNA的改变，用图象分析仪对免疫组织化学染色阳性细胞的面积和灰度等进行定量测量，EpiInfo统计软件分析，得出人脑挫伤后GFAP，PCNA变化的时间性规律，为脑挫伤形成时间推断，提供新的形态学依据。GFAP阳性细胞面积、灰度伤后24h即有显著增加(P<0.01)，7天达高峰(P<0.01)，以后有逐渐下降的趋势；PCNA阳性细胞面积、灰度于伤后4天达到最大值(P<0.01)，以后逐渐下降。因此，伤后人脑组织GFAP、PCNA免疫组织化学染色阳性细胞面积、灰度改变有时间规律，GFAP、PCNA可作为2天到20天间不同时间脑损伤的推断指标。
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[中图分类号]DF795.1 [文献标识码]A
[文章编号]1004-5619(2000)03-0137-02
The changes of GFAP and PCNA after human brain contusion: an immunohistochemical study in forensic pathology
Tao Luyang, et al.
(Institute of Forensic Sciences of ShenYang, ShenYang 110001, PRC)
In order to find out changes of GFAP and PCNA after human brain trauma, samples of 38 cases were studied by the immunnohistochemistry method combined with quantitative image analysis.The gray degree and area of PCNA positive cells increased to the maximum at the 4th day and then decreased gradually.GFAP positive cells began to increase significantly 12 hours after contusion, reached the maximum at the 4th day and stayed in high level until the 7th day.These results suggest that: (1)GFAP, PCNA show regular changes with survival time after brain contusion;(2)GFAP and PCNA can be used as time markers of brain contusion from 2- 20 days.
, 百拇医药
Key words: brain trauma; immunnohistochemistry; image analysis
颅脑损伤形成时间是法医实践中经常遇到的难题。本研究以实际案例材料，对人脑不同时间挫伤的石蜡切片分别进行HE染色和免疫组织化学染色，并对脑挫伤后脑内GFAP、PCNA等物质含量的时间性改变进行观察，图象分析，统计学处理，为法医病理学鉴定脑挫伤形成时间提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
第一抗体分别为兔抗人GFAP多克隆抗体、鼠抗人PCNA单克隆抗体，第二抗体及链亲和素-过氧化物酶溶液来源于S-P即用型试剂盒，上述均为福州迈新生物技术开发公司产品。
1.2 实验对象及分组
, http://www.100md.com
1.2.1 分组
实验组：选取死亡时间明确的1991～1998年成年人闭合性脑挫伤死亡案例，男女不限，年龄在22岁50岁之间，发育和营养均正常。脑损伤后(下简称伤后)立即死亡组7例，伤后24h死亡组4例，伤后48h死亡组3例，伤后4天死亡组7例，伤后7天死亡组6例，伤后11天死亡组6例，伤后20天死亡组2例，共计38例，其中男性32例，女性6例。
对照组:随机选取非脑损伤死亡者3例，年龄：分别为28、35、40岁，性别：男性2例，女性1例。
1.2.2 取材
选取局灶性脑皮质挫伤深度在1cm以内的部位，于挫伤区及周围部分脑组织取出2cm×2cm×2cm的组织块，放入中性福尔马林中固定一周后，取材(大小为1cm×1cm×0.3cm，包括挫伤区和周围区)进行脱水包埋制成蜡块并切片，以备免疫组织化学染色观察。
, 百拇医药
1.3 实验方法
