反义bcl-2寡脱氧核苷酸对BcaCD885细胞内源性bcl-2表达的阻断作用
作者：何永文 王升志 赵德萍 毛租彝 高志
单位：何永文(昆明医学院第一附属医院口腔颌面外科650031)；毛租彝(华西医科大学口腔医学院)；高志(华西医科大学口腔医学院)；王升志(汕头大学医学院第一附属医院)；赵德萍(云南省肿瘤研究所)
关键词：反义寡脱氧核苷酸； BcaCD885细胞； bcl-2基因
口腔颌面外科杂志000317 摘 要：目的 探讨与bcl-2翻译起始部位碱基互补的反义bcl-2寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotide,ODN)对Bca-CD885细胞内源性bcl-2表达的阻断作用。方法 以脂质体Lepofectin为载体，一过性转染20μmol/L反义及正义bcl-2 ODN于BcaCD885细胞中，FCM-抗体观测转染后24h、36h、48h细胞内bcl-2基因蛋白表达变化，RT-PCR技术检测转染后24h bcl-2 mRNA的表达变化。结果 转染反义bcl-2 ODN后24h、36h、48h BcaCD885细胞内bcl-2基因蛋白表达与对照组相比都明显下降(P<0.05)，而正义组与对照组无差异(P>0.05)；正反义组bcl-2 mRNA与对照组相比无明显变化(P>0.05)。结论 反义bcl-2 ODN能在蛋白翻译水平特异性抑制颊癌细胞内源性bcl-2蛋白表达。
, 百拇医药
中图分类号：R739.8 文献标识码：A 文章编号：1005-4979(2000)03-0243-04
INHIBITION OF THE EXPRESSION OF INTRINSICAL BCL-2
PROTEIN BY ANTISENSE OLIGODEOXYNUCLEOTIDES IN BcaCD885 CELLS
HE Yong-wen，WANG Sheng-zi，ZHAO De-ping，et al.
(Stomatological Department，KunmingMedical College)
Abstract：Objective To study the function of antisense oligodeoxyncleotides which complements to translation-initiation site of human bcl-2 mRNA in inhibition of the expression of intrinsical bcl-2 protein in BcaCD885 cells. Method Through lepofectin vector，we transfected 20 μm sense (5′-GGG AAG GAT GGC GCA CGC TG-3′) or antisense (5′-CAG CGT GCG CCA TCC TTC CC-3′) bcl-2 oligodeoxynucleotids into human BcaCD885 cells in 12 hours with 37°C and 5% CO2 conditions. At 24 h，36 h and 48 h after transfection，we studied the expession of bcl-2 protein with bcl-2 polyclonal antibody by flow cytometry analysi (FCM). At 24 h after transfection，we studied the expression of bcl-2 mRNA through reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) technique. Total RNA was extracted from cell sample with TRIzol kit. Primer pairs used fr PCR are: bcl-2 mRNA (385 bp) Forward 5′-ACT TGT GGC CCA GAT AGG CAC CCA G-3′，Reverse 5′-GCA CTT CGC CGA GAT GTC CAG CCA G-3′; β-actin mRNA ((154bp) Forward 5′-TCA TCA CCA TTG GCA ATG AG-3′，Reverse 5′-GTG TTG GCG TAC AGG T-3′. PCR samples were run through 1.8% agarose gel and specific amplified lines were analysised with UVP GDS-800 system. Bcl-2 mRNA quantity was the ratio of bcl-2 line density to β-actin line density. Results At 24 h，36 h and 48 h after transfection of antisense bcl-2 oligodeoxynucleotids，there was down-regulation of bcl-2 protein in BcaCD885 cells. But the expression of bcl-2 protein did not change after transfection of sense bcl-2 oligo deoxynucleotids. The expression of bcl-2 mRNA was the same in the antisense or sense group with the control group. Conclusion Antisense bcl-2 oligodeoxynucleotids can inhibite intrinsical bcl-2 protein expression in BcaCD885 cells.
, 百拇医药
Key words：Antisense oligodeoxynucleotide； BcaCD885 cells； Bcl-2 gene
在细胞中基因的表达通常是由结合蛋白、抑制剂及激动剂所调控的。直到最近才确认调节RNA序列可作为基因表达的直接抑制剂。我们以往的研究证明BcaCD885颊癌细胞中存在bcl-2表达，且其表达水平与热诱导细胞凋亡存在负相关关系[1]。鉴于此，我们以BcaCD885细胞为靶细胞，观察与bcl-2翻译起始部位碱基互补的反义bcl-2寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotide，ODN)对细胞内源性bcl-2表达的阻断作用。
1 材料与方法
1.1 主要仪器设备及试剂
Elite ESP型流式细胞仪(美国Coulter公司)；UV GDS-800凝胶成像分析系统；PCR扩增仪(Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler);反义bcl-2 ODN：5′-CAG CGT GCG CCA TCC TTC CC-3′，正义bcl-2 ODN; 5′-GGG AAG GAT GGC GCA CGC CGC TG-3′(美国GIBCO BRL公司合成)；脂质体Lipofectin(美国GIBCO BRL公司产品)；兔抗人bcl-2多克隆抗体(Santa Cruz公司产品)，工作浓度1∶50(用0.5% Saponin配制)；异硫氰酸胍(FITC)标记的羊抗兔IgG(S C公司产品)，工作浓度1∶50(用0.5% Saponin配制)；引物(美国GIBCO BRL公司产品)：
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bcl-2 mRNA(385bp) Forward 5′-ACT TGT GGC CCA GAT AGG CAC CCA G-3′
Reverse 5′-GCA CTT CGC CGA GAT GTC CAG CCA CCA G-3′
β-actin mRNA(154bp) Forward 5′-TCA TCA CCA TTG GCA ATG AG-3′
Reverse 5′-GTG TTG GCG TAC AGG 5-3′
TRIzol总RNA提取试剂(美国GIBCO BRL公司产品)；RT-PCR试剂盒(德国Boehringer Mannheim公司产品)。
1.2 细胞来源
, http://www.100md.com 人颊癌细胞系BcaCD885由华西医科大学口腔医学院提供
1.3 实验方法
1.3.1 细胞转染[1] ODN的终浓度为20μmol/L，对照组以等体积三蒸水代替ODN
BcaCD885颊癌细胞解冻复苏，取处于对数生长期的细胞，按1×106/ml细胞转种于60mm培养皿中，使细胞达60%～80%的融合。配制溶液A:加40μl ODN(10-3 μmol/μl)至360μl无血清培养基中，溶液B：加240μl Lipofectin(1mg/ml)至160μl无血清培养基中，合并溶液A和溶液B，轻轻混匀，室温放置15min；弃细胞培养液，用无血清培养基洗涤细胞两次，加1.2ml无血清培养基至Lipofectin-ODN混合物中(ODN的终浓度为20μmol/L)，混匀后，小心滴加于细胞上，轻轻混匀。37°C、5% CO2孵箱培养12h；弃转染液，加含10%小牛血清完全培养基继续培养24h、36h和48h。
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1.3.2 FCM-蛋白质表达测定 收获细胞，吹打制成悬液(1×106细胞/ml)，3%多聚甲醛4°C固定过夜，一抗50μl重悬细胞，4°C反应30min，加50μl FITC标记的二抗，4°C避光反应30min，洗涤后，流式细胞仪检测。以0.5% Saponin代替一抗作为阴性对照。
1.3.3 RT-PCR[2] TRL zol试剂一步法提取细胞总RNA，取5μl作琼脂糖凝胶电泳证明成功。RT-PCR按试剂盒说明并略加改动进行，以β-actin为内参，逆转录后，同时行目的基因和β-actin cDNA扩增。反应体系为50μl，包括RT-PCR缓冲液1.5μmol/L MgCl2，1μl酶混合液，0.2mmol/L dNTP(each)5mmol/L DTT,5U RNase抑制剂，0.6μmol/L引物(each)，模板RAN 0.5～1μg。50°C逆转录30min后行PCR循环：94°C预变性6min，94°C变性45s，62°C退火30s，68°C延伸2min。10s循环以后，每一次循环延伸时间增加10s，再进行25次循环，68°C下充分延伸10min。取10μl RT-PCR产物行1.8%琼脂糖凝胶电泳(含0.5 μg/ml EB)，成像系统紫外成像，密度扫描，分析特异性扩增条带的各强度值。Bcl-2 mRNA相对量=bcl-2带强度值/β-actin带强度值。
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1.4 统计学分析处理
组间差异分析采用t检验。
2 结果
2.1 FCM检测bcl-2蛋白表达变化
20μmol/L反义ODN作用BcaCD885 24h后，与对照组相比，bcl-2蛋白表达水平明显下降(P<0.05),36h时，下降更明显(P<0.05)，48h时仍明显低于对照组(P<0.05)。而正义bcl-2 ODN作用组，24h、36h、48h时其bcl-2表达水平均与对照组无明显差异(P>0.05)。表明20μmol/L的反义bcl-2 ODN能明显抑制颊癌细胞内源性bcl-2蛋白表达(图1，表1)。