免疫组织化学染色：链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组化染色(Streptavidin-Peroxidase.SP)法。
1.4 图象分析与统计学处理
应用Leuzex-F型图象分析仪，用400倍显微镜，在挫伤灶周围随机选5个视野，对免疫组织化学染色阳性反应物进行定量检测，测定阳性反应物的面积和灰度，然后在EpiInfo软件系统下进行统计学处理。
2 结果
2.1 胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组织化学染色结果
正常对照组GFAP阳性细胞为星形胶质细胞，细胞轮廓清晰，星状突起纤细，GFAP分布于胞浆及星状突起中，神经元及无突起的小圆形神经胶质细胞GFAP染色均为阴性；伤后即时死组，GFAP阳性染色细胞亦多为星形胶质细胞，但有的突起断裂，有的细胞形态变得不规则；伤后24h，GFAP阳性细胞数量有所增多，但以圆形居多，少量有突起；伤后48h时，GFAP阳性细胞数量进一步增多，突起增多明显，胞浆及突起染色加深；4天时，GFAP阳性细胞形态各异，数量增多，胞体变大，突起粗大不规则；7天时，GFAP阳性细胞增多达到高峰，阳性细胞着色深，呈深棕黄色，突起明显，粗大不规则；11天时，GFAP阳性细胞数量明显减少，突起减少;20天时,GFAP阳性细胞数量少,着色浅,突起消失(见图1～3)。
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图1 少量阳性胶质细胞，着色浅(伤后24h，PCNA染色)×400
图2 阳性胶质细胞明显增多，着色深(伤后4d，PCNA染色)×400
图3 多量阳性胶质细胞，着色变浅(伤后7d，PCNA染色)×400
2.2 增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学染色结果
正常对照组神经元及神经胶质细胞PCNA染色均为阴性，伤后即时死亡组亦未观察到PCNA阳性神经细胞；伤后24h，挫伤周围区可见PCNA阳性的神经元及神经胶质细胞，胞体较大，但数量较少；伤后48h检见多量PCNA阳性染色细胞，以神经胶质细胞为多；伤后4天，PCNA阳性染色细胞数量明显增多，几乎全部为神经胶质细胞，细胞核轮廓清晰，胞体大，着色深，阳性细胞数量及着色达到高峰；7天及11天时，亦有大量PCNA阳性神经胶质细胞，但着色逐渐变淡；伤后20天仍然可见PCNA阳性细胞，着色较浅(见图4～6)。
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图4 出现多量阳性胶质细胞且突起增多(伤后10h，GFAP染色)×400
图5 阳性胶质细胞数量及突起进一步增多(伤后4d，GFAP染色)×400
图6 阳性胶质细胞着色深,突起明显(伤后7d，GFAP染色)×400
2.3 图象分析及统计学处理
采用EpiInfo统计分析软件，进行t检验。
胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组织化学染色结果见表1，显示GFAP阳性细胞面积和灰度于24h组开始即与对照组有明显差异，7天达高峰，以后逐渐下降。
, 百拇医药
表1 脑损伤后不同时间GFAP染色胶质细胞面积与灰度的变化(X±S)
对照组
实验组
即时组
24h
48h
4天
7天
11天
20天
面积
10.8±5.02
, 百拇医药 43.6±20.15
252.3±48.62*
365.6±55.3
395.4±66.45**
434.6±71.35*
141±42.04*＃＃
187±48.77
灰度
101.07±2.13
102.11±2.11
112.14±1.87**＃
, 百拇医药
113.43±1.89**＃
119.58±2.34**
121.35±3.17**
117.62±2.19**＃
112.15±3.01
与对照组比较:*P<0.05 **P<0.01;与临近上组比较:＃P<0.05 ＃＃P<0.01
增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学染色结果见表2，可见PCNA阳性细胞面积和灰度于4天达高峰，在20天仍维持较高水平。
表2 脑损伤后不同时间PCNA染色胶质细胞面积与灰度的变化(X±S)
对照组
, 百拇医药
实验组
即时组
24h
48h
4天
7天
11天
20天
面积
0
0
13.9±5.43
104.8±41.55
, http://www.100md.com