2.2 RT-PCR检测bcl- mRNA表达变化
以β-actin为内参，20μmol/L反义、正义ODN作用BcaCD885后24h，RT-PCR圹增密度扫描，bcl-2 mRNA相对量分别与对照组在统计学上均无明显差异(P>0.05)(图2，表2)。
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表1 ODN作用后BcaCD885细胞bcl-2蛋白表达的荧光强度(
±s)(n=4)
对照
正义ODN
反义ODN
24h
36h
48h
24h
36h
48h
bcl-2
, 百拇医药
1.4600
±0.247
1.4050
±0.142
1.2725
±0.113
1.4125
±0.170
0.7350
±0.082*
0.7125
±0.068*
, 百拇医药
1.0500
±0.129*
*与对照组相比P<0.05表2 ODN作用BcaCD885后24h bcl-2 mRNA相对量(±s)(n=4) 组别
bcl-2 mRNA相对量
P*
对照组
1.0073±0.170
正义ODN
0.9810±0.091
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0.767
反义ODN
1.0546±0.212
0.788
*与对照组相比P>0.05
图1 ODN作用后BcaCD885细胞内bcl-2蛋白FCM荧光强度峰
A、B、C、D、E、F、G分别为对照组、正义ODN 24h、正义ODN 36h、正义ODN 48h、反义ODN 24h、反义ODN 36h、反义ODN 48h组。
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图2 BcaCD885细胞RT-PCR产物电泳图谱
3 讨论
癌基因的过表达是肿瘤发生、发展的一个重要的分子病理机制和标志，正常细胞的恶性转化，恶性细胞特性和其对患者的影响，与癌基因表达有着密切的关系。在转录过程中，每一个基因产生相当数量的mRNA，而后者又翻译成大量的蛋白质分子。因此抑制基因表达此抑制蛋白质产物更有效。本实验发现，将针对bcl-2 mRNA翻译起始部位的反义ODN作用于BcaCD885细胞后，能有效抑制细胞内bcl-2蛋白的表达。20μM反义bcl-2 ODN作用24h后，bcl-2蛋白表达下降至0.7350，36h后降低更为明显，与对照组间存明显差异(P<0.05)。而20μmol/L正义ODN对bcl-2表达无明显抑制作用，与对照组间不存在差异(P>0.05)。以上结果表明，20μmol/L反义bcl-2 ODN能明显抑制BcaCD885细胞bcl-2内源性蛋白的表达。
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在人体基因中约有3×109碱基对，在统计学意义上，一个17个碱基的寡核苷酸碱基序列只在人体基因中出现一次，因而具有此长度或比之更长的反义寡核苷酸具有极高的特异性，能特异抑制专一靶基因，是在体外细胞培养中研究某一基因功能的良好手段。另外它还具有在真核细胞中的内源性的优点。其抑制特定基因表达的机理可能有以下途径：① 抑制转录过程，如通过嘌呤链和另一DNA的嘧啶链形成三链；或与由RNA聚合酶产生的开环区域杂交，以及与未成熟的RNA杂交；② 抑制剪接过程，如与内含子-外显子结合部杂交；③ 抑制mRNA从细胞核向细胞质的运输；④ 抑制mRNA的翻译过程，如与启动子结合，抑制核糖体在起始密码区的组装，以及抑制核糖体沿mRNA密码序列的移动。另外，其它细胞过程如PolyA形成、剪接中SnRNA与pre mRNA的相互作用等都能被反义寡核苷酸所抑制[3～5]。本文以RT-PCR技术检测bcl-2 mRNA的相对表达量，发现20μmol/L反义bcl-2 ODN作用后24h，bcl-2 mRNA表达量与对照组无明显差异，说明反义bcl-2 ODN是翻译水平抑制了bcl-2蛋白的表达。即通过与bcl-2 mRNA的翻译起始区序列互补，特异地抑制了bcl-2蛋白的合成。
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任何形式的治疗药物都需要有满意的生物利用度。因而，反义寡核苷酸的活性与其能否到达作用部位密切相关。细胞中蛋白质的生物合成处于细胞质中，在细胞核中DNA转录产生的mRNA在细胞质的核糖体上翻译成相应的蛋白质。为使反义寡核苷酸发挥作用并通过杂交阻断翻译，它们必须通过细胞质膜进入细胞内部。细胞质膜对许多大分子和带负电荷的分子是一道天然屏障。因此，在反义寡核苷酸的概念上，可以认为细胞质膜是一个瓶颈[3]。本实验中，我们以阳离子脂质体Lepofectin为载体，介导反义bcl-2 ODN的转染，获得了满意效果。阳离子脂质体能通过静电与DNA或ODN相互作用，阳离子脂质体再与生物膜表面的负电荷相互作用增加细胞摄入，从而提高转染效果。另外，其还可抵御核酸酶的作用，延缓基因降解[6]。
以上结果为进一步研究bcl-2与BcaCD885细胞凋亡的关系奠定了基础。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670788) 云南省自然科学基金资项目(1999C0007R)
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作者简介： 何永文(1971-)，男，云南，讲师.博士.