216±80.17*
198±75.55
176±67.33
16.9±6.57**
灰度
0
0
110.22±3.08
115.07±2.52
141.04±5.19**
120.7±3.18
117.37±4.3
, 百拇医药
115.53±2.87
与24h组比较:*P<0.05 **P<0.01;与临近上组比较:＃P<0.05 ＃＃P<0.01
3 讨论
3.1 检材的选择
本研究以人脑为实验对象，选取闭合性脑损伤后不同时间内死亡的案例，切合实际。实验中设定分组区间，并将其损伤程度控制在1cm×1cm×1cm范围内的皮质部位取材，这样可以减小因实验对象不同和损伤程度不同带来的差异。
3.2 免疫组化染色的时间性变化
3.2.1 GFAP染色时间性变化
胶质纤维酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)是星形胶质细胞表达的丝状蛋白介质即特征性蛋白，脑损伤后星形胶质细胞增生是脑损伤反应之一。本次实验研究发现,随时间的改变,GFAP阳性细胞数逐渐增多,灰度逐渐增强,到7天达到高峰,以后逐渐下降,各实验组与对照组阳性细胞灰度和面积均有显著差异(P<0.01)，结果与前人实验结果大致相同。
, 百拇医药
3.2.2 PCNA染色时间性变化
增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen-PCNA)又称周期蛋白(Cyclin)，首先由Miyachi提纯。PCNA是一种核内蛋白质，它的出现明显与细胞增殖有关，因此认为它可以作为评价细胞增殖状态的一个指标[1]。
近几年有些学者应用PCNA免疫组织化学方法研究脑损伤时间，发现PCNA阳性细胞在伤后12h出现，灰度呈上升趋势，面积呈下降趋势，在三天时达到最大值[2]。本次实验在脑挫伤后24h即发现有PCNA染色阳性细胞,伤后4天达到高峰,48h组,4天,7天,11天组PCNA阳性细胞面积均与对照组有明显差异(P<0.01),伤后4天组PCNA阳性细胞灰度与其他各组有差异(P<0.05)，结果与以往动物实验有所不同，以往实验只局限于短时间(3天)以内死亡的动物实验，本次应用人脑实验，其PCNA阳性细胞面积及灰度均呈上升趋势，直到达到高峰后才开始下降，这可能与人脑在挫伤修复过程中胶质细胞反应发展有关。但PCNA阳性细胞只出现在损伤周围区，并与大量PCNA阴性细胞混合分布。这说明脑损伤后细胞增殖只为所有细胞中的一小部分，而S-100和GFAP阳性细胞增多，形态改变，染色增强可能是由于损伤区星形胶质细胞的GFAPmRNA表达增强，合成大量GFAP[4]以及损伤周围区星形胶质细胞向损伤区聚集和原位星形胶质细胞的肥大改变[3]，同时也有少量星形胶质细胞增生造成，增生从48h到4天逐渐达到高峰，以后逐渐减少。但本次实验在脑损伤后20天PCNA阳性细胞灰度和面积与对照组有明显差异，是否与人脑细胞损伤后存活时间长且在恢复过程胶质细胞反应逐渐增强有关值得进一步探讨。
, 百拇医药
上述两项免疫组织化学指标，均有阳性物质出现、高峰和下降的过程，用两项指标联合判断、综合分析脑挫伤时间更具有科学性和准确性。
参考文献:
[1] Miyachi K, Fritzler,MJ,Tan EM. Autoantibody to a nuclear antigen in proliferating cells[J].J Immune,1978,121:2228- 2234.
[2]黄杰雄，黄致治.增殖细胞核抗原研究进展[J].国外医学生理病理科学与临床分册，1994,14：9.
[3] Condorell DF,Dell′ Albani P,Kaczmarek L,et al.Glial fribrillary acidic protein messenger RNA and glutamine synthetase activity after nervous system injury[J]. J Neurosci Res,1990,26:251.
[4] Takamiya Y,Kohsaka S,Toya S,et al. Immunohistochemical studies on the proliferation of reactive astrocytes and the expression of cytoskeletal proteins following brain injury in rats [J]. Development Brain Research ,1988,38:201- 210.