参考文献：
[1] 何永文，毛祖彝.高温诱导颊癌细胞凋亡及阻断内源性bcl-2表达提高热敏感性的研究[D].华西医科大学博士学位论文，1999.
[2] 姜泊，张亚历，周殿元.分子生物学常用实验方法[M].北京：人民军医出版社，1996.
[3] 张礼等.以核酸为作用靶的药物研究[M].北京：科学出版社，1996；P224.
[4] Reed JC，Stain C，Subasinghe C，et al. Antisense mediated inhibition of bcl-2 protooncogene expression and leukemic cell growth and survival: Compresion of phosphodiester and phosphorothioate oligodeoxynucleotids[J]. Cancer Res. 1990;50:6567-6570.
[5] Helene C & Toulme JJ. Specific regulation of gene expression by antisense，sense and antigene nucletic acids[J]. Biochim Biophys Acta,1990;1049:99-125.
[6] 张灵芝.脂质体制备及其在生物医学中的应用[M].北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1998.5,收稿日期：2000-03-22, 百拇医药
单位：何永文(昆明医学院第一附属医院口腔颌面外科650031)；毛租彝(华西医科大学口腔医学院)；高志(华西医科大学口腔医学院)；王升志(汕头大学医学院第一附属医院)；赵德萍(云南省肿瘤研究所)
关键词：反义寡脱氧核苷酸； BcaCD885细胞； bcl-2基因
口腔颌面外科杂志000317 摘 要：目的 探讨与bcl-2翻译起始部位碱基互补的反义bcl-2寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotide,ODN)对Bca-CD885细胞内源性bcl-2表达的阻断作用。方法 以脂质体Lepofectin为载体，一过性转染20μmol/L反义及正义bcl-2 ODN于BcaCD885细胞中，FCM-抗体观测转染后24h、36h、48h细胞内bcl-2基因蛋白表达变化，RT-PCR技术检测转染后24h bcl-2 mRNA的表达变化。结果 转染反义bcl-2 ODN后24h、36h、48h BcaCD885细胞内bcl-2基因蛋白表达与对照组相比都明显下降(P<0.05)，而正义组与对照组无差异(P>0.05)；正反义组bcl-2 mRNA与对照组相比无明显变化(P>0.05)。结论 反义bcl-2 ODN能在蛋白翻译水平特异性抑制颊癌细胞内源性bcl-2蛋白表达。
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中图分类号：R739.8 文献标识码：A 文章编号：1005-4979(2000)03-0243-04
INHIBITION OF THE EXPRESSION OF INTRINSICAL BCL-2
PROTEIN BY ANTISENSE OLIGODEOXYNUCLEOTIDES IN BcaCD885 CELLS
HE Yong-wen，WANG Sheng-zi，ZHAO De-ping，et al.