(收稿日期：1999-09-15修回日期：1999-11-23), 百拇医药
单位：陶陆阳(中国医科大学，辽宁沈阳 110001)；汪德文(中国医科大学，辽宁沈阳 110001)；刘萍(沈阳刑事科学技术研究所，辽宁 110002)；喻少波(辽宁中医学院，辽宁沈阳 110031)；郝春雨(辽宁中医学院，辽宁沈阳 110031)；吴旭(中国医科大学，辽宁沈阳 110001)
关键词：脑挫伤；免疫组织化学；图象分析
法医学杂志000304
[摘要]采用在实际工作中所遇到的脑挫伤案例标本，利用免疫组织化学染色，观察人脑挫伤后GFAP，PCNA的改变，用图象分析仪对免疫组织化学染色阳性细胞的面积和灰度等进行定量测量，EpiInfo统计软件分析，得出人脑挫伤后GFAP，PCNA变化的时间性规律，为脑挫伤形成时间推断，提供新的形态学依据。GFAP阳性细胞面积、灰度伤后24h即有显著增加(P<0.01)，7天达高峰(P<0.01)，以后有逐渐下降的趋势；PCNA阳性细胞面积、灰度于伤后4天达到最大值(P<0.01)，以后逐渐下降。因此，伤后人脑组织GFAP、PCNA免疫组织化学染色阳性细胞面积、灰度改变有时间规律，GFAP、PCNA可作为2天到20天间不同时间脑损伤的推断指标。
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[中图分类号]DF795.1 [文献标识码]A
[文章编号]1004-5619(2000)03-0137-02
The changes of GFAP and PCNA after human brain contusion: an immunohistochemical study in forensic pathology
Tao Luyang, et al.
(Institute of Forensic Sciences of ShenYang, ShenYang 110001, PRC)
In order to find out changes of GFAP and PCNA after human brain trauma, samples of 38 cases were studied by the immunnohistochemistry method combined with quantitative image analysis.The gray degree and area of PCNA positive cells increased to the maximum at the 4th day and then decreased gradually.GFAP positive cells began to increase significantly 12 hours after contusion, reached the maximum at the 4th day and stayed in high level until the 7th day.These results suggest that: (1)GFAP, PCNA show regular changes with survival time after brain contusion;(2)GFAP and PCNA can be used as time markers of brain contusion from 2- 20 days.
, 百拇医药
Key words: brain trauma; immunnohistochemistry; image analysis
颅脑损伤形成时间是法医实践中经常遇到的难题。本研究以实际案例材料，对人脑不同时间挫伤的石蜡切片分别进行HE染色和免疫组织化学染色，并对脑挫伤后脑内GFAP、PCNA等物质含量的时间性改变进行观察，图象分析，统计学处理，为法医病理学鉴定脑挫伤形成时间提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
第一抗体分别为兔抗人GFAP多克隆抗体、鼠抗人PCNA单克隆抗体，第二抗体及链亲和素-过氧化物酶溶液来源于S-P即用型试剂盒，上述均为福州迈新生物技术开发公司产品。
1.2 实验对象及分组
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1.2.1 分组
实验组：选取死亡时间明确的1991～1998年成年人闭合性脑挫伤死亡案例，男女不限，年龄在22岁50岁之间，发育和营养均正常。脑损伤后(下简称伤后)立即死亡组7例，伤后24h死亡组4例，伤后48h死亡组3例，伤后4天死亡组7例，伤后7天死亡组6例，伤后11天死亡组6例，伤后20天死亡组2例，共计38例，其中男性32例，女性6例。
对照组:随机选取非脑损伤死亡者3例，年龄：分别为28、35、40岁，性别：男性2例，女性1例。