(Stomatological Department，KunmingMedical College)
Abstract：Objective To study the function of antisense oligodeoxyncleotides which complements to translation-initiation site of human bcl-2 mRNA in inhibition of the expression of intrinsical bcl-2 protein in BcaCD885 cells. Method Through lepofectin vector，we transfected 20 μm sense (5′-GGG AAG GAT GGC GCA CGC TG-3′) or antisense (5′-CAG CGT GCG CCA TCC TTC CC-3′) bcl-2 oligodeoxynucleotids into human BcaCD885 cells in 12 hours with 37°C and 5% CO2 conditions. At 24 h，36 h and 48 h after transfection，we studied the expession of bcl-2 protein with bcl-2 polyclonal antibody by flow cytometry analysi (FCM). At 24 h after transfection，we studied the expression of bcl-2 mRNA through reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) technique. Total RNA was extracted from cell sample with TRIzol kit. Primer pairs used fr PCR are: bcl-2 mRNA (385 bp) Forward 5′-ACT TGT GGC CCA GAT AGG CAC CCA G-3′，Reverse 5′-GCA CTT CGC CGA GAT GTC CAG CCA G-3′; β-actin mRNA ((154bp) Forward 5′-TCA TCA CCA TTG GCA ATG AG-3′，Reverse 5′-GTG TTG GCG TAC AGG T-3′. PCR samples were run through 1.8% agarose gel and specific amplified lines were analysised with UVP GDS-800 system. Bcl-2 mRNA quantity was the ratio of bcl-2 line density to β-actin line density. Results At 24 h，36 h and 48 h after transfection of antisense bcl-2 oligodeoxynucleotids，there was down-regulation of bcl-2 protein in BcaCD885 cells. But the expression of bcl-2 protein did not change after transfection of sense bcl-2 oligo deoxynucleotids. The expression of bcl-2 mRNA was the same in the antisense or sense group with the control group. Conclusion Antisense bcl-2 oligodeoxynucleotids can inhibite intrinsical bcl-2 protein expression in BcaCD885 cells.
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Key words：Antisense oligodeoxynucleotide； BcaCD885 cells； Bcl-2 gene
在细胞中基因的表达通常是由结合蛋白、抑制剂及激动剂所调控的。直到最近才确认调节RNA序列可作为基因表达的直接抑制剂。我们以往的研究证明BcaCD885颊癌细胞中存在bcl-2表达，且其表达水平与热诱导细胞凋亡存在负相关关系[1]。鉴于此，我们以BcaCD885细胞为靶细胞，观察与bcl-2翻译起始部位碱基互补的反义bcl-2寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotide，ODN)对细胞内源性bcl-2表达的阻断作用。
1 材料与方法
1.1 主要仪器设备及试剂
Elite ESP型流式细胞仪(美国Coulter公司)；UV GDS-800凝胶成像分析系统；PCR扩增仪(Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler);反义bcl-2 ODN：5′-CAG CGT GCG CCA TCC TTC CC-3′，正义bcl-2 ODN; 5′-GGG AAG GAT GGC GCA CGC CGC TG-3′(美国GIBCO BRL公司合成)；脂质体Lipofectin(美国GIBCO BRL公司产品)；兔抗人bcl-2多克隆抗体(Santa Cruz公司产品)，工作浓度1∶50(用0.5% Saponin配制)；异硫氰酸胍(FITC)标记的羊抗兔IgG(S C公司产品)，工作浓度1∶50(用0.5% Saponin配制)；引物(美国GIBCO BRL公司产品)：
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bcl-2 mRNA(385bp) Forward 5′-ACT TGT GGC CCA GAT AGG CAC CCA G-3′
Reverse 5′-GCA CTT CGC CGA GAT GTC CAG CCA CCA G-3′
β-actin mRNA(154bp) Forward 5′-TCA TCA CCA TTG GCA ATG AG-3′
Reverse 5′-GTG TTG GCG TAC AGG 5-3′
TRIzol总RNA提取试剂(美国GIBCO BRL公司产品)；RT-PCR试剂盒(德国Boehringer Mannheim公司产品)。
1.2 细胞来源
, http://www.100md.com 人颊癌细胞系BcaCD885由华西医科大学口腔医学院提供
1.3 实验方法
1.3.1 细胞转染[1] ODN的终浓度为20μmol/L，对照组以等体积三蒸水代替ODN
BcaCD885颊癌细胞解冻复苏，取处于对数生长期的细胞，按1×106/ml细胞转种于60mm培养皿中，使细胞达60%～80%的融合。配制溶液A:加40μl ODN(10-3 μmol/μl)至360μl无血清培养基中，溶液B：加240μl Lipofectin(1mg/ml)至160μl无血清培养基中，合并溶液A和溶液B，轻轻混匀，室温放置15min；弃细胞培养液，用无血清培养基洗涤细胞两次，加1.2ml无血清培养基至Lipofectin-ODN混合物中(ODN的终浓度为20μmol/L)，混匀后，小心滴加于细胞上，轻轻混匀。37°C、5% CO2孵箱培养12h；弃转染液，加含10%小牛血清完全培养基继续培养24h、36h和48h。
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1.3.2 FCM-蛋白质表达测定 收获细胞，吹打制成悬液(1×106细胞/ml)，3%多聚甲醛4°C固定过夜，一抗50μl重悬细胞，4°C反应30min，加50μl FITC标记的二抗，4°C避光反应30min，洗涤后，流式细胞仪检测。以0.5% Saponin代替一抗作为阴性对照。
1.3.3 RT-PCR[2] TRL zol试剂一步法提取细胞总RNA，取5μl作琼脂糖凝胶电泳证明成功。RT-PCR按试剂盒说明并略加改动进行，以β-actin为内参，逆转录后，同时行目的基因和β-actin cDNA扩增。反应体系为50μl，包括RT-PCR缓冲液1.5μmol/L MgCl2，1μl酶混合液，0.2mmol/L dNTP(each)5mmol/L DTT,5U RNase抑制剂，0.6μmol/L引物(each)，模板RAN 0.5～1μg。50°C逆转录30min后行PCR循环：94°C预变性6min，94°C变性45s，62°C退火30s，68°C延伸2min。10s循环以后，每一次循环延伸时间增加10s，再进行25次循环，68°C下充分延伸10min。取10μl RT-PCR产物行1.8%琼脂糖凝胶电泳(含0.5 μg/ml EB)，成像系统紫外成像，密度扫描，分析特异性扩增条带的各强度值。Bcl-2 mRNA相对量=bcl-2带强度值/β-actin带强度值。
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1.4 统计学分析处理
组间差异分析采用t检验。
2 结果
2.1 FCM检测bcl-2蛋白表达变化
20μmol/L反义ODN作用BcaCD885 24h后，与对照组相比，bcl-2蛋白表达水平明显下降(P<0.05),36h时，下降更明显(P<0.05)，48h时仍明显低于对照组(P<0.05)。而正义bcl-2 ODN作用组，24h、36h、48h时其bcl-2表达水平均与对照组无明显差异(P>0.05)。表明20μmol/L的反义bcl-2 ODN能明显抑制颊癌细胞内源性bcl-2蛋白表达(图1，表1)。
2.2 RT-PCR检测bcl- mRNA表达变化
以β-actin为内参，20μmol/L反义、正义ODN作用BcaCD885后24h，RT-PCR圹增密度扫描，bcl-2 mRNA相对量分别与对照组在统计学上均无明显差异(P>0.05)(图2，表2)。
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表1 ODN作用后BcaCD885细胞bcl-2蛋白表达的荧光强度(
±s)(n=4)对照
正义ODN
反义ODN
24h
36h
48h
24h
36h
48h
bcl-2
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1.4600
±0.247
1.4050
±0.142
1.2725
±0.113
1.4125
±0.170
0.7350
±0.082*
0.7125
±0.068*
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1.0500
±0.129*
*与对照组相比P<0.05表2 ODN作用BcaCD885后24h bcl-2 mRNA相对量(
±s)(n=4) 组别bcl-2 mRNA相对量
P*
对照组
1.0073±0.170
正义ODN
0.9810±0.091
, 百拇医药
0.767
反义ODN
1.0546±0.212