1.2.2 取材
选取局灶性脑皮质挫伤深度在1cm以内的部位，于挫伤区及周围部分脑组织取出2cm×2cm×2cm的组织块，放入中性福尔马林中固定一周后，取材(大小为1cm×1cm×0.3cm，包括挫伤区和周围区)进行脱水包埋制成蜡块并切片，以备免疫组织化学染色观察。
, 百拇医药
1.3 实验方法
免疫组织化学染色：链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组化染色(Streptavidin-Peroxidase.SP)法。
1.4 图象分析与统计学处理
应用Leuzex-F型图象分析仪，用400倍显微镜，在挫伤灶周围随机选5个视野，对免疫组织化学染色阳性反应物进行定量检测，测定阳性反应物的面积和灰度，然后在EpiInfo软件系统下进行统计学处理。
2 结果
2.1 胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组织化学染色结果
正常对照组GFAP阳性细胞为星形胶质细胞，细胞轮廓清晰，星状突起纤细，GFAP分布于胞浆及星状突起中，神经元及无突起的小圆形神经胶质细胞GFAP染色均为阴性；伤后即时死组，GFAP阳性染色细胞亦多为星形胶质细胞，但有的突起断裂，有的细胞形态变得不规则；伤后24h，GFAP阳性细胞数量有所增多，但以圆形居多，少量有突起；伤后48h时，GFAP阳性细胞数量进一步增多，突起增多明显，胞浆及突起染色加深；4天时，GFAP阳性细胞形态各异，数量增多，胞体变大，突起粗大不规则；7天时，GFAP阳性细胞增多达到高峰，阳性细胞着色深，呈深棕黄色，突起明显，粗大不规则；11天时，GFAP阳性细胞数量明显减少，突起减少;20天时,GFAP阳性细胞数量少,着色浅,突起消失(见图1～3)。
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图1 少量阳性胶质细胞，着色浅(伤后24h，PCNA染色)×400
图2 阳性胶质细胞明显增多，着色深(伤后4d，PCNA染色)×400
图3 多量阳性胶质细胞，着色变浅(伤后7d，PCNA染色)×400
2.2 增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学染色结果
正常对照组神经元及神经胶质细胞PCNA染色均为阴性，伤后即时死亡组亦未观察到PCNA阳性神经细胞；伤后24h，挫伤周围区可见PCNA阳性的神经元及神经胶质细胞，胞体较大，但数量较少；伤后48h检见多量PCNA阳性染色细胞，以神经胶质细胞为多；伤后4天，PCNA阳性染色细胞数量明显增多，几乎全部为神经胶质细胞，细胞核轮廓清晰，胞体大，着色深，阳性细胞数量及着色达到高峰；7天及11天时，亦有大量PCNA阳性神经胶质细胞，但着色逐渐变淡；伤后20天仍然可见PCNA阳性细胞，着色较浅(见图4～6)。
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图4 出现多量阳性胶质细胞且突起增多(伤后10h，GFAP染色)×400
图5 阳性胶质细胞数量及突起进一步增多(伤后4d，GFAP染色)×400
图6 阳性胶质细胞着色深,突起明显(伤后7d，GFAP染色)×400
2.3 图象分析及统计学处理
采用EpiInfo统计分析软件，进行t检验。
胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组织化学染色结果见表1，显示GFAP阳性细胞面积和灰度于24h组开始即与对照组有明显差异，7天达高峰，以后逐渐下降。
, 百拇医药
表1 脑损伤后不同时间GFAP染色胶质细胞面积与灰度的变化(X±S)
对照组
实验组
即时组
24h
48h
4天
7天
11天
20天
面积
10.8±5.02
, 百拇医药 43.6±20.15
252.3±48.62*
365.6±55.3
395.4±66.45**
434.6±71.35*
141±42.04*＃＃
187±48.77
灰度
101.07±2.13
102.11±2.11
112.14±1.87**＃
, 百拇医药
113.43±1.89**＃
119.58±2.34**
121.35±3.17**
117.62±2.19**＃
112.15±3.01
与对照组比较:*P<0.05 **P<0.01;与临近上组比较:＃P<0.05 ＃＃P<0.01
增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学染色结果见表2，可见PCNA阳性细胞面积和灰度于4天达高峰，在20天仍维持较高水平。
表2 脑损伤后不同时间PCNA染色胶质细胞面积与灰度的变化(X±S)
对照组
, 百拇医药
实验组
即时组
24h
48h
4天
7天
11天
20天
面积
0
0
13.9±5.43
104.8±41.55
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216±80.17*
198±75.55
176±67.33
16.9±6.57**
灰度
0
0
110.22±3.08
115.07±2.52
141.04±5.19**
120.7±3.18
117.37±4.3
, 百拇医药
115.53±2.87
与24h组比较:*P<0.05 **P<0.01;与临近上组比较:＃P<0.05 ＃＃P<0.01
3 讨论
3.1 检材的选择
本研究以人脑为实验对象，选取闭合性脑损伤后不同时间内死亡的案例，切合实际。实验中设定分组区间，并将其损伤程度控制在1cm×1cm×1cm范围内的皮质部位取材，这样可以减小因实验对象不同和损伤程度不同带来的差异。
3.2 免疫组化染色的时间性变化
3.2.1 GFAP染色时间性变化
胶质纤维酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)是星形胶质细胞表达的丝状蛋白介质即特征性蛋白，脑损伤后星形胶质细胞增生是脑损伤反应之一。本次实验研究发现,随时间的改变,GFAP阳性细胞数逐渐增多,灰度逐渐增强,到7天达到高峰,以后逐渐下降,各实验组与对照组阳性细胞灰度和面积均有显著差异(P<0.01)，结果与前人实验结果大致相同。
, 百拇医药
3.2.2 PCNA染色时间性变化
增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen-PCNA)又称周期蛋白(Cyclin)，首先由Miyachi提纯。PCNA是一种核内蛋白质，它的出现明显与细胞增殖有关，因此认为它可以作为评价细胞增殖状态的一个指标[1]。
近几年有些学者应用PCNA免疫组织化学方法研究脑损伤时间，发现PCNA阳性细胞在伤后12h出现，灰度呈上升趋势，面积呈下降趋势，在三天时达到最大值[2]。本次实验在脑挫伤后24h即发现有PCNA染色阳性细胞,伤后4天达到高峰,48h组,4天,7天,11天组PCNA阳性细胞面积均与对照组有明显差异(P<0.01),伤后4天组PCNA阳性细胞灰度与其他各组有差异(P<0.05)，结果与以往动物实验有所不同，以往实验只局限于短时间(3天)以内死亡的动物实验，本次应用人脑实验，其PCNA阳性细胞面积及灰度均呈上升趋势，直到达到高峰后才开始下降，这可能与人脑在挫伤修复过程中胶质细胞反应发展有关。但PCNA阳性细胞只出现在损伤周围区，并与大量PCNA阴性细胞混合分布。这说明脑损伤后细胞增殖只为所有细胞中的一小部分，而S-100和GFAP阳性细胞增多，形态改变，染色增强可能是由于损伤区星形胶质细胞的GFAPmRNA表达增强，合成大量GFAP[4]以及损伤周围区星形胶质细胞向损伤区聚集和原位星形胶质细胞的肥大改变[3]，同时也有少量星形胶质细胞增生造成，增生从48h到4天逐渐达到高峰，以后逐渐减少。但本次实验在脑损伤后20天PCNA阳性细胞灰度和面积与对照组有明显差异，是否与人脑细胞损伤后存活时间长且在恢复过程胶质细胞反应逐渐增强有关值得进一步探讨。
, 百拇医药
上述两项免疫组织化学指标，均有阳性物质出现、高峰和下降的过程，用两项指标联合判断、综合分析脑挫伤时间更具有科学性和准确性。
参考文献:
[1] Miyachi K, Fritzler,MJ,Tan EM. Autoantibody to a nuclear antigen in proliferating cells[J].J Immune,1978,121:2228- 2234.
[2]黄杰雄，黄致治.增殖细胞核抗原研究进展[J].国外医学生理病理科学与临床分册，1994,14：9.
[3] Condorell DF,Dell′ Albani P,Kaczmarek L,et al.Glial fribrillary acidic protein messenger RNA and glutamine synthetase activity after nervous system injury[J]. J Neurosci Res,1990,26:251.
[4] Takamiya Y,Kohsaka S,Toya S,et al. Immunohistochemical studies on the proliferation of reactive astrocytes and the expression of cytoskeletal proteins following brain injury in rats [J]. Development Brain Research ,1988,38:201- 210.
(收稿日期：1999-09-15修回日期：1999-11-23), 百拇医药