0.788
*与对照组相比P>0.05
图1 ODN作用后BcaCD885细胞内bcl-2蛋白FCM荧光强度峰
A、B、C、D、E、F、G分别为对照组、正义ODN 24h、正义ODN 36h、正义ODN 48h、反义ODN 24h、反义ODN 36h、反义ODN 48h组。
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图2 BcaCD885细胞RT-PCR产物电泳图谱
3 讨论
癌基因的过表达是肿瘤发生、发展的一个重要的分子病理机制和标志，正常细胞的恶性转化，恶性细胞特性和其对患者的影响，与癌基因表达有着密切的关系。在转录过程中，每一个基因产生相当数量的mRNA，而后者又翻译成大量的蛋白质分子。因此抑制基因表达此抑制蛋白质产物更有效。本实验发现，将针对bcl-2 mRNA翻译起始部位的反义ODN作用于BcaCD885细胞后，能有效抑制细胞内bcl-2蛋白的表达。20μM反义bcl-2 ODN作用24h后，bcl-2蛋白表达下降至0.7350，36h后降低更为明显，与对照组间存明显差异(P<0.05)。而20μmol/L正义ODN对bcl-2表达无明显抑制作用，与对照组间不存在差异(P>0.05)。以上结果表明，20μmol/L反义bcl-2 ODN能明显抑制BcaCD885细胞bcl-2内源性蛋白的表达。
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在人体基因中约有3×109碱基对，在统计学意义上，一个17个碱基的寡核苷酸碱基序列只在人体基因中出现一次，因而具有此长度或比之更长的反义寡核苷酸具有极高的特异性，能特异抑制专一靶基因，是在体外细胞培养中研究某一基因功能的良好手段。另外它还具有在真核细胞中的内源性的优点。其抑制特定基因表达的机理可能有以下途径：① 抑制转录过程，如通过嘌呤链和另一DNA的嘧啶链形成三链；或与由RNA聚合酶产生的开环区域杂交，以及与未成熟的RNA杂交；② 抑制剪接过程，如与内含子-外显子结合部杂交；③ 抑制mRNA从细胞核向细胞质的运输；④ 抑制mRNA的翻译过程，如与启动子结合，抑制核糖体在起始密码区的组装，以及抑制核糖体沿mRNA密码序列的移动。另外，其它细胞过程如PolyA形成、剪接中SnRNA与pre mRNA的相互作用等都能被反义寡核苷酸所抑制[3～5]。本文以RT-PCR技术检测bcl-2 mRNA的相对表达量，发现20μmol/L反义bcl-2 ODN作用后24h，bcl-2 mRNA表达量与对照组无明显差异，说明反义bcl-2 ODN是翻译水平抑制了bcl-2蛋白的表达。即通过与bcl-2 mRNA的翻译起始区序列互补，特异地抑制了bcl-2蛋白的合成。
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任何形式的治疗药物都需要有满意的生物利用度。因而，反义寡核苷酸的活性与其能否到达作用部位密切相关。细胞中蛋白质的生物合成处于细胞质中，在细胞核中DNA转录产生的mRNA在细胞质的核糖体上翻译成相应的蛋白质。为使反义寡核苷酸发挥作用并通过杂交阻断翻译，它们必须通过细胞质膜进入细胞内部。细胞质膜对许多大分子和带负电荷的分子是一道天然屏障。因此，在反义寡核苷酸的概念上，可以认为细胞质膜是一个瓶颈[3]。本实验中，我们以阳离子脂质体Lepofectin为载体，介导反义bcl-2 ODN的转染，获得了满意效果。阳离子脂质体能通过静电与DNA或ODN相互作用，阳离子脂质体再与生物膜表面的负电荷相互作用增加细胞摄入，从而提高转染效果。另外，其还可抵御核酸酶的作用，延缓基因降解[6]。
以上结果为进一步研究bcl-2与BcaCD885细胞凋亡的关系奠定了基础。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670788) 云南省自然科学基金资项目(1999C0007R)
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作者简介： 何永文(1971-)，男，云南，讲师.博士.
参考文献：
[1] 何永文，毛祖彝.高温诱导颊癌细胞凋亡及阻断内源性bcl-2表达提高热敏感性的研究[D].华西医科大学博士学位论文，1999.
[2] 姜泊，张亚历，周殿元.分子生物学常用实验方法[M].北京：人民军医出版社，1996.
[3] 张礼等.以核酸为作用靶的药物研究[M].北京：科学出版社，1996；P224.
[4] Reed JC，Stain C，Subasinghe C，et al. Antisense mediated inhibition of bcl-2 protooncogene expression and leukemic cell growth and survival: Compresion of phosphodiester and phosphorothioate oligodeoxynucleotids[J]. Cancer Res. 1990;50:6567-6570.
[5] Helene C & Toulme JJ. Specific regulation of gene expression by antisense，sense and antigene nucletic acids[J]. Biochim Biophys Acta,1990;1049:99-125.
[6] 张灵芝.脂质体制备及其在生物医学中的应用[M].北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1998.5,收稿日期：2000-03-22, 百拇医药